JP2003202332A

JP2003202332A - 高速液体クロマトグラフ

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Publication number: JP2003202332A
Application number: JP2002001019A
Authority: JP
Inventors: Masayuki Nishimura; 雅之西村
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2002-01-08
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2003-07-18
Anticipated expiration: 2022-01-08
Also published as: JP3829718B2

Abstract

(57)【要約】【課題】分離性能の低下をもたらすことなく、前処理
や多次元分離の自動化を可能とするＨＰＬＣ装置を提供
する。【解決手段】流路切替バルブ１０において、インレッ
ト２３とインレット３３およびアウトレット２６とアウ
トレット３６が接続され、オートサンプラ９から注入さ
れた試料は、移動相１に乗ってトラップカラム１１に搬
送される。次に、インレット２３とインレット３４およ
びアウトレット２６とアウトレット３７が接続され、ト
ラップカラム１１には、目的成分精製用の移動相２が流
れ、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出される。
その後、インレット２３とインレット３５およびアウト
レット２６とアウトレット３８が接続され、トラップカ
ラム１１中の目的成分が分析用の移動相３、４の混合液
により分離カラム１２に導入され分離が行われた後、検
出器１３で検出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する分野】本発明は、液体中に含まれる成分
の分離分析を行う高速液体クロマトグラフ（以下、ＨＰ
ＬＣ装置と呼ぶ）に関する。さらに詳しくは、複雑なマ
トリックスを有する試料に含まれる特定の目的成分の効
率的な分析を行う高速液体クロマトグラフに関する。

【０００２】

【従来の技術】製薬やライフサイエンス業界においては
病気の予防や治療を目的として、特定の病気に作用する
化合物の探索、病気のメカニズムを解明するための生体
内での反応の研究、将来的に病気を引き起こす可能性を
予測するために各人の体内に存在する遺伝子やタンパク
・ペプチドなどの同定や定量を行うといった様々な目的
で、複雑なマトリックスを有する試料に含まれる微量の
目的成分を高精度に測定する必要がある。こうした目的
に対応する分析方法のひとつとして高速液体クロマトグ
ラフィー（以下、ＨＰＬＣと呼ぶ）は非常に優れた特性
を有しているため広く使われている。

【０００３】ＨＰＬＣでは、移動相送液ポンプ・試料注
入装置・分離カラム・検出器を最小要件として備えたＨ
ＰＬＣ装置が使用される。多くの成分を含んだ複雑なマ
トリックスを有する試料中の微量目的成分の分析には、
近年急速に普及しつつある液体クロマトグラフ質量分析
計（以下、ＬＣ／ＭＳと呼ぶ）が極めて有効な分析装置
として多用されるようになってきたが、ＬＣ／ＭＳによ
る分析を行う際にも多くの場合、十分な感度や精度を確
保するために、目的成分のクリーンアップ、濃縮、溶媒
の脱塩、置換などの高度な前処理や、複数の分離モード
での分離を連続して行う多次元分離をあらかじめ行う必
要がある。

【０００４】分析のスループットの向上、高い精度の確
保、省力化などのためには、こうした処理を自動化する
ことが必須であるが、通常こうした工程の自動化には多
数の切替バルブを使用した複雑なシステムを必要として
いた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】多数の流路切替バルブ
を使用した自動化システムは、０．１ｍＬ／ｍｉｎ．以
上の比較的高い流量で使用する場合には、システムが複
雑化し価格が高くなるという欠点を有するものの、実用
的に使用することが可能であると考えられる。しかしな
がら最近、試料・移動相溶媒の低減に加えてＬＣ／ＭＳ
における感度の飛躍的な向上を目的とした分析サイズの
ミクロ化が急速に進みつつあり、０．０２ｍＬ／ｍｉ
ｎ．以下、場合によっては数μＬ／ｍｉｎ．から数百ｎ
Ｌ／ｍｉｎ．のごく低流量での使用が実用化されてい
る。このようなシステムにおいては、多数の流路切替バ
ルブの使用は流路のデッドボリュームを増加させ、各成
分の分離ピークに著しい広がりをもたらし、分離性能低
下の原因となる。このため、オンラインで行うことが可
能な前処理の内容や多次元分離の自動化が制限されてい
る。

【０００６】本発明は、上記問題を解決するためになさ
れたものであり、分離性能の低下をもたらすことなく、
高度な前処理や多次元分離の自動化を可能とするＨＰＬ
Ｃ装置を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記問題を解決するた
め、本発明の液体クロマトグラフは、少なくとも二組の
インレットとアウトレットの組み合わせを有し、少なく
とも四つの流路が接続可能であり、接続された少なくと
も四つの流路をこれらのインレットおよびアウトレット
に順次接続する構造を有する流路切替バルブを備えたも
のである。また、少なくとも三組のインレットとアウト
レットの組み合わせを有し、少なくとも六つの流路が接
続可能であり、接続された少なくとも六つの流路をこれ
らのインレットおよびアウトレットに順次接続する構造
を有する流路切替バルブを備え、少なくとも一組のイン
レットとアウトレットに前処理用の溶媒およびこの溶媒
を送液するポンプを備えた流路と、前処理用カラムに接
続される流路が接続された多次元液体クロマトグラフで
ある。

【０００８】少なくとも二組のインレットとアウトレッ
トの組み合わせを有した流路切替バルブの一組のインレ
ットとアウトレットには、移動相送液ポンプと試料注入
装置を備えた流路と、分離カラムに接続される流路が接
続され、他の一組のインレットとアウトレットには前処
理用の溶媒およびこの溶媒を送液するポンプを備えた流
路と、前処理用カラムに接続される流路が接続される。
これら二組のインレットおよびアウトレットを切替可能
とすることにより、一つの流路切替バルブのみで前処理
を自動化することが可能となる。これにより、デッドボ
リュームの増加はほとんどなく、分離性能の低下は起こ
らない。

【０００９】また、少なくとも三組のインレットとアウ
トレットの組み合わせを有した流路切替バルブの一組の
インレットとアウトレットには、移動相送液ポンプおよ
び試料注入装置および一次元目の分離カラムを備えた流
路と、ドレインが接続され、別の一組のインレットとア
ウトレットには前処理用の溶媒およびこの溶媒を送液す
るポンプを備えた流路と、前処理用カラムに接続される
流路が接続され、残りの一組のインレットとアウトレッ
トには移動相送液ポンプを備えた流路と、二次元目の分
離カラムを備えた流路が接続される。これら三組のイン
レットおよびアウトレットを切替可能とすることによ
り、一つの流路切替バルブのみで前処理を自動化可能と
した２次元液体クロマトグラフを構成することができ
る。これにより、複数の分離を並行して行うことがで
き、分離性能の低下なしに、スループットの向上も同時
に可能となる。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態を図を
参照しながら詳細に説明する。図１は、本発明の液体ク
ロマトグラフの一実施例の概略構成図であり、移動相
１、２、３、４と、送液用のポンプ５、６、７、８と、
オートサンプラ９と、流路切替バルブ１０と、トラップ
カラム１１と、分離カラム１２および検出器１３から構
成されている。流路切替バルブ１０は、回転可能なロー
ター２１（外側の円盤）と回転不可能なステータ３１
（内側の円盤）を有している。ローター２１はインレッ
ト２３とアウトレット２６を有し、インレット２３とア
ウトレット２６は対になっている。ステータ３１は３つ
のインレット３３、３４、３５と３つのアウトレット３
６、３７、３８を有しており、インレット３３とアウト
レット３６、インレット３４とアウトレット３７、イン
レット３５とアウトレット３８はそれぞれ対になってい
る。インレット２３およびアウトレット２６にはトラッ
プカラム１１が接続されている。インレット３３には試
料注入用の移動相１が接続され、インレット３４にはト
ラップカラム１１洗浄用の目的成分精製用の移動相２が
接続され、インレット３５には分析用の移動相３、４が
接続され、アウトレット３８には分離用カラム１２が接
続される。

【００１１】流路切替バルブ１０は、回転可能なロータ
ー２１と回転不可能なステータ３１を有し、ローター２
１を回転させることによりポジションを切替ることがで
きる。図２に回転可能なローター２１と回転不可能なス
テータ３１とのポジションを示す。図２のポジションＡ
で、インレット２３とインレット３３およびアウトレッ
ト２６とアウトレット３６が接続される。オートサンプ
ラ９から注入された試料は、ポンプ５により送り出され
る移動相１に乗ってインレット３３に接続されており、
インレット３３に接続されたインレット２３からトラッ
プカラム１１に搬送される。トラップカラム１１に試料
はトラップされる。次に、ローター２１を回転させ図２
のポジションＢに切替る。ポジションＢで、インレット
２３とインレット３４およびアウトレット２６とアウト
レット３７が接続される。インレット３４には移動相２
およびポンプ６が接続されており、トラップカラム１１
には、ポンプ６により送り出される目的成分精製用の移
動相２がインレット３４からインレット２３を通って流
れ、目的成分精製用の移動相２により洗浄され、目的成
分はトラップカラム１１に保持されたままの状態で、目
的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出され、アウトレ
ット２６を通ってアウトレット３７より排出される。そ
の後、ローター２１を回転させ図２のポジションＣに切
替、ポジションＣで、インレット２３とインレット３５
およびアウトレット２６とアウトレット３８が接続され
る。インレット３５には移動相３、４およびポンプ７、
８が接続されており、トラップカラム１１には、ポンプ
７、８により送り出された分析用の移動相３、４の混合
液がインレット３５からインレット２３を通って流れ、
トラップカラム１１中の目的成分は分離カラム１２に導
入され分離が行われた後、検出器１３で検出される。ト
ラップカラム１１中の目的成分が分離カラム１２に定量
的に導入された段階で、流路切替バルブ１０のポジショ
ンは図２のポジションＡと点対称の関係にあるポジショ
ンに戻り、ポジションＡで、インレット２３とアウトレ
ット３６およびアウトレット２６とインレット３３が接
続され、試料注入用の移動相１によりトラップカラム１
１を一定時間エージングした後、ローター２１を回転さ
せることにより再びポジションＡにもどり、以後同じ動
作が繰り返される。

【００１２】図３に流路切替バルブ１０の構造を示す。
ローター２１のインレット２３およびアウトレット２６
とステータ３１のインレット３３、３４、３５およびア
ウトレット３６、３７、３８はローター２１を回転させ
ることにより、配管３８により必要な組み合わせで接続
される。

【００１３】図２中ポジションＡにおいては、デッドボ
リュームはインレット２３とインレット３３を接続する
配管３８の容量と、アウトレット２６とアウトレット３
６を接続する配管３８の容量のみであり、カラム容量と
比較するとほとんど無視できる容量であり、分離性能の
低下は起こらない。同様に、ポジションＢにおいては、
デッドボリュームはインレット２３とインレット３４を
接続する配管３８の容量と、アウトレット２６とアウト
レット３７を接続する配管３８の容量のみであり、ポジ
ションＣにおいては、デッドボリュームはインレット２
３とインレット３５を接続する配管３８の容量と、アウ
トレット２６とアウトレット３８を接続する配管３８の
容量のみであり、いずれも無視し得る容量である。

【００１４】これにより、前処理操作の自動化と分離カ
ラム１２への接続を流路切替バルブ１０のみを用いるこ
とにより簡便かつ自動的に行うことが可能となり、デッ
ドボリュームの増加はほとんどなく、分離性能の低下は
起こらない。

【００１５】図４は、本発明の液体クロマトグラフの第
２の実施例の概略構成図であり、２次元ＨＰＬＣ装置へ
の応用である。移動相２、３、４と、送液用のポンプ
５、６、７、８と、オートサンプラ９と、流路切替バル
ブ１０と、トラップカラム１１および検出器１３から構
成されている部分は図１における第１の実施例と同様で
ある。また、流路切替バルブ１０の構造も図１における
第１の実施例と同様である。試料注入用の移動相には組
成の異なる移動相４１、４２、４３、４４が接続され、
１次元目の分離カラム４６と２次元目の分離カラム４７
から構成されている。

【００１６】タンパク質、ペプチドを分離するための２
次元ＨＰＬＣにおいて、検出器１３にＬＣ／ＭＳを使用
する場合、１次元目の分離カラム４６に陽イオン交換カ
ラム、２次元目の分離カラム４７に逆相カラムを用いる
ことが多く、通常陽イオン交換クロマトグラフィーでは
高塩濃度の移動相でｐＨを酸性から塩基性に段階的に切
替る。このために、試料注入用の移動相には組成の異な
る移動相４１、４２、４３、４４が接続されている。試
料中のタンパク質、ペプチドは、そのｐＨにおける電荷
に応じて、分離カラム４６から順次溶出するので、各分
画を２次元目の分離カラム４７に順次導入することによ
り高い分離能が得られる。

【００１７】流路切替バルブ１０の動作は第１の実施例
と同様であり、図２のポジションＡで、インレット２３
とインレット３３およびアウトレット２６とアウトレッ
ト３６が接続される。オートサンプラ９から注入された
試料は、ポンプ５により送り出される移動相４１に乗っ
て、分離カラム４６で分離された後、インレット３３に
接続されており、インレット３３に接続されたインレッ
ト２３からトラップカラム１１に搬送される。トラップ
カラム１１に試料はトラップされる。次に、ローター２
１を回転させ図２のポジションＢに切替る。ポジション
Ｂで、インレット２３とインレット３４およびアウトレ
ット２６とアウトレット３７が接続される。インレット
３４には移動相２およびポンプ６が接続されており、ト
ラップカラム１１には、ポンプ６により送り出される目
的成分精製用の移動相２がインレット３４を通ってイン
レット２３から流れ、目的成分精製用の移動相２により
洗浄され、目的成分はトラップカラム１１に保持された
ままの状態で、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い
出され、アウトレット２６を通ってアウトレット３７よ
り排出される。この場合の洗い出しは、移動相４１に含
まれる塩を脱塩することが主要な目的である。その後、
ローター２１を回転させ図２のポジションＣに切替、ポ
ジションＣで、インレット２３とインレット３５および
アウトレット２６とアウトレット３８が接続される。イ
ンレット３５には移動相３、４およびポンプ７、８が接
続されており、ポンプ７、８により送り出された分析用
の移動相３、４の混合液がインレット３５を通ってイン
レット２３からトラップカラム１１に導入され、トラッ
プカラム１１中の目的成分が２次元目の分離カラム４７
に導入され分離が行われた後、検出器１３で検出され
る。トラップカラム１１中の目的成分が分離カラム４７
に定量的に導入された段階で、ポジションＡにもどり、
ポンプ５には移動相４２が接続され、以後同じ動作が繰
り返される。

【００１８】第２の実施例においても、図２中ポジショ
ンＡにおいては、デッドボリュームはインレット２３と
インレット３３を接続する配管３８の容量と、アウトレ
ット２６とアウトレット３６を接続する配管３８の容量
のみであり、ポジションＢにおいては、デッドボリュー
ムはインレット２３とインレット３４を接続する配管３
８の容量と、アウトレット２６とアウトレット３７を接
続する配管３８の容量のみであり、ポジションＣにおい
ては、デッドボリュームはインレット２３とインレット
３５を接続する配管３８の容量と、アウトレット２６と
アウトレット３８を接続する配管３８の容量のみであ
り、いずれも無視し得る容量である。

【００１９】図５は、本発明の液体クロマトグラフの第
３の実施例の概略構成図であり、２次元ＨＰＬＣ装置へ
の応用である。移動相４１、４２、４３、４４、２、
３、４と、送液用のポンプ５、６、７、８と、オートサ
ンプラ９と、流路切替バルブ１０と、１次元目の分離カ
ラム４６と２次元目の分離カラム４７および検出器１３
から構成されている部分は図１における第１の実施例と
同様である。流路切替バルブ１０回転可能なローター２
１は４つのインレット５１、５２、５３、５４と４つの
アウトレット５５、５６、５７、５８を有し、インレッ
ト５１とアウトレット５５、インレット５２とアウトレ
ット５６、インレット５３とアウトレット５７、インレ
ット５４とアウトレット５８はそれぞれ対になってい
る。ステータ３１は第１および第２の実施例と同様の構
造を有している。本実施例においては、４つのトラップ
カラム６１、６２、６３、６４がそれぞれインレット５
１とアウトレット５５、インレット５２とアウトレット
５６、インレット５３とアウトレット５７、インレット
５４とアウトレット５８に接続されている。インレット
３３には試料注入用の移動相４１、４２、４３、４４が
接続され、インレット３４にはトラップカラム６１、６
２、６３、６４洗浄用の目的成分精製用の移動相２が接
続され、インレット３５には分析用の移動相３、４が接
続され、アウトレット３８には分析用カラム１２が接続
される。

【００２０】次に動作について説明する。まず、インレ
ット５１とインレット３３およびアウトレット５５とア
ウトレット３６が接続される。インレット３３には分離
カラム４６が接続されており、オートサンプラ９から注
入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相４
１に乗って、分離カラム４６で分離された後、インレッ
ト３３を通ってインレット５１からトラップカラム６１
に搬送される。トラップカラム６１に試料はトラップさ
れる。ポンプ５により送り出される移動相は、一定時間
ごとに移動相４１、４２、４３、４４と切替られる。ま
た、流路切替バルブ１０も一定時間ごとにポジションが
切替られ、ローター２１を回転させ、インレット５１と
インレット３４およびアウトレット５５とアウトレット
３７が接続される。インレット３４には移動相２および
ポンプ６が接続されており、トラップカラム６１には、
ポンプ６により送り出される目的成分精製用の移動相２
が流れ、目的成分精製用の移動相２により洗浄され、目
的成分はトラップカラム６１に保持されたままの状態
で、目的成分より保持の弱い夾雑成分が洗い出され、ア
ウトレット３７を通ってアウトレット５５より排出され
る。この場合の洗い出しも、移動相４１に含まれる塩を
脱塩することが主要な目的である。この時、同時にイン
レット５２とインレット３３およびアウトレット５６と
アウトレット３６が接続される。インレット３３には分
離カラム４６が接続されており、オートサンプラ９から
注入された試料は、ポンプ５により送り出される移動相
４１、４２、４３あるいは４４に乗って、インレット３
３からインレット５２を通って分離カラム４６に達し、
分離カラム４２で分離された後、トラップカラム６２に
搬送される。トラップカラム６２に試料はトラップされ
る。

【００２１】その後、ローター２１を回転させ、インレ
ット５１とインレット３５およびアウトレット５５とア
ウトレット３８が接続される。インレット３５には移動
相３、４およびポンプ７、８が接続されており、ポンプ
７、８により送り出された分析用の移動相３、４の混合
液がインレット３５を通ってインレット５１からトラッ
プカラム６１に導入され、トラップカラム６１中の目的
成分が移動相３、４の混合液により２次元目の分離カラ
ム４７に導入され分離が行われた後、検出器１３で検出
される。この時、同時にインレット５２とインレット３
４およびアウトレット５６とアウトレット３７が接続さ
れる。インレット３４には移動相２およびポンプ６が接
続されており、トラップカラム６２には、ポンプ６によ
り送り出される目的成分精製用の移動相２がインレット
３４を通ってインレット５１から流れ、目的成分精製用
の移動相２により洗浄され、目的成分はトラップカラム
６２に保持されたままの状態で、目的成分より保持の弱
い夾雑成分が洗い出され、アウトレット３７を通ってア
ウトレット５６より排出される。さらに同時にインレッ
ト５３とインレット３３およびアウトレット５７とアウ
トレット３６が接続される。インレット３３には分離カ
ラム４６が接続されており、オートサンプラ９から注入
された試料は、ポンプ５により送り出される移動相４
１、４２、４３あるいは４４に乗って、分離カラム４６
で分離された後、インレット３３を通ってインレット５
３からトラップカラム６３に搬送される。トラップカラ
ム６３に試料はトラップされる。以降、インレット３
３、３４、３５とインレット５１〜５４およびアウトレ
ット３６、３７、３８とアウトレット５５〜５８が順次
接続され、１次元目の分離カラム４６から溶出される各
分画成分がトラップカラム６１〜６４にトラップされ、
移動相２により洗浄・脱塩が行われ、移動相３、４によ
り２次元目の分離カラム４７により、分離・分析が行わ
れる。

【００２２】ここでは、１次元目の分離カラム４６から
の溶出成分のトラップ、精製・脱塩、２次元目の分離カ
ラム４７による分離・分析を並行して行うことができ
る。デッドボリュームは実施例１、２と同様に無視し得
る容量であり、分離性能の低下なしに、複数の分離を並
行して行うことができ、スループットの向上も同時に可
能となる。

【００２３】以上、本発明の実施例を説明したが、本発
明は上記実施例に限定されるものではなく、特許請求の
範囲に記載された本発明の要旨の範囲内で種々の変更を
行うことができる。例えば、第２および第３の実施例に
おいて、試料注入用の移動相には組成の異なる移動相４
１、４２、４３、４４を接続しているが、この数に制限
はない。第２に実施例において、トラップカラム１１に
よる目的成分の保持をより確実にするため、もう１流路
足してトラップカラムをもう一つ加え、一方のトラップ
カラムによるトラップの動作と、他方のトラップカラム
のエージング動作を同時に行える構造にしてもよい。ま
た、第３の実施例において、４つのトラップカラム６
１、６２、６３、６４を用いているが、この数に制限は
ない。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、１つの切替バルブのみ
で前処理カラム、分離カラム等の多数の流路の接続切替
を簡便かつ自動的に行うことを可能としたので、分離性
能の低下をもたらすことなく、高度な前処理や多次元分
離を自動化できる液体クロマトグラフを構築することが
でき、同時にスループットの向上も可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の液体クロマトグラフの一実施例の概略
構成図である。

【図２】流路切替バルブにおけるインレットとアウトレ
ットの位置関係を示した図である。

【図３】切替バルブの構造を示した図である。

【図４】本発明の液体クロマトグラフの第２の実施例の
概略構成図である。

【図５】本発明の液体クロマトグラフの第３の実施例の
概略構成図である。

【符号の説明】

１、２、３、４、４１、４２、４３、４４---移動相５、６、７、８---ポンプ９---オートサンプラ１０---流路切替バルブ１１---トラップカラム１２、４６、４７---分離カラム１３---検出器２１---ローター３１---ステータ３８---配管

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも二組のインレットとアウトレ
ットの組み合わせを有し、少なくとも四つの流路が接続
可能であり、接続された少なくとも四つの流路を前記イ
ンレットおよびアウトレットに順次接続する構造を有す
る流路切替バルブを備えたことを特徴とする高速液体ク
ロマトグラフ。
【請求項２】少なくとも三組のインレットとアウトレ
ットの組み合わせを有し、少なくとも六つの流路が接続
可能であり、接続された少なくとも六つの流路を前記イ
ンレットおよびアウトレットに順次接続する構造を有す
る流路切替バルブを備え、この流路切替バルブの少なく
とも一組の前記インレットおよびアウトレットに前処理
用の溶媒およびこの溶媒を送液するポンプを備えた流路
と、前処理用カラムに接続される流路を接続したことを
特徴とする多次元液体クロマトグラフ。