KR101574272B1 - 하트 컷 방법을 위한 이차원 액체 크로마토그래피 시스템 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이차원 액체 크로마토그래피 시스템에 관한 것으로, 역상 또는 정상 크로마토그래피 방법을 통한 독립적인 1차원 분리와, 매질 효과 제거를 위한 이차원 분리를 하나의 시스템 내에서 모두 수행 할 수 있는 이차원 액체 크로마토그래피 시스템에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이차원 액체 크로마토그래피 시스템에 관한 것으로, 역상 또는 정상 크로마토그래피 방법을 통한 독립적인 1차원 분리와, 매질 효과 제거를 위한 이차원 분리를 하나의 시스템 내에서 모두 수행 할 수 있는 이차원 액체 크로마토그래피 시스템에 관한 것이다.
액체 크로마토그래피는 이동상(용리액)과 고정상간의 상호 작용에 의해 시료속의 성분들을 분리하는 방법으로, 1회 시료 주입을 통해 여러 성분들을 동시에 측정할 수 있는 장점을 가지고 있다.
한편, 분석의 효율을 높이기 위한 한 가지 방법으로서는 이차원 분석(two dimensional analysis)이 있다.
온라인 다차원 크로마토그래피는 복잡한 샘플의 분석에 사용되어 왔다. 몇몇 경우에는 이러한 접근법을 컬럼 스위칭(column switching)이라고 칭한다. 컬럼 스위칭법에 따르면, 샘플 분석 크로마토그램을 처리 가능한 복수의 부분으로 나누어, 추가적으로 분석한다.
이차원 접근법의 경우에는 매트릭스 이온을 폐기물로 전환시킬 수 있는 한편, 관심 대상인 분석물을 제 2 컬럼으로 흘려보내어 추가적인 분리를 수행한다.
종래 문헌에는 각종 이차원 분리법에 대해 기재되어 있다. 예컨대, Steven R. Villasenor (Anal. Chem 63,(1991), 1362-1366)에는, 진통제 중의 설파이트를 분석하기 위해서 하트 컷(heart cut) 및 컬럼 스위칭 방법을 이용한 매트릭스 제거 기법에 대해 기재되어 있다.
이와 관련된 또 다른 기술로, 국내공개특허 제2009-0058287호(명칭 : 이중 온라인 초고압 이차원 액체 크로마토그래피 장치, 공개일 2009.06.09)에는 강양이온 교환 크로마토그래피와 역상 액체 크로마토그래피가 온라인으로 연결된 이차원 액체 크로마토그래피 장치를 사용하여 복잡한 생체 시료의 분석 효율을 최대화하고, 특히 휴지 시간(dead time)을 최소화시킨 이중 온라인 초고압 이차원 액체 크로마토그래피 장치가 개시된 바 있다.
상술한 바와 같이, 현재까지도 다차원 크로마토그래피에 대한 기술 개발이 이루어지고 있으나, 관심 물질만 선택적으로 분석하는데 있어 매질효과 제거 측면에서는 아직도 취약한 부분이 많다. 여기서 매질이란 임의의 시료에 포함된 특정한 물질을 분석하고자 할 때, 그 시료 속에 포함된 무수한 성분들 중 관심 물질 이외의 모든 물질들을 통칭하여 이르는 것으로 정의 되어질 수 있다. 이러한 매질은 특히 액체 크로마토그래피/질량분석 방법 (LC/MS)으로 시료 속의 물질을 분석 하고자 할 때 관심 성분과 동일한 용출시간을 가지는 경우 질량분석기의 감도에 영향을 미쳐 정확한 측정 결과를 얻는 것을 어렵게 만드는데, 이 때 이러한 현상을 매질효과라고 한다. 따라서 이와 관련된 매질효과 제거를 위한 지속적인 기술 개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 역상 또는 정상 크로마토그래피 방법을 통한 독립적인 1차원 분리와 매질 효과 제거를 위한 이차원 분리를 하나의 시스템 내에서 모두 수행 할 수 있는 크로마토그래피 시스템을 제공하는 것이다. 이러한 독립성은 특히 이차원 크로마토그래피 방법에서 매질 효과를 제거하기 위한 하트 컷 방식을 적용하는 경우 더욱 효율적이라 할 수 있는데, 제 1 컬럼에서 분리된 물질의 용출 시간에 대한 정확한 정보를 알 수 있기 때문에 관심 있는 물질을 제 2컬럼으로 재분리 하는데 있어서 분리의 정확도를 높일 수 있도록 하였다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 제 1 컬럼에서 분리된 관심 물질이 물 또는 유기 용매와 같은 용리액과 함께 용출되어 제 2 컬럼으로 포집되는 과정에서 용리액에 의해 포집의 안정성에 문제가 생길 수 있는데 이러한 문제를 해결하고자 희석에 의한 방법을 적용한 이차원 액체 크로마토그래피시스템을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 시료가 포집되는 동안, 시료의 유실 유무를 질량분석기를 통해 확인할 수 있도록, 제 2 컬럼을 통해 흐르는 모든 유체의 흐름을 유도할 수 있는 이차원 액체 크로마토그래피 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템은 정상 또는 역상 방식의 이차원 액체크로마토그래피 시스템(1)에 있어서, 제 1 이동상 펌프에 의해 흐르는 용리액에 의해 제 1 컬럼에서 분리된 물질들 중 관심 성분 및 이와 동일한 용출시간을 가지는 매질만을 선택적으로 제 2 컬럼에서 재분리 되도록 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)의 전환이 이루어지되, 상기 제 2 컬럼(600)에 도달한 관심 성분이, 제 1 스위칭 밸브(300)와 연결된 제 2 이동상 펌프(302)를 통해 공급된 희석용액에 의해 희석되어 포집된 후 또 다시 제 2 이동상 펌프로부터 공급되는 용리액에 의해 관심 성분과 매질이 분리되어 질량분석기(MS)에서 분석되도록 형성되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 이차원 액체 크로마토그래피 시스템은 주입된 시료 속 성분들을 1차적으로 분리하는 제 1 컬럼(200); 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 제 2 유입포트(310)를 통해 유입된 다음, 제 1 드레인 포트(301)를 통해 외부로 배출되거나, 제 2 배출포트(320)를 통해 배출되도록 조절하며, 제 2 이동상 펌프(302)와 연결되어 희석용액이 유입되는 이동상 유입포트(330) 및 배출되는 이동상 배출포트(340)를 포함하는 제 1 스위칭 밸브(300); 상기 제 2 배출포트(320)로 배출된 성분이 질량분석기(MS)로 직접 이동되도록 하거나, 제 3 배출포트(410)로 배출되도록 하는 제 2 스위칭 밸브(400); 상기 제 1 스위칭 밸브(300)의 이동상 배출포트(340)와 연결되는 제 1 포트(510)와, 상기 제 2 스위칭 밸브(400)의 제 3 배출포트(410)와 연결되는 제 2 포트(520)와, 제 1 포트(510) 및 제 2 포트(520)를 통해 유입된 유체가 혼합되어 유동되는 제 3 포트(530)를 포함하는 T형 연결관(500); 상기 제 3 포트(530)와 연결되며, 시료 속 일정 성분을 2차적으로 분리하며, 상기 분리된 성분이 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 상기 질량분석기(MS)로 이동되도록 상기 제 2 스위칭 밸브(400)와 연결된 제 2 컬럼(600); 을 포함하여 형성될 수 있다.
또한, 상기 제 1 스위칭 밸브(300)는 전환 동작을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)로 이동되도록 유로 전환이 이루어지도록 하되, 상기 제 2 이동상 펌프(302)로부터 공급된 희석용액이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐서 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)를 통해 유동되거나, 상기 이동상 배출포트(340)를 통해 직접 제 1 포트(510)와 연결될지 조절할 수 있다.
또한, 상기 제 2 스위칭 밸브(400)는 전환 동작을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분 중 일정 성분만 상기 제 2 컬럼(600)을 통과하도록 유로 전환이 이루어지도록 하되, 상기 제 2 이동상 펌프(302)로부터 공급된 희석용액이 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐서 상기 질량분석기(MS)까지 유동되거나, 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐 제 2 드레인 포트(401)를 통해 외부로 배출될지 조절할 수 있다.
또한, 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)을 이용한 이차원 액체 크로마토그래피 방법은, a) 주입된 시료가 상기 제 1 컬럼(200)에서 1차적으로 분리되어 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)를 순차적으로 거치며, 상기 질량분석기(MS)로 유입되는 제 1 단계(S100); b) 상기 제 1 단계(S100)를 통해 시료 속 성분들의 용출 시간을 파악하는 제 2 단계(S200); c) 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼으로부터 분리된 성분들 중 관심 성분 외 나머지 성분들이 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되도록 하는 제 3 단계(S300); d) 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼으로부터 분리된 성분들 중 관심 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400), T형 연결관(500) 및 제 2 컬럼(600)에 포집되는 제 4 단계(S400); 를 포함할 수 있다.
또한, 상기 이차원 액체 크로마토그래피 방법은 상기 제 4 단계(S400)에서, 상기 희석용액이 상기 이동상 배출포트(340)로 배출되어 상기 T형 연결관(500)의 제 1 포트(510)로 유입되고, 상기 제 2 포트(520)로 유입된 시료가 상기 희석용액과 혼합되어 일정 농도로 희석된 상태에서 상기 제 2 컬럼(600)에 도달할 수 있다.
또한, 상기 이차원 액체 크로마토그래피 방법은 상기 제 4 단계(S400)가 일정 시간동안 수행된 후, 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 물질들 중 관심의 대상이 아닌 것들은 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되고, 관심 물질은 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)로 유입된 다음, 상기 제 2 이동상 펌프(302)에서 공급 되는 희석용액과 함께 상기 제 2 컬럼(600)의 한 쪽 끝에 포집되며, 상기 제 2 이동상 펌프(302)에서 공급되는 용리액을 통해 관심 물질이 상기 제 2 컬럼(600)에서 분리 된 후 질량분석기(MS)로 유입되는 것을 특징으로 하는 제 5 단계(S500); 를 포함할 수 있다.
본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템은 역상 또는 정상 크로마토그래피 방법을 통한 독립적인 1차원 분리와 매질 효과 제거를 위한 이차원 분리를 하나의 시스템 내에서 모두 수행 할 수 있다는 장점이 있다.
다시 말해, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템은 제 1 컬럼에서 분리된 물질들 중 관심 있는 물질에 대하여 제 2 컬럼으로 재분리 할 수 있도록 구성되되, 제 1 컬럼에서 분리된 물질의 용출 시간에 대한 정확한 정보를 알 수 있기 때문에 관심 있는 물질을 제 2컬럼으로 포집하고 재분리 하는데 있어서 분리의 정확도를 높일 수 있다.
또한, 제 1 컬럼에서 분리된 관심 물질이 물 또는 유기 용매와 같은 용리액과 함께 용출되어 제 2 컬럼으로 포집되는 과정에서 용리액에 의해 포집의 안정성에 문제가 생길 수 있는데, 이를 해결하기 위해 본 발명에서는 관심 물질이 제 2 컬럼에서 안정적으로 포집되도록 희석시켜 제 1 이동상 펌프로부터 나온 용리액에 의한 효과가 최소화되고, 이 후 제 2 컬럼을 이용한 물질의 재분리를 통하여 제 1 컬럼에서 관심물질과 동일한 용출 시간을 가지는 매질을 제거함으로써, 물질 분석에 대한 효율성과 정확성을 향상시킬 수 있다.
아울러, 본 발명은 시료 속의 관심 물질이 포집되는 동안 제 2 컬럼을 통해 흐르는 모든 액체의 흐름을 질량분석기로 유도할 수 있어, 관심 물질의 유실 유무를 확인 하는 것이 가능하며, 이를 통해 포집조건의 최적화를 모색할 수 있어 시스템 전체의 제어가 용이하다
도 1은 본 발명에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 시스템을 나타낸 구성도.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 시스템을 나타낸 구성도.
도 3 내지 도 6은 도 2의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템에서 시료 분석이 이루어지는 과정을 단계별로 나타낸 시료 흐름도.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 시스템을 나타낸 구성도.
도 3 내지 도 6은 도 2의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템에서 시료 분석이 이루어지는 과정을 단계별로 나타낸 시료 흐름도.
이하, 상술한 바와 같은 본 발명에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 시스템을 첨부된 도면을 참조로 상세히 설명한다.
본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템은 역상 또는 정상 크로마토그래피 방법을 통한 독립적인 1차원 분리와 매질 효과 제거를 위한 이차원 분리를 하나의 시스템 내에서 모두 수행 할 수 있도록 형성되는 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)은 제 1 컬럼에서 분리된 물질들 중 관심 성분만 선택적으로 제 2 컬럼에서 재분리 되도록 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)의 전환이 이루어지되, 상기 제 2 컬럼(600)에 도달한 관심 성분이, 제 1 스위칭 밸브(300)와 연결된 제 2 이동상 펌프(302)를 통해 공급된 용리액에 의해 분리되어 질량분석기(MS)에서 분석되도록 형성되는 것을 특징으로 한다.
먼저, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)의 구성을 살펴보면, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)은 크게 제 1 컬럼(200), 제 1 스위칭 밸브(300), 제 2 스위칭 밸브(400), T형 연결관(500) 및 제 2 컬럼(600)을 포함하여 형성된다.
이때, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)은 상기 제 1 컬럼(200)에 시료를 주입하기 위한 수단으로 도 2에 도시된 바와 같이, 시료 유입밸브(100)와 제 1 이동상 펌프(미도시)가 연결될 수도 있다.
상기 제 1 이동상 펌프(미도시)는 상기 제 1 컬럼(200)으로의 시료주입과, 상기 제 1 컬럼(200)에서 물질이 분리될 수 있도록 용리액을 공급하는 역할을 한다.
상기 시료 유입밸브(100)는 용리액이 유입되는 제 1 유입포트(110)와, 제 1 연결포트(121) 및 제 2 연결포트(122)를 통해 용리액 및 시료가 배출되는 제 1 배출포트(130)를 포함하여 형성된다.
상기 시료 유입밸브(100)는 상기 제 1 연결포트(121)가 상기 제 2 연결포트(122) 및 제 3 연결포트(123)와 동시에 유체 연통되거나, 다르게는 상기 제 1 연결포트(121)가 제 1 유입포트(110) 및 제 1 연결포트(122)로 동시에 유체 연통 될 수 있다.
상기 제 2 연결포트(122)는 제 4 연결포트(124)와 유체 연통되거나, 다르게는 상기 제 2 연결포트(122)가 상기 제 1 배출포트(130)와 유체 연통될 수 있다.
상기 제 3 연결포트(123) 및 제 4 연결포트(124) 중 어느 한 포트를 통해 시료 주입이 이루어지는 과정에서 나머지 한 포트로 과량의 시료가 버려지게 된다.
이때, 상기 제 1 연결포트(121) 및 제 2 연결포트(122) 사이에 연결된 샘플루프에 시료가 채워지면 스위칭 되어, 제 1 유입포트(110) => 제 1 연결포트(121) => 제 2 연결포트(122) => 제 1 배출포트(130)를 거쳐 상기 제 1 컬럼(200)으로 시료가 이동되고, 그 다음 제 1 컬럼(200)에서 용리액에 의해 분리가 이루어지게 한다.
상기 제 1 컬럼(200)은 상기 시료 유입밸브(100)의 제 1 배출포트(130)와 연결되어 시료 속 성분들을 1차적으로 분리하게 된다.
상기 제 1 스위칭 밸브(300)는 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 제 2 유입포트(310)를 통해 유입된 다음, 제 1 드레인 포트(301)를 통해 외부로 배출되거나, 제 2 배출포트(320)를 통해 배출되도록 조절하며, 제 2 이동상 펌프(302)와 연결되어 희석용액이 유입되는 이동상 유입포트(330) 및 배출되는 이동상 배출포트(340)를 포함하여 형성된다.
상기 제 2 스위칭 밸브(400)는 상기 제 2 배출포트(320)로 배출된 성분이 질량분석기(MS)로 직접 이동되도록 하거나, 제 3 배출포트(410)로 배출되도록 조절하게 된다.
상기 T형 연결관(500)은 상기 제 1 스위칭 밸브(300)의 이동상 배출포트(340)와 연결되는 제 1 포트(510)와, 상기 제 2 스위칭 밸브(400)의 제 3 배출포트(410)와 연결되는 제 2 포트(520)와, 제 1 포트(510) 및 제 2 포트(520)를 통해 유입된 유체가 혼합되어 유동되는 제 3 포트(530)를 포함하여 형성되는 'T'자형 관이다.
상기 제 2 컬럼(600)은 상기 제 3 포트(530)와 연결되며, 시료 속 일정 성분을 2차적으로 분리하며, 분리된 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 상기 질량분석기(MS)로 이동되도록 상기 제 2 스위칭 밸브(400)와 연결된다.
특히, 상기 제 1 스위칭 밸브(300)는 전환 동작을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)로 이동되도록 유로 전환이 이루어지도록 하되, 상기 제 2 이동상 펌프(302)로부터 공급된 희석용액이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐서 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)를 통해 유동되거나, 상기 이동상 배출포트(340)를 통해 직접 제 1 포트(510)와 연결될지 조절할 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 상기 제 1 스위칭 밸브(300)는 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 상기 제 1 드레인 포트(301)를 통해 외부로 배출되도록 할 수도 있다.
아울러, 상기 제 2 스위칭 밸브(400)는 전환 동작을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분 중 일정 성분만 상기 제 2 컬럼(600)을 통과하도록 유로 전환이 이루어지도록 하되, 상기 제 2 이동상 펌프(302)로부터 공급된 희석용액이 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐서 상기 질량분석기(MS)까지 유동되거나, 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐 제 2 드레인 포트(401)를 통해 외부로 배출될지 조절할 수 있다.
상술한 바와 같은 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)을 이용한 이차원 액체 크로마토그래피 방법을 설명하면, 이차원 액체 크로마토그래피 방법은 a) 상기 시료 유입밸브(100)로부터 유입된 시료가 상기 제 1 컬럼(200)에서 1차적으로 분리되어 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)를 순차적으로 거치며, 상기 질량분석기(MS)로 유입되는 제 1 단계(S100); b) 상기 제 1 단계(S100)를 통해 시료 속 성분들의 용출 시간을 파악하는 제 2 단계(S200); c) 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 시료 유입밸브(100)로부터 유입된 시료 중 관심 성분 외 나머지 성분들이 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되도록 하는 제 3 단계(S300); d) 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 시료 유입밸브(100)로부터 유입된 시료 중 관심 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400), T형 연결관(500)을 거쳐 제 2 컬럼(600)에서 포집되는 제 4 단계(S400); 를 포함한다.
특히, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 방법은 상기 제 4 단계(S400)에서, 상기 희석용액이 상기 이동상 배출포트(340)로 배출되어 상기 T형 연결관(500)의 제 1 포트(510)로 유입되고, 상기 제 2 포트(520)로 유입된 시료가 일정 농도로 희석된 상태에서 상기 제 2 컬럼(600)에 도달하도록 하여, 상기 제 1 컬럼 (200)의 용출액이 상기 제 2 컬럼(600)에 영향을 미치지 않도록 함으로써, 상기 제 1 컬럼(200)에서 관심 물질과 동시에 용출된 매질을 제 2 컬럼(600)으로 분리할 때 동일한 시작점에서 분리가 이루어 질 수 있도록 하였다.
즉, 본 발명은 제 2 컬럼(600)에서 분리될 관심 물질 및 매질이 제 2 컬럼(600)의 분리 시작점에 포집될 때, 역상 크로마토그래피 방법의 경우는 유기 용매에 의해, 그리고 정상 크로마토그래피 방법의 경우는 물에 의해 한쪽으로 모이지 않고 퍼지게 되어 분리의 효율이 감소하는 것을 방지할 수 있도록 적합한 희석용액을 흘려주어 희석시켜 준다.
또한, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 방법은 상기 제 4 단계(S400)가 일정 시간동안 수행된 후, 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 용출되어 나온 불필요한 모든 물질들이 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되거나, 상기 제 1 이동상 펌프(302)에서 용리액의 흐름이 정지되고, 상기 희석용액이 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)로 유입된 다음, 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐 질량분석기(MS)로 유입되는 제 5 단계(S500); 를 더 포함할 수 있다.
설명의 편의를 위해, 이하에서는 3개의 성분이 검출되는 시료 중, 세 번째 성분에 대해 2차 분석을 하는 예를 기준으로 본 발명에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 방법을 설명하기로 한다.
먼저 도 3에 도시된 바와 같이, 상기 시료 유입밸브(100)의 제 1 유입포트(110)를 통해 유입된 시료는 상기 제 1 배출포트(130)를 통해 상기 제 1 컬럼(200)에서 1차적으로 분리된다.
그 다음, 분리된 시료는 상기 제 1 스위칭 밸브(300)의 제 2 유입포트(310)를 통해 유입된 다음 상기 제 2 배출포트(320)를 통해 상기 제 2 스위칭 밸브(400)로 이동되며, 이후 상기 질량분석기(MS)로 이동된다.(제 1 단계(S100))
이때, 상기 질량분석기(MS)에서는 상기 제 1 컬럼(200)을 통해 분리된 시료 속 성분들의 용출 시간이 파악될 수 있도록 분석이 이루어진다.(제 2 단계(S200))
다음, 새롭게 동일한 시료를 주입하여 제 1 컬럼(200)에서 시료속의 각 성분들을 분리한다. 이 때 상기에서 파악된 첫 번째 성분과 두 번째 성분이 용출되는 시간동안 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 첫 번째 성분과 두 번째 성분이 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되도록 한다.(제 3 단계(S300), 도 4 참조)
다음, 두 번째 성분이 용출되는 시간이 지나고 세 번째 성분이 용출되는 시간이 되면, 다시 상기 제 1 스위칭 밸브(300)를 전환시켜, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 세 번째 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브로 유입된 다음, 상기 제 3 배출포트(410)로 배출되도록 하고, 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)로 유입되도록 한다.
이때, 상기 제 1 스위칭 밸브(300)는 상기 제 2 이동상 펌프(302)와 연결된 희석용액이 상기 이동상 배출포트(340)를 통해 상기 제 1 포트(510)로 유입되도록 하고, 상기 제 2 포트(520)로 유입된 시료가 일정 농도로 희석된 상태에서 상기 제 2 컬럼(600)에 도달하도록 함으로써, 관심 성분인 세 번째 성분이 포집 되도록 한다.(제 4 단계(S400), 도 5 참조)
다음, 상기 제 4 단계(S400)가 일정 시간동안 수행된 후, 상기 제 1 스위칭 밸브(300)를 전환시켜, 상기 제 1 컬럼(200)에서 용출된 모든 물질들을 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되도록 하거나, 이동상의 흐름이 정지되도록 한다.
이때, 상기 제 2 이동상 펌프(302)에서 물질 분리를 위하여 나온 용출액은 상기 제 1 스위칭 밸브(300)의 이동상 유입포트(330)를 통해 유입된 다음 상기 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 제 3 배출포트(410)로 배출되며, 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)로 유입된 다음, 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐 질량분석기(MS)로 유입되도록 함으로써, 상기 제 4 단계(S400)에서 포집된 세 번째 성분 및 이와 동일한 용출시간을 가지는 매질이 상기 제 2 컬럼(600)에서 재분리 되도록 한다.(제 5단계(S500), 도 6 참조)
이에 따라, 본 발명의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)은 역상 또는 정상 크로마토그래피 방법을 통한 독립적인 1차원 분리와 매질 효과 제거를 위한 이차원 분리를 하나의 시스템 내에서 모두 수행 할 수 있도록 형성되며, 제 1 컬럼에서 분리된 물질들 중 관심 있는 물질에 대하여 제 2 컬럼에서 재분리 하되, 관심 물질이 제 2 컬럼에서 안정적으로 포집 되도록 희석시켜 유기 용매 또는 물에 의한 효과가 최소화된 상태에서, 관심 물질과 매질을 재분리 함으로써, 물질 분석에 대한 효율성과 정확성을 향상시킬 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 하트 컷 방식을 적용하는 경우, 제 1 컬럼에서 분리된 물질의 용출 시간에 대한 정확한 정보를 알 수 있기 때문에 관심 물질을 제 2컬럼으로 포집 및 재분리 하는 것에 대한 정확도를 높일 수 있다.
본 발명은 상기한 실시예에 한정되지 아니하며, 적용범위가 다양함은 물론이고, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이다.
1 : 이차원 액체 크로마토그래피 시스템
MS : 질량분석기
100 : 시료 유입밸브
110 : 제 1 유입포트
121 : 제 1 연결포트 122 : 제 2 연결포트
130 : 제 1 배출포트
200 : 제 1 컬럼
300 : 제 1 스위칭 밸브
301 : 제 1 드레인 포트 302 : 제 2 이동상 펌프
310 : 제 2 유입포트 320 : 제 2 배출포트
330 : 이동상 유입포트 340 : 이동상 배출포트
400 : 제 2 스위칭 밸브
401 : 제2드레인 포트
410 : 제 3 배출포트
500 : T형 연결관
510 : 제 1 포트 520 : 제 2 포트
530 : 제 3 포트
600 : 제 2 컬럼
S100~S500 : 본 발명에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 방법의 각 단계
MS : 질량분석기
100 : 시료 유입밸브
110 : 제 1 유입포트
121 : 제 1 연결포트 122 : 제 2 연결포트
130 : 제 1 배출포트
200 : 제 1 컬럼
300 : 제 1 스위칭 밸브
301 : 제 1 드레인 포트 302 : 제 2 이동상 펌프
310 : 제 2 유입포트 320 : 제 2 배출포트
330 : 이동상 유입포트 340 : 이동상 배출포트
400 : 제 2 스위칭 밸브
401 : 제2드레인 포트
410 : 제 3 배출포트
500 : T형 연결관
510 : 제 1 포트 520 : 제 2 포트
530 : 제 3 포트
600 : 제 2 컬럼
S100~S500 : 본 발명에 따른 이차원 액체 크로마토그래피 방법의 각 단계
Claims (7)
- 정상 또는 역상 방식의 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)에 있어서,
주입된 시료 속 성분들을 1차적으로 분리하는 제 1 컬럼(200);
상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 제 2 유입포트(310)를 통해 유입된 다음, 제 1 드레인 포트(301)를 통해 외부로 배출되거나, 제 2 배출포트(320)를 통해 배출되도록 조절하며, 제 2 이동상 펌프(302)와 연결되어 희석용액이 유입되는 이동상 유입포트(330) 및 배출되는 이동상 배출포트(340)를 포함하는 제 1 스위칭 밸브(300);
상기 제 2 배출포트(320)로 배출된 성분이 질량분석기(MS)로 직접 이동되도록 하거나, 제 3 배출포트(410)로 배출되도록 하는 제 2 스위칭 밸브(400);
상기 제 1 스위칭 밸브(300)의 이동상 배출포트(340)와 연결되는 제 1 포트(510)와, 상기 제 2 스위칭 밸브(400)의 제 3 배출포트(410)와 연결되는 제 2 포트(520)와, 제 1 포트(510) 및 제 2 포트(520)를 통해 유입된 유체가 혼합되어 유동되는 제 3 포트(530)를 포함하는 T형 연결관(500);
상기 제 3 포트(530)와 연결되며, 시료 속 일정 성분을 2차적으로 분리하며, 상기 분리된 성분이 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 상기 질량분석기(MS)로 이동되도록 상기 제 2 스위칭 밸브(400)와 연결된 제 2 컬럼(600);을 포함하여 형성되며,
상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 물질들 중 관심 성분만 선택적으로 상기 제 2 컬럼(600)에서 재분리 되도록 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)의 전환이 이루어지되,
상기 제 2 컬럼(600)에 도달한 관심 성분이, 상기 제 1 스위칭 밸브(300)와 연결된 상기 제 2 이동상 펌프(302)를 통해 공급된 희석용액에 의해 희석되어 질량분석기(MS)에서 분석되도록 형성되는 것을 특징으로 하는 이차원 액체 크로마토그래피 시스템.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,
상기 제 1 스위칭 밸브(300)는
전환 동작을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)로 이동되도록 유로 전환이 이루어지도록 하되,
상기 제 2 이동상 펌프(302)로부터 공급된 희석용액 또는 용리액이 상기 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐서 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)를 통해 유동되거나, 상기 이동상 배출포트(340)를 통해 직접 제 1 포트(510)와 연결될지 조절하는 것을 특징으로 하는 이차원 액체 크로마토그래피 시스템.
- 제 3항에 있어서,
상기 제 2 스위칭 밸브(400)는
전환 동작을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 성분 중 일정 성분만 상기 제 2 컬럼(600)을 통과하도록 유로 전환이 이루어지도록 하되,
상기 제 2 이동상 펌프(302)로부터 공급된 희석용액 또는 용리액이 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐서 상기 질량분석기(MS)까지 유동되거나, 상기 제 2 컬럼(600)을 거쳐 제 2 드레인 포트(401)를 통해 외부로 배출될지 조절하는 것을 특징으로 하는 이차원 액체 크로마토그래피 시스템.
- 제 1항, 3항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 의한 이차원 액체 크로마토그래피 시스템(1)을 이용한 이차원 액체 크로마토그래피 방법은,
a) 주입된 시료가 상기 제 1 컬럼(200)에서 1차적으로 분리되어 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)를 순차적으로 거치며, 상기 질량분석기(MS)로 유입되는 제 1 단계(S100);
b) 상기 제 1 단계(S100)를 통해 시료 속 성분들의 용출 시간을 파악하는 제 2 단계(S200);
c) 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)으로부터 분리된 성분들 중 관심 성분 외 나머지 성분들이 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되도록 하는 제 3 단계(S300);
d) 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)으로부터 분리된 성분들 중 관심 성분이 상기 제 2 스위칭 밸브(400), T형 연결관(500) 및 제 2 컬럼(600)에 포집되는 제 4 단계(S400); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 이차원 액체 크로마토그래피 방법.
- 제 5항에 있어서,
상기 이차원 액체 크로마토그래피 방법은
상기 제 4 단계(S400)에서, 상기 희석용액이 상기 이동상 배출포트(340)로 배출되어 상기 T형 연결관(500)의 제 1 포트(510)로 유입되고,
상기 제 2 포트(520)로 유입된 시료가 상기 희석용액과 혼합되어 일정 농도로 희석된 상태에서 상기 제 2 컬럼(600)에 도달하는 것을 특징으로 하는 이차원 액체 크로마토그래피 방법.
- 제 6항에 있어서,
상기 이차원 액체 크로마토그래피 방법은
상기 제 4 단계(S400)가 일정 시간동안 수행된 후,
상기 제 1 스위칭 밸브(300) 전환을 통해, 상기 제 1 컬럼(200)에서 분리된 물질들 중 관심의 대상이 아닌 것들은 상기 제 1 드레인 포트(301)로 배출되고, 관심 물질은 상기 제 1 스위칭 밸브(300) 및 제 2 스위칭 밸브(400)를 거쳐 상기 T형 연결관(500)의 제 2 포트(520)로 유입된 다음, 상기 제 2 이동상 펌프(302)에서 공급 되는 희석용액과 함께 상기 제 2 컬럼(600)의 한 쪽 끝에 포집 되며,
상기 제 2 이동상 펌프(302)에서 공급되는 용리액을 통해 관심 물질이 상기 제 2 컬럼(600)에서 분리 된 후, 질량분석기(MS)로 유입되는 것을 특징으로 하는 제 5 단계(S500); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 이차원 액체 크로마토그래피 방법.
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