KR101120943B1

KR101120943B1 - 다기능 선택밸브, 이를 포함하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 시료분석방법

Info

Publication number: KR101120943B1
Application number: KR1020110061855A
Authority: KR
Inventors: 이상원; 형석원; 이정화; 김경철; 문동기
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2012-03-05
Also published as: US9435771B2; KR20120000537A; US20120145617A1; WO2011162574A2; WO2011162574A3; CN102612648A; JP2013504756A; CN102612648B; JP5763644B2

Abstract

본 발명은 액체크로마토그래피 장치에 사용될 수 있는 다기능 선택밸브에 관한 것으로서, 다중포트를 포함하고, 상기 다중포트의 일부에 시료분리칼럼의 양단이 연결될 수 있는 다기능 선택밸브로서, 유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하지 않고 배출되는 유체통과모드; 유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 배출되는 칼럼통과모드; 및 유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드;를 포함하며, 이러한 다기능 선택밸브를 이용하면 유체의 이동경로를 변경시킴으로써 필요에 따라 온라인 소화기능, 1차원 분리기능 및 2차원 분리기능을 역상 액체크로마토그래피 장치에서 구현할 수 있다.

Description

다기능 선택밸브, 이를 포함하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 시료분석방법{MULTI-FUNCTIONAL SELECTION VALVE, MULTI-FUNCTIONAL AND FULLY AUTOMATED LIQUID CHROMATOGRAPHY DEVICE WITH THE SAME, AND SAMPLE ANALYSIS METHOD USING THE SAME}

본 발명은 다기능 선택밸브에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 용매의 흐름을 변경시킴으로써 역상 액체크로마토그래피 장치에서 1차원 및 2차원 분리기능, 온라인 소화기능뿐 아니라 선택적으로 인산화펩티드 추출기능의 수행이 가능한 다기능 선택밸브, 이를 포함하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치 및 이를 이용한 시료분석방법에 관한 것이다.

온라인 고체상 추출 및 역상 액체 크로마토그래피(on-line solid phase extraction/capillary reverse-phase liquid chromatography)는 그 분석 효율성이 매우 우수하여 프로테옴 연구에 있어서 매우 중요한 기술로 인식되어지고 있다. 특히, 이는 미세량의 생체 물질을 효과적으로 분리할 수 있고, 분석물-고체상 반응 범위가 넓어서 높은 효율로 미세량의 단백질들을 동정하는 것을 가능하게 한다.

단백질을 분석하기 위한 방법으로서 질량 분석법에 기초한 방법(mass spectrometry-base methods)은 프로테옴 연구의 표준 분석 플랫폼이 되고 있으며, 대표적인 예로서 샷건 방법 또는 바텀-업 방법 등은 질량 분석기를 사용한 분석 이전에 단백질을 가수분해하여 펩티드로 분해하는데, 이러한 가수분해는 생체 시료들의 용해도를 증가시키며 질량 분석기 중에서 용이하게 이온화 및 검출이 가능한 펩티드 절편들을 생성한다.

그러나, 이러한 공정은 불가피하게 시료의 복잡성을 야기하게 되는 바, 예를 들어 가장 단순한 프로테옴 중의 하나인 효모 프로테옴의 경우에도 약 6,000 여개의 다양한 단백질로부터 300,000개 이상의 펩티드 절편들이 생성된다. 따라서, 이러한 시료 복잡성을 해결하기 위한 방편으로서, 온-/오프-라인 다차원 단백질 동정 기술(on-/off-line multidimensional protein identification technology)과 같은 다양한 방법들이 개발되었으나 (Link, A. J., Eng, J., Schieltz, D. M., Carmack, E., et al., Nat . Biotechnol . 1999, 17, 676-682; Chen, E. I., Hewel, J., Felding-Habermann, B., Yates, J. R. III, Mol . Cell . Proteomics 2006, 5, 53-56.), 액체 크로마토그래피 칼럼의 효율성 및 감도를 개선하여야 하는 필요성은 여전히 존재한다. 이때, 액체 크로마토그래피/질량 분석법 실험의 감도는 분리 칼럼의 길이를 일정하게 유지한 채로, 내경을 감소시키는 경우에 급격히 증가될 수 있다는 사실이 알려진 바 있다(Kim, M. -S., Choie, W. -S., Shin, Y. S., Yu, M. H., Lee, S. -W., Bull . Korean Chem . Soc . 2004, 25, 1833-1839.).

또한, 상당량의 세제 및 염들을 포함하는 생물 시료의 경우에 있어서, 온-라인 탈염 공정(on-line desalting step)은 질량 분석 이전에 거쳐야 하는 필수적인 과정인데, 이는 이러한 불순물들이 분석하고자 하는 펩티드 시료의 이온화 과정을 방해하여 펩티드 시료에 대한 검출 감도를 떨어뜨리기 때문이다. 이때, 시간 절약 및 시료 손실 등을 감안하면 온-라인 탈염 공정이 오프-라인 탈염 공정보다 유리하다.

한편, 종래의 역상 액체크로마토그래피 장치는 고체상 추출칼럼을 채용하여 시료를 탈염시키고 농축시키는 1차원 분리기능만을 가지거나, 강양이온교환 크로마토그래피장치와 역상 액체크로마토그래피를 온라인으로 연결하여 2차원 분리기능을 수행하는 2차원 역상 액체크로마토그래피 장치의 경우에도 상호 간섭현상 등에 의해서 정확한 분석을 수행하기가 곤란하거나 복수개의 용매공급펌프가 불가피하여 이를 제어하기 위한 다수개의 밸브로 인해 그 구조가 복잡해지는 문제점이 있었다. 나아가, 이러한 2차원 온라인 역상 액체크로마토그래피 장치에서는 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화(On-line digestion) 기능이나 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출하는 기능을 수행할 수 없는 문제점이 있었다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫번째 과제는 탈염과정 및 시료농축이 가능한 역상 1차원 분리기능, 시료분리칼럼을 이용한 1차원 분리와 역상 2차원 분리를 연결하여 분리 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능, 용매에 고압을 생성하여 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화기능 및 이산화티타늄칼럼을 이용하여 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출하는 기능을 역상 액체크로마토그래피 장치에서 구현할 수 있는 다기능 선택밸브를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두번째 과제는, 1개의 용매공급펌프를 사용하면서, 상술한 기능들을 자동화하여 다기능 선택밸브의 단순조작만으로 선택적으로 수행할 수 있는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 세번째 과제는, 상술한 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 시료의 분석을 효율적으로 수행할 수 있는 시료분석방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상술한 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,

다중포트를 포함하고, 상기 다중포트의 일부에 시료분리칼럼의 양단이 연결될 수 있는 다기능 선택밸브로서,

유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하지 않고 배출되는 유체통과모드;

유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 배출되는 칼럼통과모드; 및

유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드;를 포함하는 다기능 선택밸브를 제공한다.

여기서, 상기 다기능 선택밸브의 다중포트는, 유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함할 수 있다.

또한, 상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고, 상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되며, 상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 복수의 선택포트는 제1, 제2, 제3 선택포트를 포함하고, 상기 유체통과모드에서 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트, 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트와 상기 제1 선택포트가 각각 서로 유체연통되고, 상기 칼럼통과모드에서 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트가 서로 유체연통되고, 상기 유체폐쇄모드에서 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트와 상기 제2 선택포트, 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트와 상기 제3 선택포트, 상기 제1 선택포트와 상기 유출포트가 각각 서로 유체연통되는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 측면에 의하면,

다중포트를 포함하고, 상기 다중포트의 일부에 시료분리칼럼의 양단이 연결되고, 상기 다중포트의 다른 일부에 이산화티타늄칼럼의 양단이 연결될 수 있는 다기능 선택밸브로서,

유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼 및 상기 이산화티타늄칼럼을 통과하지 않고 배출되는 유체통과모드;

유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 배출되는 칼럼통과모드;

유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드; 및

유입되는 유체가 상기 이산화티타늄칼럼을 통과하여 배출되는 이산화티타늄칼럼통과모드;를 포함하는 다기능 선택밸브를 제공한다.

여기서, 상기 다기능 선택밸브의 다중포트는, 유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 이산화티타늄칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트 및 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함할 수 있다.

또한, 상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고, 상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되고, 상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되고, 상기 이산화티타늄칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 복수의 선택포트는 제1, 제2, 제3 선택포트를 포함하고, 상기 유체통과모드에서 상기 제1 선택포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트가 각각 서로 유체연통되고, 상기 칼럼통과모드에서 상기 제1 선택포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트가 각각 서로 유체연통되고, 상기 유체폐쇄모드에서 상기 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트를 폐쇄시키고, 상기 이산화티타늄칼럼통과모드에서 상기 제1 선택포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 제3 선택포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 시료분리칼럼은 강양이온교환칼럼, 약음이온교환칼럼, 힐릭(HILIC)칼럼 또는 강약이온혼합칼럼 중 어느 하나인 것이 바람직하다.

본 발명은 상술한 두 번째 과제를 달성하기 위하여,

분석 대상이 되는 시료가 주입되는 시료유입밸브;

고체상 추출칼럼 및 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는 트랩밸브;

상기 시료유입밸브에서 상기 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 제1항 또는 제5항에 따른 다기능 선택밸브; 및

상기 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 상기 다기능 선택밸브 또는 상기 트랩밸브로 선택적으로 공급하는 연결밸브;를 포함하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 제공한다.

여기서, 다기능 액체 크로마토그래피장치는 상기 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 용매를 공급하는 용매공급펌프를 더 포함하고, 상기 용매공급펌프에는 상기 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 용매를 선택적으로 공급하는 T형 용매분리관이 연결되어 있는 것이 바람직하다.

또한, 상기 시료유입밸브는 시료유입포트, 시료방출포트, 시료저장루프에 의해 서로 연결된 제1 시료저장루프 연결포트 및 제2 시료저장루프 연결포트, 용매유입포트, 및 용매유출포트를 포함하고, 상기 시료유입밸브는 상기 시료유입포트와 상기 제1 시료저장루프 연결포트가 유체연통되고, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 시료방출포트가 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 제1 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유출포트가 유체 연통되며, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유입포트가 유체 연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 연결밸브는 제1 유입포트, 제2 유입포트, 제1 연결포트, 제2 연결포트, 제1 유출포트 및 제2 유출포트를 포함하고, 상기 연결밸브는 상기 제1 유입포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제1 모드; 및 상기 제2 유입포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 연결밸브에는 서로 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 다기능 선택밸브가 유체통과모드일 때 상기 시료의 1차원 분리기능이 수행되고, 칼럼통과모드일 때 상기 시료의 2차원 분리기능이 수행되고, 유체폐쇄모드일 때 상기 시료의 온라인 소화기능이 수행되며, 이산화티타늄칼럼통과모드일 때 인산화펩티드 추출기능이 수행되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 트랩밸브는 상기 고체상 추출칼럼과 연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 역상 액체크로마토그래피칼럼과 연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 상기 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트, 및 방출포트를 포함할 수 있다.

또한, 상기 트랩밸브는, 상기 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제1 유입포트가 유체 연통되고, 상기 시료이동루프 연결포트와 상기 방출포트가 유체 연통되는 제1 모드; 및 상기 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트와 상기 고체상 추출칼럼 연결포트가 유체 연통되고, 상기 제2 유입포트와 상기 시료이동루프 연결포트가 유체 연통되는 제2 모드;를 포함할 수 있다.

또한, 상기 시료유입밸브의 용매유출포트와 상기 연결밸브의 제1 유입포트는 유체연통되고, 상기 연결밸브의 제1 유출포트와 상기 다기능 선택밸브의 유입포트는 유체연통되고, 상기 다기능 선택밸브의 유출포트와 상기 트랩밸브의 제1 유입포트는 유체연통되며, 상기 연결밸브의 제2 유출포트와 상기 트랩밸브의 제2 유입포트는 유체연통되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 고체상 추출칼럼에서, 유입되는 시료의 흐름방향과 상기 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향은 서로 반대인 것이 바람직하다.

또한, 상기 용매공급펌프에는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 공급할 수 있도록 용매선택밸브가 설치된 것이 바람직하다.

본 발명은 상술한 세 번째 과제를 달성하기 위하여,

본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 있어서,

(a) 상기 시료주입밸브에 분석대상 시료를 주입하는 단계;

(b) 상기 시료유입밸브와 상기 다기능 선택밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 설정하고, 상기 다기능 선택밸브를 유체통과모드로 설정하는 단계;

(c) 상기 시료의 제1 용매를 상기 시료주입밸브에 유입시켜 상기 제1 용매를 상기 트립밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계; 및

(d) 상기 시료유입밸브와 상기 트랩밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 변경하고, 상기 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 상기 시료주입밸브에 유입시켜 상기 혼합용매를 상기 트랩밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계;를 포함하고,

상기 (d) 단계에서 상기 고체상 추출칼럼을 통과한 상기 혼합용매가 상기 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 통과하여 상기 시료의 분석이 이루어지는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법을 제공한다.

여기서, 상기 (c) 단계 중에, 상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

또한, 상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계 이후에 상기 다기능 선택밸브를 이산화티타늄칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 있어서,

(a) 상기 시료주입밸브에 분석대상 시료를 주입하는 단계;

(b) 상기 시료유입밸브와 상기 다기능 선택밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 설정하고, 상기 다기능 선택밸브를 유체폐쇄모드로 설정하는 단계;

(c) 상기 시료의 제1 용매를 상기 시료주입밸브에 유입시켜 상기 제1 용매의 압력을 상승시키는 단계;

(d) 상기 다기능 선택밸브를 유체통과모드로 변경하고 상기 제1 용매를 상기 트립밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계; 및

(e) 상기 시료유입밸브와 상기 트랩밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 변경하고, 상기 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 상기 시료유입밸브에 유입시켜 상기 혼합용매를 상기 트랩밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계;를 포함하고,

상기 (e) 단계에서 상기 고체상 추출칼럼을 통과한 상기 혼합용매가 상기 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 통과하여 상기 시료의 분석이 이루어지는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법을 제공한다.

여기서, 상기 (d) 단계 중에, 상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 선택밸브를 이용하면, 유체의 이동경로를 변경시킴으로써, 탈염과정 및 시료농축이 가능한 1차원 분리기능, 시료분리칼럼을 이용한 1차원 분리와 역상 2차원 분리를 연결하여 분리 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능, 용매에 고압을 생성하여 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화기능을 역상 액체크로마토그래피 장치에서 수행할 수 있다. 나아가, 이산화티타늄칼럼을 이용하여 인산화펩티드를 선택적으로 추출하는 기능도 역상 액체크로마토그래피 장치에서 구현할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치는 1개의 용매공급펌프를 사용하면서, 1차원 분리기능, 2차원 분리기능, 온라인 소화기능 및 인산화펩티드 추출기능을 선택적으로 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 시료분석방법에 의하면 상술한 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 1차원 분리기능, 2차원 분리기능, 온라인 소화기능 및 인산화펩티드 추출기능을 필요에 따라 조합하여 시료의 분석을 효율적으로 수행할 수 있다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 선택밸브의 여러 모드들의 구성도이다.
도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 다기능 선택밸브의 여러 모드들의 구성도이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 시료주입단계에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 온라인 소화기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 1차원 분리기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 2차원 분리기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 인산화펩티드 추출기능을 수행하는 과정에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 시료분석단계에서의 각 밸브의 구성도이다.
도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 에놀라제 펩티드에 대해 1차원 및 2차원 분리실험을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 4a 및 도 4b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 이스트 펩티드에 대해 2차원 및 1차원 분리실험을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 베타-케세인 펩티드에 대해 1차원 분리실험 및 인산화펩티드 추출실험을 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 선택밸브(300)는, 도 1a에 도시된 바와 같이 유입포트(301), 유출포트(307), 시료분리칼럼(310)의 양단이 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303), 이들 포트들과 선택적으로 연결가능하게 구성된 제1 선택포트(304), 제2 선택포트(305), 및 제3 선택포트(306)를 포함하여 구성된다.

이 다기능 선택밸브(300)는 액체크로마토그래피 장치에서 시료가 주입되는 시료유입밸브에서 주입된 시료의 분석이 이루어지는 역상 액체크로마토그래피 칼럼이 연결되는 트랩밸브를 향하는 유로에 위치할 수 있다.

본 발명에 따른 다기능 선택밸브(300)는 각 포드의 연결상태를 변경함으로써 다음과 같은 3가지 모드를 포함할 수 있다.

먼저, 첫번째 모드는 시료유입밸브로부터 배출되는 유체를 유입하여 트랩밸브로 배출시키는 유체통과모드이다. 이 유체통과모드에서는, 도 1a(a)에 도시된 바와 같이 유입포트(301)와 유출포트(307)를 서로 직접 유체연통시킨다. 이 때, 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)와 제1 선택포트(304), 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)가 각각 서로 유체연통될 수 있다. 따라서, 이와 같은 포트들의 연결관계에서는 시료유입밸브에서 유입되는 유체가 시료분리칼럼(310)을 통과하지 않고 유입포트(301) 및 유출포트(307)를 거쳐 바로 트랩밸브 쪽으로 배출되게 된다.

두번째 모드는 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 시료분리칼럼(310)을 통과하여 트랩밸브로 배출되도록 하는 칼럼통과모드이다. 이 칼럼통과모드의 각 포트들 간의 연결관계가 도 1a(b)에 도시되어 있다. 즉, 유입포트(301)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)와 유출포트(307)가 각각 서로 유체연통되도록 연결되어 있다. 이 때, 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)는 서로 유체연통될 수 있다. 따라서, 다기능 선택밸브(300)로 유입되는 유체는 유입포트(301), 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 시료분리칼럼(310), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303), 유출포트(307)를 순차적으로 지나서 트랩밸브 쪽으로 배출된다.

세번째 모드는 시료유입밸브로부터 배출되는 유체가 다기능 선택밸브(300) 내부로의 유입이 방지되는 유체폐쇄모드이다. 도 1a(c)에 도시된 바와 같이, 이 모드에서는 유입포트(301)와 유출포트(307)가 서로 유체단절되어 있다. 따라서, 시료유입밸브로부터 배출되는 유체는 다기능 선택밸브(300)의 입구에서 막히게 된다. 유체폐쇄모드의 일 예로서, 유입포트(301)로 유체가 유입되지 않도록 하기 위해 제1 시료분리칼럼 연결포트(302)와 제2 선택포트(305), 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)와 제3 선택포트(306), 제1 선택포트(304)와 유출포트(307)가 각각 서로 유체연통되도록 구성될 수 있다.

후술할 바와 같이, 다기능 선택밸브의 유체통과모드는 액체크로마토그래피 장치의 1차원 분리기능, 칼럼통과모드는 시료분리칼럼을 이용한 2차원 분리기능, 유체폐쇄모드는 용매의 압력을 높여 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜 주는 온라인 소화기능을 액체크로마토그래피 장치에서 구현하게 해 준다. 따라서, 다기능 선택밸브로 유입 및 유출되는 유체의 유로를 안내 또는 폐쇄하는 포트 들의 구성이라면 상술한 포트들의 개수 및 그 연결관계는 일 실시예에 불과하며 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명할 것이다.

한편, 시료분리칼럼(310)은 역상 액체크로마토그래피칼럼과 결합하여 2차원 분리기능을 수행할 수 있는 모든 칼럼이 될 수 있다. 예를 들면, 강양이온교환(Strong Cation eXchange, SCX)칼럼, 약음이온교환(Weak Anion eXchange, WAX)칼럼, 힐릭(Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC)칼럼, 강약이온혼합(SCX-WAX MIXED)칼럼 등이 시료분리칼럼으로 이용될 수 있다.

도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 다기능 선택밸브의 여러 모드에 있어서 각 포트들의 구성을 도시한 도면이다.

도 1b에 도시된 다기능 선택밸브에는 시료분리칼럼(310)과 별도로 이산화티타늄칼럼(311)이 연결될 수 있으므로, 상술한 기능들 이외에 시료를 이산화티타늄칼럼(311)에 통과시킴으로써 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출할 수 있는 인산화펩티드 추출기능을 부가적으로 수행할 수 있다.

즉, 도 1b에 도시된 다기능 선택밸브는, 도 1a에 도시된 다기능 선택밸브에 추가로 이산화티타늄칼럼(311)의 양단이 연결되는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308) 및 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309)를 포함하여 구성될 수 있다. 따라서, 이하에서는 도 1a에 도시된 다기능 선택밸브와 상이한 구성에 대해서만 따로 설명하기로 한다.

도 1b(a)는 유체통과모드를 나타낸 것으로서, 유입포트(301)와 유출포트(307)가 유체연통되되, 이 때 선택포트들의 연결관계는 제1 선택포트(304)와 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309), 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)가 각각 서로 유체연통되어 구성될 수 있다.

도 1b(b)는 칼럼통과모드를 나타낸 것으로서, 유입포트(301)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 유출포트(307)와 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)가 각각 서로 유체연통되되, 이 때 선택포트들의 연결관계는 도 1(a)와 동일하게 구성될 수 있다.

도 1b(c)는 유체폐쇄모드를 나타낸 것으로서, 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308)를 폐쇄시켜 구현할 수 있다.

도 1b(d)는 이산화티타늄칼럼통과모드를 나타낸 것으로서, 유입포트(301)와 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308), 유출포트(307)와 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309)를 각각 서로 유체연통시키되, 이 때 선택포트들의 연결관계는 제1 선택포트(304)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 제2 선택포트(305)와 제3 선택포트(306)가 각각 서로 유체연통되어 구성될 수 있다.

상술한 선택포트들의 연결구성은 각 모드를 수행할 수 있는 경우라면 어떠한 조합이라도 가능함은 물론이다.

이하에서는 상술한 다기능 선택밸브(300)를 포함하는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에 대해 설명하기로 한다. 도 1b에 도시된 다기능 선택밸브는 도 1a에 도시된 다기능 선택밸브의 모든 기능을 포함하여 구현될 수 있으므로, 이하에서는 편의상 도 1b에 도시된 9포트를 포함하는 다기능 선택밸브(300)를 예를 들어 설명하기로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치는, 도 2a에 도시된 바와 같이, 분석 대상이 되는 시료가 주입되는 시료유입밸브(100); 고체상 추출칼럼(410) 및 역상 액체크로마토그래피칼럼(420)과 유체연통되는 트랩밸브(400); 상기 시료유입밸브에서 상기 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 시료분리칼럼(310)과 선택적으로 이산화티타늄칼럼(311)이 연결되는 다기능 선택밸브(300); 및 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 다기능 선택밸브(300) 또는 트랩밸브(400)로 선택적으로 공급하는 연결밸브(200)를 포함한다.

도 2a는 시료주입단계에서 밸브의 구성도를 도시한 도면이다.

시료유입밸브(100)는 분석하고자 하는 시료를 유입하여 시료를 주입하는 밸브로서, 시료유입포트(101), 시료방출포트(102), 시료저장루프(107)에 의해 서로 연결된 제1 시료저장루프 연결포트(103) 및 제2 시료저장루프 연결포트(104), 용매유입포트(105), 및 용매유출포트(106)를 포함할 수 있다.

도 2a에 도시된 시료유입밸브의 상태는 시료가 주입되는 단계를 나타낸 것으로서, 시료유입포트(101)와 제1 시료저장루프 연결포트(103), 시료방출포트(102)와 제2 시료저장루프 연결포트(104)가 각각 서로 유체연통되어 있어서 시료는 시료유입포트(101)를 통하여 시료저장루프(107)에 유입될 수 있다. 이와 같은 시료저장루프(107)를 통해 사용자가 시료의 농도가 너무 낮다고 판단하는 경우에는 시료 주입을 복수회 반복함으로써 충분한 시료 농도를 얻는 것이 가능하게 된다.

시료저장루프(107)는 1㎕ 내지 10㎕의 체적을 갖는 것이 바람직하며, 시료저장루프(107)의 체적이 1㎕ 미만인 경우에는 시료의 취급이 어렵다는 문제점이 있고, 10㎕를 초과하는 경우에는 시료주입시간이 길어지는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.

또한, 시료유입밸브(100)는 시료방출포트(102)를 포함하는데, 시료방출포트(102)는 시료가 시료저장루프(107)에서 상술한 체적 범위 내로 수용될 수 있도록 여분의 시료를 방출하는 역할을 한다.

상술한 바와 같이 시료의 유입이 완료되면, 시료유입밸브(100)의 모드 전환 스위치(미도시)를 이용하여 시료유입밸브의 연결상태를 도 2a에 도시된 제1 모드에서 도 2b에 도시된 제2 모드로 변환시킨다.

시료유입밸브(100)의 제2 모드에서는 제1 시료저장루프 연결포트(103)와 용매유출포트(106)가 유체 연통되며, 제2 시료저장루프 연결포트(104)와 용매유입포트(105)가 유체 연통되도록 구성된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치는 시료유입밸브(100) 또는 연결밸브(200)에 용매를 공급하는 용매공급펌프(500)를 더 포함할 수 있다.

용매공급펌프(500)는 5,000psi 내지 20,000psi의 압력으로 용매를 공급하는 것이 바람직한데, 용매의 공급 압력이 5,000psi 미만인 경우에는 사용가능한 칼럼의 길이가 짧아져서 분리분해능이 저하되는 문제점이 있고, 20,000psi를 초과하는 경우에는 밸브에서 용매가 누출될 수 있는 가능성이 있어서 바람직하지 않다.

용매공급펌프(500)에서 공급되는 용매는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매의 혼합물일 수 있다. 이를 위해, 용매공급펌프(500)에는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매가 일정비율로 섞여진 혼합용매를 공급할 수 있도록 용매선택밸브(미도시)가 설치될 수 있다.

또한, 용매공급펌프(500)에는 시료유입밸브(100) 또는 연결밸브(200)에 용매를 선택적으로 공급하는 T형 용매분리관(510)이 연결될 수 있다.

도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치가 온라인 소화기능을 수행하는 경우의 밸브의 구성도이다.

용매공급펌프를 통해 용매유입포트로부터 제1 용매가 시료유입밸브(100)로 유입되며, 공급되는 제1 용매의 유압에 의해서 시료저장루프(107)에 머물던 시료는 용매유출포트(106)를 통해 배출되고, 연결밸브에 이르게 된다.

연결밸브(200)는 제1 유입포트(201), 제2 유입포트(202), 제1 연결포트(203), 제2 연결포트(204), 제1 유출포트(205) 및 제2 유출포트(206)를 포함할 수 있다.

연결밸브(200)의 제1 유입포트(201)는 시료유입밸브(100)의 용매유출포트(106)와 유체연통되어 있으므로, 용매공급펌프로부터 유입된 제1 용매는 시료와 함께 연결밸브(200)의 제1 유입포트(201), 제1 연결포트(203), 제2 연결포트(204), 제1 유출포트(205)를 순차적으로 거치면서 연결밸브를 통과하게 된다. 이 때, 도 2b에 도시된 바와 같이 연결밸브에는 서로 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성되게 된다.

연결밸브(200)를 통과한 제1 용매는 연결밸브(200)의 제1 유출포트(205)와 유체연통된 다기능 선택밸브(300)의 유입포트(301)를 통해 다기능 선택밸브에 이르게 된다. 이 때, 다기능 선택밸브(300)의 각 포트들의 구성은 전술한 유체폐쇄모드 상태에 있게 된다. 즉, 유입포트(301)와 유출포트(307)은 서로 유체단절되어 있는데, 이는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308)를 폐쇄시킴으로써 구현될 수 있다. 상술한 바와 같이, 유체폐쇄모드의 구현은 다기능 선택밸브(300)의 유입포트(301)와 유출포트(307)를 유체단절시키는 구성이라면 어떠한 것이라도 가능하다.

따라서, 유입되는 제1 용매는 다기능 선택밸브(300)를 통과하지 못하고 이에 따라 공급되는 제1 용매의 압력은 점점 증가하게 된다. 이와 같이, 용매의 이송과정에서 용매의 흐름을 막아 높은 압력을 발생시킴으로써 단백질을 펩티드 상태로 소화시켜주는 온라인 소화기능이 수행되게 된다. 이 경우, 온라인 소화기능은 용매의 압력이 증가될 수록 그 효율이 향상되므로, 제1 용매의 압력을 밸브의 최대허용압력까지 높여주는 것이 좋다.

온라인 소화기능이 수행된 이후, 시료의 탈염 및 농축을 위한 1차원 분리과정이 수행될 수 있다. 도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치가 1차원 분리기능을 수행하는 경우의 밸브의 구성도이다.

도 2c에 도시된 바와 같이, 1차원 분리기능을 수행하기 위해서 다기능 선택밸브(300)에서 유입포트(301)와 유출포트(307)를 서로 유체연통시킨다. 따라서, 유입포트로부터 유입된 용매가 시료분리칼럼(310)을 통과하지 않고 유출포트를 통해 트랩밸브(400) 쪽으로 배출될 수 있다.

트랩밸브(400)는 고체상 추출칼럼(410)과 연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 역상 액체크로마토그래피칼럼(420)과 연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406), 제1 유입포트(401), 제2 유입포트(404), 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프(407)에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트(403), 및 방출포트(405)를 포함할 수 있다. 그리고, 트랩밸브(400)의 제1 유입포트(401)는 다기능 선택밸브(300)의 유출포트(307)와 유체연통되어 있다.

다기능 선택밸브(300)를 통과한 제1 용매는 트랩밸브(400)에 이르게 되는데, 이 때 트랩밸브의 각 포드들은 제1 유입포트(401)와 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 시료이동루프 연결포트(403)와 방출포트(405)가 각각 서로 유체연통되도록 구성되어 있다.

따라서, 다기능 선택밸브(300)로부터 배출되어 제1 용매와 함께 이송된 시료는 제1 유입포트(401)를 경유하여 고체상 추출칼럼 연결포트(402)를 통해서 고체상 추출칼럼(410)으로 주입된다. 이 때, 주입되는 시료의 흐름방향은 도시된 화살표 방향과 같다.

고체상 추출칼럼(410)은 고체상 추출칼럼 연결포트(402)에 직접 결합된 칼럼으로서, 본 발명에 있어서, 고체상 추출칼럼(410)은 50㎛ 내지 500㎛의 내경 및 1cm 내지 4cm의 길이를 갖는데, 이는 종래 통상적인 고체상 추출 칼럼에 비해서 매우 짧은 길이를 갖는 것으로, 본 발명에서는 약 10,000psi 정도의 초고압에서 구동됨에도 불구하고 고체상 추출칼럼의 길이가 상술한 바와 같이 매우 작기 때문에, 시료의 분리분해능을 극대화할 수 있게 된다. 또한, 후술하는 바와 같이, 유입되는 시료의 흐름방향과 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향이 서로 반대이므로 더욱 향상된 시료 분리분해능을 달성할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 고체상 추출칼럼(410)으로 내부 인듀서 (internal inducer)의 스테인레스 스틸 라이너(liner)를 사용할 수 있으며, C18 등의 물질을 내부에 충진시킨 다음, 양 말단을 약 2㎛ 정도의 세공 크기를 갖는 스테인레스 스틸 스크린으로 막아서 충진물의 유출을 차단함으로써, 높은 압력에 견딜 수 있는 견고한 고체상 추출 칼럼을 이용할 수 있다.

한편, 제1 용매의 유압에 의해서 고체상 추출칼럼(410)에 유입되는 시료는 0.5 ㎕/분 내지 10㎕/분의 유속으로 제1 용매가 방출됨으로써 그 유속이 조절될 수 있다. 또한, 방출포트(405)는 시료 중에 함유된 염 성분을 함께 방출함으로써, 효율적인 탈염 공정이 이루어질 수 있도록 한다.

다음으로, 제1 용매가 시료분리칼럼을 통과하게 하여 시료를 분획한 다음 시료의 탈염 및 농축 효율을 높일 수 있는 2차원 분리기능을 설명한다.

도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치가 2차원 분리기능을 수행하는 경우의 밸브의 구성도이다.

2차원 분리기능을 수행하기 위해서는 1차원 분리기능에서의 시료유입밸브(100), 연결밸브(200) 및 트랩밸브(400)의 밸브 구성은 그대로 유지하고, 다기능 선택밸브(300)의 모드를 유체통과모드에서 칼럼통과모드로 전환시키면 된다. 즉, 도 2d에 도시된 바와 같이 칼럼통과모드에서는 유입포트(301)와 제1 시료분리칼럼 연결포트(302), 유출포트(307)와 제2 시료분리칼럼 연결포트(303)가 각각 서로 유체연통된다. 따라서, 다기능 선택밸브(300)에 유입된 제1 용매는 시료분리칼럼(310)을 통과하여 트랩밸브(400)로 이송될 수 있으며, 이로 인해 시료의 분획이 이루어진 후에 시료의 탈염 및 시료의 농축 효율을 더욱 높일 수 있다.

다음으로, 제1 용매가 이산화티타늄칼럼을 통과하게 하여 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출해 낼 수 있는 인산화펩티드 추출기능을 설명한다.

도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치가 인산화펩티드 추출기능을 수행하는 경우의 밸브의 구성도이다.

인산화펩티드 추출기능을 수행하기 위해서는 2차원 분리기능에서의 시료유입밸브(100), 연결밸브(200) 및 트랩밸브(400)의 밸브 구성은 그대로 유지하고, 다기능 선택밸브(300)의 모드를 칼럼통과모드에서 이산화티타늄칼럼통과모드로 전환시키면 된다. 즉, 도 2e에 도시된 바와 같이, 이산화티타늄칼럼통과모드에서는 유입포트(301)와 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트(308), 유출포트(307)와 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트(309)가 각각 서로 유체연통된다. 따라서, 다기능 선택밸브(300)에 유입된 제1 용매는 이산화티타늄칼럼(311)을 통과하여 트랩밸브(400)로 이송될 수 있으며, 이로 인해 시료 안에 인산화된 펩티드만을 선택적으로 추출해 낼 수 있다.

지금까지는 시료가 시료유입포트(101)를 통하여 시료저장루프(107)에 소정량 채워진 다음 제1 용매를 이용하여 시료의 온라인 소화기능, 1차원 분리기능, 2차원 분리기능 및 인산화펩티드 추출기능이 수행되는 과정을 설명하였다.

다음 과정으로는, 고체상 추출칼럼(410)에 주입된 시료를 제2 용매를 사용하여 분리함으로써 시료를 분석하는 과정이 수행되어야 하므로, 이에 대해서 설명하기로 한다.

도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치에서 시료분석단계에서의 밸브 구성도이다.

도 2f를 참조하면, 시료분석과정에서 시료유입밸브(100)의 연결관계는 용매유입포트(105) 및 용매유출포트(106)를 단절시켜 용매분리관(510)을 통해 주입되는 용매가 시료유입밸브(100)를 거치지 않고 직접 연결밸브(200)로 공급되도록 할 수 있다. 즉, 이 때의 시료유입밸브(100)의 각 포트 들의 연결관계는 시료주입단계에서의 그것과 동일하게 구성될 수 있다.

시료분석과정에서의 용매는 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매가 사용되며, 혼합용매의 비율을 달리하여 용매 기울기를 통해 시료의 분리가 이루어진다.

또한, 연결밸브(200)의 각 포트들의 연결관계는, 제2 유입포트(202), 제2 연결포트(204), 제1 연결포트(203), 제2 유출포트(206)가 순차적으로 유체연통되어 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성된다.

연결밸브(200)의 제2 유출포트(206)는 트랩밸브(400)의 제2 유입포트(404)와 유체연통되어, 연결밸브(200)를 통과한 혼합용매가 다기능 선택밸브(300)를 거치지 않고 트랩밸브(400)로 이송된다.

트랩밸브(400)에서는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406)와 고체상 추출칼럼 연결포트(402), 제2 유입포트(404)와 시료이동루프 연결포트(403)가 각각 서로 유체연통되도록 모드를 변경한다. 따라서, 제2 유입포트(404)를 통해 유입된 혼합용매는 시료이동루프(407)를 거쳐 고체상 추출칼럼(410)에 이르고, 고체상 추출칼럼 연결포트(402)와 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트(406)를 거쳐 역상 액체크로마토그래피칼럼(420)을 통과하게 된다. 이 때, 역상 액체크로마토그래피칼럼(420)을 향해 용출되는 시료의 흐름방향(또는 혼합용매의 흐름방향)은 화살표와 같으며, 이는 고체상 추출칼럼으로 유입되는 시료의 흐름방향(또는 제1 용매의 흐름방향)과 반대이므로, 시료의 분리 분해능을 더욱 개선시킬 수 있다.

고체상 추출칼럼(410)에서의 시료 분리는 용매공급펌프(500)로부터 공급되는 혼합용매 중의 제1 용매 및 제2 용매 비율을 시간 경과에 따라 변화시켜가며 수행된다. 즉, 혼합용매 중의 제2 용매 비율이 증가할수록 고체상 추출칼럼(410)에 결합된 시료의 해리 정도가 증가하여 역상 액체 크로마토그래피 칼럼(420)으로 유입되고, 이후 시료의 분리를 통해 분석이 이루어진다.

제1 용매 및 제2 용매로는 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위해서, 다양한 조합의 용매들이 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 상기 제1 용매로서 0.1%의 포름산 수용액이 사용될 수 있고, 상기 제2 용매로서 90%의 아세토니트릴 수용액이 사용될 수 있다. 즉, 이는 전체 용매 중 아세토니트릴의 함량이 증가할수록 고체상 추출 칼럼에 결합된 시료의 해리 정도가 증가하는 시스템을 채택한 것이라 할 수 있다.

시료의 분리가 수행되는 역상 액체크로마토그래피 칼럼(420)은 10㎛ 내지 150㎛의 내경 및 10cm 내지 150cm의 길이를 갖는 것이 바람직하며, 역상 액체크로마토그래피칼럼(420)은 질량 분석기(mass spectrometer)에 연결됨으로써, 후속 분석 공정이 수행될 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치는 시료유입밸브(100), 연결밸브(200), 다기능 선택밸브(300) 및 트랩밸브(400)를 이용하여 1차원 분리기능, 2차원 분리기능, 온라인 소화기능 및 인산화펩티드 추출기능을 필요에 따라 선택적으로 수행할 수 있다. 본 실시예에서는 제1 용매를 이용하여 온라인 소화기능, 1차원 분리기능, 2차원 분리기능, 인산화펩티드 추출기능을 모두 수행하고, 이후 혼합용매를 이용하여 시료를 분리 및 분석하는 과정을 일 예로 들어 설명하였지만, 필요에 따라 다양한 조합이 가능함은 물론이다. 예를 들면, 혼합용매를 사용하여 시료의 분리 및 분석이 이루어지기 전에, 1차원 분리기능만을 수행하거나, 1차원 분리기능 및 2차원 분리기능을 함께 수행하거나, 먼저 온라인 소화기능을 사용하여 실험을 수행한 후 1차원 분리기능 또는 2차원 분리기능을 선택하여 수행할 수 있다. 나아가, 상술한 각 과정에서 인산화펩티드 추출기능을 추가로 수행할 수 있다.

<실시예>

기기

제1 용매로는 0.1%의 포름산 수용액 (Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입)을 사용하였으며, 제2 용매로는 0.1% 포름산이 포함된 100% 아세토니트릴 (J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA로부터 구입)을 사용하였다.

고체상 추출 칼럼(75㎛ ID×360㎛ OD×3cm length)은 12,000psi의 압력에서 융합-실리카 모세관에 C18 물질로 충진시킴으로써 제작되었다. 충진 단계가 완료된 이후에는, 칼럼에 대해서 12,000psi의 압력을 유지하면서 5분 동안 초음파 처리하고, 칼럼 사용 이전에 압력을 서서히 낮추어 주었는데, 이는 충진된 C18 물질들이 분산되는 것을 방지하기 위한 것이다. 또한, 충진시키기 이전에 라이너의 앞부분에는 프릿(frit)을 만들어 충진물을 채우고 뒷부분에는 스테인레스 스틸 스크린 (2㎛ 세공)을 부착시켜 사용하였다.

모세관 칼럼(75㎛ ID×360㎛ OD×80cm length), 즉 역상 액체 크로마토그래피 칼럼은 융합-실리카 모세관을 C18-결합 입자들로 슬러리 패킹시킴으로써 제작하였다 (Shen, Y., Moore, R. J., Zhao, R., Blonder, J., et al ., Anal . Chem . 2003, 75, 3596-3605; Shen, Y., Tolic N., Masselon, C., Pasa-Tolic L. et al ., Anal. Chem . 2004, 76, 144-154; Shen, Y., Smith, R. D., Unger K. K., Kumar, D., Lubda, D., Anal . Chem . 2005, 77, 6692-6701).

충진 단계가 완료된 이후에는, 칼럼에 대해서 12,000psi의 압력을 유지하면서 5분 동안 초음파 처리하고, 칼럼 사용 이전에 압력을 서서히 낮추어 주었는데, 이는 충진된 C18 물질들이 분산되는 것을 방지하기 위한 것이다. 또한, 충진시키기 이전에 라이너의 앞부분에는 프릿(frit)을 만들어 충진물을 채우고 뒷부분에는 스테인레스 스틸 스크린 (2㎛ 세공)을 부착시켜 사용하였다.

시료분리칼럼의 일 예로서 사용된 강양이온교환칼럼(150㎛ ID×360㎛ OD×15cm length)은 10,000psi의 압력에서 5㎛ 파티스페어 강양이온교환 레진(Whatman, Clifton, NJ)으로 슬러리 패킹시킴으로써 제작되었다. 충진 단계가 완료된 이후에는, 칼럼에 대해서 10,000psi의 압력을 유지하면서 5분 동안 초음파 처리하고, 칼럼 사용 이전에 압력을 서서히 낮추어 주었는데, 이는 충진된 물질들이 분산되는 것을 방지하기 위한 것이다. 또한, 충진시키기 이전에 라이너의 앞부분에는 프릿을 만든 후 충진물을 채우고 뒷부분에는 스테인레스 스틸 스크린 (2㎛ 세공)을 부착시켰다.

이산화티타늄칼럼(150㎛ ID×360㎛ OD×10cm length)은 5,000psi의 압력에서 입자 크기가 10㎛ 되는 이산화티타늄(GL Sciences Tokyo, Japan)을 슬러리 패킹시킴으로써 제작되었다. 충진 단계가 완료된 이후에는, 칼럼에 대해서 5,000psi의 압력을 유지하면서 5분 동안 초음파 처리하고, 칼럼 사용 이전에 압력을 서서히 낮추어 주었는데, 이는 충진된 물질들이 분산되는 것을 방지하기 위한 것이다. 또한, 충진시키기 이전에 라이너의 앞부분에는 프릿을 만든 후 충진물을 채우고 뒷부분에는 스테인레스 스틸 스크린 (2㎛ 세공)을 부착시켰다.

한편, 역상 액체 크로마토그래피 칼럼과 연결되는 질량 분석기 (mass spectrometer)로는 나노전자분무 이온화 인터페이스 (nanoelectrospray ionization interface)를 구비한 7-테슬라 후리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기 (7-tesla Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometer) (FTICR, LTQ-FT, ThermoFinnigan)를 사용하였다.

<제1 실시예>

시료

분석 시료로서 베이커스 이스트(bakers yeast)로부터 분리한 에놀라제 (enolase) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA로부터 구입)를 사용하였으며, 시료의 전처리는 서열급 변형 돼지 트립신 (Promega , Madison, WI, USA로부터 구입)을 이용하여 단백질 소화과정을 거쳐 얻어진 펩티드를 사용하였고, 시료의 농도는 20ng이다.

분석 결과의 평가

농도 20ng의 에놀라제에 대해서 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 액체 크로마토그래피 장치를 사용하여 1차원 분리실험을 수행하였다. 즉, 제1 용매로 0.1%의 포름산 수용액을 이용하여 에놀라제 시료를 고체상 추출칼럼으로 보낸 후, 이를 역상 크로마토그래피 방법에 의해 분리하고, 이어서 질량분석기를 통해 얻은 분리된 시료의 크로마토그램을 도 3a에 도시하였다. 세 번의 실험을 수행하였을 때, 거의 유사한 재현성 있는 결과를 얻었고 분리분해능도 뛰어난 것으로 확인되었다.

한편, 동일한 시료에 대해 2차원 분리시험의 결과를 도 3b에 도시하였다. 도 3b에서 위쪽 5개의 그래프는 제1 용매(500 mM 암모늄 아세테이트 수용액, 아세토니트릴수용액 또는 이들의 혼합물)의 조성을 순차적으로 변경하면서 강양이온교환칼럼을 통과시켜 2차원 분리실험을 한 결과이고, 맨 아래쪽 그래프는 1차원 분리실험의 결과이다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 1차원 분리실험의 결과와 2차원 분리실험의 결과를 종합적으로 비교했을 때 서로 일치하는 결과가 보이는 것을 확인할 수 있었다.

<제2 실시예 >

시료

더 복잡한 프로테옴 시료에 대한 분석을 수행하기 위해서 효모 전용해액 (whole lysate)의 트립신 분해 펩티드를 사용하였다. 효모 프로테옴은 S. cerevisiae 반수체 균주 (haploid strains)인 Y2805 (MAT pep::his3 prb1-D1.6R can1 his1-200 ura3-52) 및 AF-2 (HMLa or HMRa ho ade2-1 trp1-1 can1-100 leu2-3,112 his3-11,15 ura3-1 ssd1)를 사용하였다 (Kim, M. -S., Choie, W. -S., Shin, Y. S., Yu, M. H., Lee, S. -W., Bull. Korean Chem. Soc. 2004, 25, 1833-1839.). 이 경우, 단백질을 100mM 암모늄 중탄산염 수용액에 용해시킨 다음, 트립신을 가하고 37℃에서 24시간 동안 단백질 소화를 통해 가수분해를 시켰다. 결과물은 SpeedVac system (SPD1010; ThermoSavant, Holbrook, NY, USA)을 사용하여 완전히 건조시킨 다음, 다음 실험을 수행할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 사용한 이스트 펩티드 시료의 농도는 20㎍이다.

분석결과의 평가

농도 20㎍의 이스트 펩티드에 대해서 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 액체 크로마토그래피 장치를 사용하여 1차원 및 2차원 분리실험을 수행하였다. 도 4a는 제1 용매(500 mM 암모늄 아세테이트 수용액, 아세토니트릴수용액 또는 이들의 혼합물)의 조성을 순차적으로 증가시키면서 강양이온교환칼럼을 통과시켜 2차원 분리실험을 한 결과이고, 도 4b는 제1 용매로 0.1% 포름산이 포함된 100% 아세토니트릴의 조성변화를 이용한 1차원 분리실험의 결과이다. 1차원에서 얻을 수 있는 결과보다 2차원 분리실험의 결과에서 각 구획별로 더 많은 피크들이 존재하는 것을 나타낸 결과로, 2차원 분리실험을 통해 더욱 많은 펩티드가 확인되었으며 1차원 분석결과에 정보력을 높이는 것과 동시의 분석의 효율성을 증대시킬수 있음을 알 수 있었다.

<제3 실시예 >

시료

분석 시료로서 베타-케세인 (β-casein) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA로부터 구입)을 사용하였으며, 시료의 전처리는 서열급 변형 돼지 트립신 (Promega , Madison, WI, USA로부터 구입)을 이용하여 단백질 소화과정을 거쳐 얻어진 펩티드를 사용하였고, 이 때 시료의 농도는 50 ng이다.

분석결과의 평가

상술한 시료에 대해서 본 발명의 일 실시예에 따른 다기능 액체 크로마토그래피 장치를 사용하여 1차원 분리실험 및 인산화펩티드 추출실험을 수행하였다. 도 5a는 제1 용매로서 0.1% 포름산이 포함된 100% 아세토니트릴의 조성변화를 이용하여 수행한 1차원 분리실험 결과를, 도 5b는 제1 용매로서 0.1% 트라이플루오로아세트산과 젖산이 포함된 80% 아세토니트릴을 이용하여 이산화티타늄칼럼을 통과시키면서 인산화펩티드만을 칼럼에 부착 시킨 후 300 mM 암모늄 중탄산염 수용액으로 용출시켜 인산화펩티드만을 선택적으로 추출한 결과를 도시한 그래프이다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 1차원 분리만으로는 인산화펩티드가 존재하지만 다른 피크들에 가려 잘 확인이 되지 않지만, 도 5b에 도시된 바와 같이 베타-케세인 펩티드를 이산화티타늄칼럼을 통과시켰을 때 인산화된 펩티드만 선택적으로 추출되는 결과를 확인할 수 있었다.

본 발명의 단순한 변형 또는 변경은 모두 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

다중포트를 포함하고, 상기 다중포트의 일부에 시료분리칼럼의 양단이 연결될 수 있는 다기능 선택밸브로서,
유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하지 않고 배출되는 유체통과모드;
유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 배출되는 칼럼통과모드; 및
유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드;를 포함하는 다기능 선택밸브.
제1항에 있어서,
상기 다기능 선택밸브의 다중포트는,
유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
제2항에 있어서,
상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고,
상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되며,
상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되는 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
제3항에 있어서,
상기 복수의 선택포트는 제1, 제2, 제3 선택포트를 포함하고,
상기 유체통과모드에서 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트, 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트와 상기 제1 선택포트가 각각 서로 유체연통되고,
상기 칼럼통과모드에서 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트가 서로 유체연통되고,
상기 유체폐쇄모드에서 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트와 상기 제2 선택포트, 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트와 상기 제3 선택포트, 상기 제1 선택포트와 상기 유출포트가 각각 서로 유체연통되는 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
다중포트를 포함하고, 상기 다중포트의 일부에 시료분리칼럼의 양단이 연결되고, 상기 다중포트의 다른 일부에 이산화티타늄칼럼의 양단이 연결될 수 있는 다기능 선택밸브로서,
유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼 및 상기 이산화티타늄칼럼을 통과하지 않고 배출되는 유체통과모드;
유입되는 유체가 상기 시료분리칼럼을 통과하여 배출되는 칼럼통과모드;
유체의 내부 유입을 방지하는 유체폐쇄모드; 및
유입되는 유체가 상기 이산화티타늄칼럼을 통과하여 배출되는 이산화티타늄칼럼통과모드;를 포함하는 다기능 선택밸브.
제5항에 있어서,
상기 다기능 선택밸브의 다중포트는,
유입포트, 유출포트, 상기 시료분리칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 시료분리칼럼 연결포트 및 제2 시료분리칼럼 연결포트, 상기 이산화티타늄칼럼의 양단에 각각 연결되는 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트 및 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 모드들을 구현하도록 다른 포트들과 선택적으로 유체연통되는 복수의 선택포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
제6항에 있어서,
상기 유체통과모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체연통되고,
상기 칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되고,
상기 유체폐쇄모드에서 상기 유입포트와 상기 유출포트가 유체단절되고,
상기 이산화티타늄칼럼통과모드에서 상기 유입포트와 상기 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 유출포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
제7항에 있어서,
상기 복수의 선택포트는 제1, 제2, 제3 선택포트를 포함하고,
상기 유체통과모드에서 상기 제1 선택포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트가 각각 서로 유체연통되고,
상기 칼럼통과모드에서 상기 제1 선택포트와 상기 제2 이산화티타늄칼럼 연결포트, 상기 제2 선택포트와 상기 제3 선택포트가 각각 서로 유체연통되고,
상기 유체폐쇄모드에서 상기 제1 이산화티타늄칼럼 연결포트를 폐쇄시키고,
상기 이산화티타늄칼럼통과모드에서 상기 제1 선택포트와 상기 제1 시료분리칼럼 연결포트, 상기 제3 선택포트와 상기 제2 시료분리칼럼 연결포트가 각각 서로 유체연통되는 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
제1항 또는 제5항에 있어서,
상기 시료분리칼럼은 강양이온교환칼럼, 약음이온교환칼럼, 힐릭(HILIC)칼럼 또는 강약이온혼합칼럼 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 다기능 선택밸브.
분석 대상이 되는 시료가 주입되는 시료유입밸브;
고체상 추출칼럼 및 역상 액체크로마토그래피칼럼과 유체연통되는 트랩밸브;
상기 시료유입밸브에서 상기 트랩밸브로 향하는 유로에 위치하며, 제1항 또는 제5항에 따른 다기능 선택밸브; 및
상기 시료유입밸브로부터 유출되는 유체를 상기 다기능 선택밸브 또는 상기 트랩밸브로 선택적으로 공급하는 연결밸브;를 포함하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 용매를 공급하는 용매공급펌프를 더 포함하고,
상기 용매공급펌프에는 상기 시료유입밸브 또는 상기 연결밸브에 용매를 선택적으로 공급하는 T형 용매분리관이 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 시료유입밸브는, 시료유입포트, 시료방출포트, 시료저장루프에 의해 서로 연결된 제1 시료저장루프 연결포트 및 제2 시료저장루프 연결포트, 용매유입포트, 및 용매유출포트를 포함하고,
상기 시료유입밸브는,
상기 시료유입포트와 상기 제1 시료저장루프 연결포트가 유체연통되고, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 시료방출포트가 유체연통되는 제1 모드; 및
상기 제1 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유출포트가 유체 연통되며, 상기 제2 시료저장루프 연결포트와 상기 용매유입포트가 유체 연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 연결밸브는, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 제1 연결포트, 제2 연결포트, 제1 유출포트 및 제2 유출포트를 포함하고,
상기 연결밸브는,
상기 제1 유입포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제1 모드; 및
상기 제2 유입포트, 상기 제2 연결포트, 상기 제1 연결포트, 상기 제2 유출포트가 순차적으로 유체연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제13항에 있어서,
상기 연결밸브에는 서로 유체연통된 포트들 사이에 Z형 유로가 형성되는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 다기능 선택밸브가 유체통과모드일 때 상기 시료의 1차원 분리기능이 수행되고, 칼럼통과모드일 때 상기 시료의 2차원 분리기능이 수행되고, 유체폐쇄모드일 때 상기 시료의 온라인 소화기능이 수행되며, 이산화티타늄칼럼통과모드일 때 인산화펩티드 추출기능이 수행되는 것을 특징으로 하는 다기능 액체크로마로그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 트랩밸브는 상기 고체상 추출칼럼과 연통되는 고체상 추출칼럼 연결포트, 상기 역상 액체크로마토그래피칼럼과 연통되는 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트, 제1 유입포트, 제2 유입포트, 상기 고체상 추출칼럼 연결포트와 시료이동루프에 의해 연결된 시료이동루프 연결포트, 및 방출포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제16항에 있어서,
상기 트랩밸브는,
상기 고체상 추출칼럼 연결포트와 상기 제1 유입포트가 유체 연통되고, 상기 시료이동루프 연결포트와 상기 방출포트가 유체 연통되는 제1 모드; 및
상기 역상 액체크로마토그래피칼럼 연결포트와 상기 고체상 추출칼럼 연결포트가 유체 연통되고, 상기 제2 유입포트와 상기 시료이동루프 연결포트가 유체 연통되는 제2 모드;를 포함하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 시료유입밸브의 용매유출포트와 상기 연결밸브의 제1 유입포트는 유체연통되고,
상기 연결밸브의 제1 유출포트와 상기 다기능 선택밸브의 유입포트는 유체연통되고,
상기 다기능 선택밸브의 유출포트와 상기 트랩밸브의 제1 유입포트는 유체연통되며,
상기 연결밸브의 제2 유출포트와 상기 트랩밸브의 제2 유입포트는 유체연통되는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 고체상 추출칼럼에서, 유입되는 시료의 흐름방향과 상기 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 향해 용출되는 시료의 흐름방향은 서로 반대인 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 있어서,
상기 용매공급펌프에는 제1 용매 또는 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 공급할 수 있도록 용매선택밸브가 설치된 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치.
제10항에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 있어서,
(a) 상기 시료주입밸브에 분석대상 시료를 주입하는 단계;
(b) 상기 시료유입밸브와 상기 다기능 선택밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 설정하고, 상기 다기능 선택밸브를 유체통과모드로 설정하는 단계;
(c) 상기 시료의 제1 용매를 상기 시료주입밸브에 유입시켜 상기 제1 용매를 상기 트립밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계; 및
(d) 상기 시료유입밸브와 상기 트랩밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 변경하고, 상기 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 상기 시료주입밸브에 유입시켜 상기 혼합용매를 상기 트랩밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계;를 포함하고,
상기 (d) 단계에서 상기 고체상 추출칼럼을 통과한 상기 혼합용매가 상기 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 통과하여 상기 시료의 분석이 이루어지는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법.
제21항에 있어서,
상기 (c) 단계 중에,
상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법.
제22항에 있어서,
상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계 이후에 상기 다기능 선택밸브를 이산화티타늄칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법.
제10항에 따른 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용하여 시료를 분석하는 방법에 있어서,
(a) 상기 시료주입밸브에 분석대상 시료를 주입하는 단계;
(b) 상기 시료유입밸브와 상기 다기능 선택밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 설정하고, 상기 다기능 선택밸브를 유체폐쇄모드로 설정하는 단계;
(c) 상기 시료의 제1 용매를 상기 시료주입밸브에 유입시켜 상기 제1 용매의 압력을 상승시키는 단계;
(d) 상기 다기능 선택밸브를 유체통과모드로 변경하고 상기 제1 용매를 상기 트립밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계; 및
(e) 상기 시료유입밸브와 상기 트랩밸브를 유체연통시키도록 상기 연결밸브의 모드를 변경하고, 상기 제1 용매와 제2 용매의 혼합용매를 상기 시료유입밸브에 유입시켜 상기 혼합용매를 상기 트랩밸브의 상기 고체상 추출칼럼에 주입하는 단계;를 포함하고,
상기 (e) 단계에서 상기 고체상 추출칼럼을 통과한 상기 혼합용매가 상기 역상 액체크로마토그래피 칼럼을 통과하여 상기 시료의 분석이 이루어지는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법.
제24항에 있어서,
상기 (d) 단계 중에,
상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법.
제25항에 있어서,
상기 다기능 선택밸브를 칼럼통과모드로 변경하는 단계 이후에 상기 다기능 선택밸브를 이산화티타늄칼럼통과모드로 변경하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 다기능 전자동 액체크로마토그래피 장치를 이용한 시료분석방법.