JP5763644B2 - 多機能選択具、それを含む多機能全自動液体クロマトグラフィー装置及びそれを利用した試料分析方法 - Google Patents
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Description
また、前記連結部には、互いに流体連通されたポートの間にZ字型流路が形成されることが望ましい。
また、前記溶媒供給ポンプには、第1溶媒、または第1溶媒と第2溶媒との混合溶媒を供給できるように溶媒選択部が設けられたことが望ましい。
ここで、前記(c)ステップ中に、前記多機能選択具をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
また、前記多機能選択具をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択具を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことができる。
本発明による多機能選択具300は、各ポートの連結状態を変更することによって、次のような3種のモードを含みうる。
図1Bは、本発明の他の実施形態による多機能選択具の多様なモードにおいて、各ポートの構成を示す図である。
図1B(c)は、流体閉鎖モードを示すものであって、第1二酸化チタンカラム連結ポート308を閉鎖させて具現することができる。
前述した選択ポートの連結構成は、各モードを行うことができる場合であれば、如何なる組合わせでも可能であるということはいうまでもない。
試料流入部100は、分析しようとする試料を流入して試料を注入する部分であって、試料流入ポート101、試料放出ポート102、試料貯蔵ループ107によって互いに連結された第1試料貯蔵ループ連結ポート103、及び第2試料貯蔵ループ連結ポート104、溶媒流入ポート105、及び溶媒流出ポート106を含みうる。
また、溶媒供給ポンプ500には、試料流入部100または連結部200に溶媒を選択的に供給するT字型溶媒流路選択部510が連結されうる。
溶媒供給ポンプを通じて溶媒流入ポートから第1溶媒が試料流入部100に流入され、供給される第1溶媒の液圧によって試料貯蔵ループ107に泊まった試料は、溶媒流出ポート106を通じて排出され、連結部に至る。
次いで、第1溶媒が1次元分離カラムを通過させて試料を分画した後、試料の脱塩及び濃縮効率を高めうる2次元分離機能を説明する。
図2Dは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、2次元分離機能を行う場合の構成図である。
次いで、第1溶媒が、二酸化チタンカラムを通過させてリン酸化されたペプチドのみを選択的に抽出するリン酸化ペプチド抽出機能を説明する。
図2Eは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置が、リン酸化ペプチド抽出機能を行う場合の構成図である。
図2Fは、本発明の一実施形態による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置で試料分析段階での各部の構成図である。
試料分析過程での溶媒は、第1溶媒と第2溶媒との混合溶媒が使われ、混合溶媒の比率を異ならせて溶媒の傾きを通じて試料の分離がなされる。
第1溶媒としては、0.1%のギ酸水溶液(Merck(Darmstadt、Germany)から購入)を使い、第2溶媒としては、0.1%ギ酸が含まれた100%アセトニトリル(J.T.Baker(Phillipsburg、NJ、USAから購入)を使った。
試料
分析試料として、パン用イースト(bakers yeast)から分離したエノラーゼ(enolase)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO、USAから購入)を使い、試料の前処理は、配列級変形ブタトリプシン(Promega、Madison、WI、USAから購入)を用いてタンパク質消化過程を経て得られたペプチドを使い、試料の濃度は20ngである。
濃度20ngのエノラーゼに対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、1次元分離実験を行った。すなわち、第1溶媒として、0.1%のギ酸水溶液を用いてエノラーゼ試料を固相抽出カラムに送った後、これを逆相クロマトグラフィー方法によって分離し、引き続き、質量分析器を通じて得た分離された試料のクロマトグラムを図3Aに示した。3回の実験を行った時、ほぼ類似した再現性ある結果を得て、分離分解能も優れると確認された。
試料
さらに複雑なプロテオーム試料に対する分析を行うために、酵母前溶解液(wholelysate)のトリプシン分解ペプチドを使った。酵母プロテオームは、S.cerevisiae半数体菌株(haploid strains)であるY2805(MATpep:his3 prb1−D1.6R can1 his1−200 ura3−52)及びAF−2(HMLa or HMRa ho ade2−1 trp1−1 can1−100 leu2−3、112 his3−11、15 ura3−1 ssd1)を使った(Kim,M.−S.,Choie,W.−S.,Shin,Y.S.,Yu,M.H.,Lee,S.−W.,Bull.Korean Chem.Soc.2004,25,1833−1839.)。この場合、タンパク質を100mMアンモニウム重炭酸塩水溶液に溶解させた後、トリプシンを加えて37℃で24時間タンパク質消化を通じて加水分解をさせた。結果物は、SpeedVac system(SPD1010;ThermoSavant、Holbrook、NY、USA)を使って完全に乾燥させた後、次の実験を行うまで−20℃で保管した。使ったイーストペプチド試料の濃度は、20μgである。
濃度20μgのイーストペプチドに対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、1次元及び2次元分離実験を行った。図4Aは、第1溶媒(500mM酢酸アンモニウム水溶液、アセトニトリル水溶液またはこれらの混合物)の組成を順次に増加させながら、強陽イオン交換カラムを通過させて2次元分離実験を行った結果であり、図4Bは、第1溶媒として、0.1%ギ酸が含まれた100%アセトニトリルの組成変化を利用した1次元分離実験の結果である。1次元で得られる結果より2次元分離実験の結果で、各区画別にさらに多いピークが存在することを示す結果であって、2次元分離実験を通じてさらに多いペプチドが確認され、1次元分析結果に情報力を高めると同時に、分析の効率性を増大させることが分かった。
試料
分析試料として、β−カゼイン(β−casein)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO、USAから購入)を使い、試料の前処理は、配列級変形ブタトリプシン(Promega、Madison、WI、USAから購入)を用いてタンパク質消化過程を経て得られたペプチドを使い、この際、試料の濃度は、50ngである。
前述した試料に対して本発明の一実施例による多機能液体クロマトグラフィー装置を使って、1次元分離実験及びリン酸化ペプチド抽出実験を行った。図5Aは、第1溶媒として、0.1%ギ酸が含まれた100%アセトニトリルの組成変化を用いて行った1次元分離実験結果を、図5Bは、第1溶媒として、0.1%トリフルオロ酢酸と乳酸とが含まれた80%アセトニトリルを用いて二酸化チタンカラムを通過させながら、リン酸化ペプチドのみをカラムに付着させた後、300mMアンモニウム重炭酸塩水溶液で溶出させてリン酸化ペプチドのみを選択的に抽出した結果を示すグラフである。図5Aに示したように、1次元分離のみでは、リン酸化ペプチドが存在するが、他のピークに遮蔽されて確認しにくいが、図5Bに示したように、β−カゼインペプチドを二酸化チタンカラムを通過させた時、リン酸化されたペプチドのみ選択的に抽出される結果を確認することができた。
本発明の単純な変形または変更は、いずれも当業者によって容易に実施され、このような変形や変更は、いずれも本発明の領域に含まれる。
Claims (19)
- 多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に1次元分離カラムの両端が連結される多機能選択具であって、
前記多重ポートは、流入ポートと、流出ポートと、前記1次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第1連結ポート及び第2連結ポートとを備え、
前記多機能選択具は、さらに、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過せずに排出される流体通過モードであって、前記流体通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが直接流体連通される、流体通過モードと、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードであって、前記カラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記第1連結ポートが、前記流出ポートと前記第2連結ポートが、それぞれ互いに流体連通される、カラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードであって、前記流体閉鎖モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが流体断絶される、流体閉鎖モードと、を含み、
前記多重ポートは、さらに第1、第2、第3選択ポートを含み、
前記流体通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第2選択ポートと前記第3選択ポートが、前記第2連結ポートと前記第1選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記カラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第2選択ポートと前記第3選択ポートが、互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第1連結ポートと前記第2選択ポートが、前記第2連結ポートと前記第3選択ポートが、前記第1選択ポートと前記流出ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする多機能選択具。 - 多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に1次元分離カラムの両端が連結され、前記多重ポートの他の一部に二酸化チタンカラムの両端が連結される多機能選択具であって、
前記多重ポートは、流入ポートと、流出ポートと、前記1次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第1連結ポート及び第2連結ポートと、前記二酸化チタンカラムの両端にそれぞれ連結される、第1二酸化チタンカラム連結ポート及び第2二酸化チタンカラム連結ポートとを含み、
前記多機能選択具は、さらに、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過せずに排出される流体通過モードであって、前記流体通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが直接流体連通される、流体通過モードと、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードであって、前記カラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記第1連結ポートが、前記流出ポートと前記第2連結ポートが、それぞれ互いに流体連通される、カラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードであって、前記流体閉鎖モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが流体断絶される、流体閉鎖モードと、
流入される流体が、前記二酸化チタンカラムを通過して排出される二酸化チタンカラム通過モードであって、前記二酸化チタンカラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記第1二酸化チタンカラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第2二酸化チタンカラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通される、二酸化チタンカラム通過モードと、を含み、
前記多重ポートは、さらに第1、第2、第3選択ポートを含み、
前記流体通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第1選択ポートと前記第2二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第2選択ポートと前記第3選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記カラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第1選択ポートと前記第2二酸化チタンカラム連結ポートが、前記第2選択ポートと前記第3選択ポートが、それぞれ互いに流体連通され、
前記流体閉鎖モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第1二酸化チタンカラム連結ポートを閉鎖させ、
前記二酸化チタンカラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記第1選択ポートと前記第1連結ポートが、前記第3選択ポートと前記第2連結ポートが、それぞれ互いに流体連通されることを特徴とする多機能選択具。 - 多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に1次元分離カラムの両端が連結される多機能選択具であって、
前記多重ポートは、流入ポートと、流出ポートと、前記1次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第1連結ポート及び第2連結ポートとを備え、
前記多機能選択具は、さらに、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過せずに排出される流体通過モードであって、前記流体通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが直接流体連通される、流体通過モードと、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードであって、前記カラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記第1連結ポートが、前記流出ポートと前記第2連結ポートが、それぞれ互いに流体連通される、カラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードであって、前記流体閉鎖モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが流体断絶される、流体閉鎖モードと、を含み、
前記1次元分離カラムは、強陽イオン交換カラム、弱陰イオン交換カラム、親水クロマトグラフィー(HILIC)カラム、または強弱イオン混合カラムのうちの何れか一つであることをを特徴とする多機能選択具。 - 分析対象となる試料が注入される試料流入部と、
固相抽出カラム及び逆相液体クロマトグラフィーカラムと流体連通されるトラップ部と、
前記試料流入部から前記トラップ部に向ける流路に位置し、請求項1または請求項2による多機能選択具と、
前記試料流入部から流出される流体を前記多機能選択具または前記トラップ部に選択的に供給する連結部と、
を含むことを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。 - 前記試料流入部または前記連結部に溶媒を供給する溶媒供給ポンプをさらに含み、
前記溶媒供給ポンプには、前記試料流入部または前記連結部に溶媒を選択的に供給するT字型溶媒流路選択部が連結されていることを特徴とする請求項4に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。 - 前記試料流入部は、試料流入ポートと、試料放出ポートと、試料貯蔵ループによって互いに連結された、第1試料貯蔵ループ連結ポート及び第2試料貯蔵ループ連結ポートと、溶媒流入ポートと、溶媒流出ポートとを含み、
前記試料流入部は、
前記試料流入部内の連結状態を変更することにより、前記試料流入ポートと前記第1試料貯蔵ループ連結ポートが流体連通され、前記第2試料貯蔵ループ連結ポートと前記試料放出ポートが流体連通される、第1モードと、
前記試料流入部内の連結状態を変更することにより、前記第1試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流出ポートが流体連通され、前記第2試料貯蔵ループ連結ポートと前記溶媒流入ポートが流体連通される、第2モードと、
を含むことを特徴とする請求項4に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。 - 前記連結部は、第1流入ポート、第2流入ポート、第1連結ポート、第2連結ポート、第1流出ポート、及び第2流出ポートを含み、
前記連結部は、
前記連結部内の連結状態を変更することにより、前記第1流入ポート、前記第1連結ポート、前記第2連結ポート、前記第1流出ポートが順次に流体連通される、第1モードと、
前記連結部内の連結状態を変更することにより、前記第2流入ポート、前記第2連結ポート、前記第1連結ポート、前記第2流出ポートが順次に流体連通される、第2モードと、
を含むことを特徴とする請求項4に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。 - 前記連結部には、互いに流体連通されたポートの間にZ字型流路が形成され、前記Z字型流路は、前記第1流入ポート、前記第1連結ポート、前記第2連結ポート、及び前記第1流出ポートが順に流体連通されて形成されることを特徴とする請求項7に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
- 前記多機能選択具が流体通過モードである時、前記試料の1次元分離機能が行われ、カラム通過モードである時、前記試料の2次元分離機能が行われ、流体閉鎖モードである時、前記試料のオンライン消化機能が行われ、二酸化チタンカラム通過モードである時、リン酸化ペプチド抽出機能が行われることを特徴とする請求項4に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
- 前記トラップ部は、前記固相抽出カラムと連通される固相抽出カラム連結ポートと、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムと連通される逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと、第1流入ポートと、第2流入ポートと、前記固相抽出カラム連結ポートと試料移動ループによって連結された試料移動ループ連結ポートと、放出ポートと、を含むことを特徴とする請求項4に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。
- 前記トラップ部は、
前記固相抽出カラム連結ポートと前記第1流入ポートが流体連通され、前記試料移動ループ連結ポートと前記放出ポートが流体連通される、第1モードと、
前記逆相液体クロマトグラフィーカラム連結ポートと前記固相抽出カラム連結ポートが流体連通され、前記第2流入ポートと前記試料移動ループ連結ポートが流体連通される、第2モードと、
を含むことを特徴とする請求項10に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。 - 前記試料流入部の溶媒流出ポートと前記連結部の第1流入ポートは、流体連通され、
前記連結部の第1流出ポートと前記多機能選択具の流入ポートは、流体連通され、
前記多機能選択具の流出ポートと前記トラップ部の第1流入ポートは、流体連通され、
前記連結部の第2流出ポートと前記トラップ部の第2流入ポートは、流体連通されることを特徴とする請求項4に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置。 - 請求項4による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、
(a)前記試料流入部に分析対象試料を注入するステップと、
(b)前記試料流入部と前記多機能選択具とを流体連通させるために、前記連結部のモードを設定し、前記多機能選択具を流体通過モードに設定するステップと、
(c)前記試料の第1溶媒を前記試料流入部に流入させて、前記第1溶媒を前記トラップ部の前記固相抽出カラムに注入するステップと、
(d)前記試料流入部と前記トラップ部とを流体連通させるために、前記連結部のモードを変更し、前記第1溶媒と第2溶媒との混合溶媒を前記試料流入部に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ部の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、
前記(d)ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。 - 前記(c)ステップ中に、
前記多機能選択具をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項13に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。 - 前記多機能選択具をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択具を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項14に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
- 請求項4による多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を用いて試料を分析する方法において、
(a)前記試料流入部に分析対象試料を注入するステップと、
(b)前記試料流入部と前記多機能選択具とを流体連通させるために、前記連結部のモードを設定し、前記多機能選択具を流体閉鎖モードに設定するステップと、
(c)前記試料の第1溶媒を前記試料流入部に流入させて、前記第1溶媒の圧力を上昇させるステップと、
(d)前記多機能選択具を流体通過モードに変更し、前記第1溶媒を前記トラップ部の前記固相抽出カラムに注入するステップと、
(e)前記試料流入部と前記トラップ部とを流体連通させるために、前記連結部のモードを変更し、前記第1溶媒と第2溶媒との混合溶媒を前記試料流入部に流入させて、前記混合溶媒を前記トラップ部の前記固相抽出カラムに注入するステップと、を含み、
前記(e)ステップで、前記固相抽出カラムを通過した前記混合溶媒が、前記逆相液体クロマトグラフィーカラムを通過して、前記試料の分析がなされることを特徴とする多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。 - 前記(d)ステップ中に、
前記多機能選択具をカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項16に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。 - 前記多機能選択具をカラム通過モードに変更するステップ以後に、前記多機能選択具を二酸化チタンカラム通過モードに変更するステップをさらに行うことを特徴とする請求項17に記載の多機能全自動液体クロマトグラフィー装置を利用した試料分析方法。
- 多重ポートを含み、前記多重ポートの一部に1次元分離カラムの両端が連結され、前記多重ポートの他の一部に二酸化チタンカラムの両端が連結される多機能選択具であって、
前記多重ポートは、流入ポートと、流出ポートと、前記1次元分離カラムの両端にそれぞれ連結される、第1連結ポート及び第2連結ポートと、前記二酸化チタンカラムの両端にそれぞれ連結される、第1二酸化チタンカラム連結ポート及び第2二酸化チタンカラム連結ポートとを含み、
前記多機能選択具は、さらに、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過せずに排出される流体通過モードであって、前記流体通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが直接流体連通される、流体通過モードと、
流入される流体が、前記1次元分離カラムを通過して排出されるカラム通過モードであって、前記カラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記第1連結ポートが、前記流出ポートと前記第2連結ポートが、それぞれ互いに流体連通される、カラム通過モードと、
流体の内部流入を防止する流体閉鎖モードであって、前記流体閉鎖モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記流出ポートが流体断絶される、流体閉鎖モードと、
流入される流体が、前記二酸化チタンカラムを通過して排出される二酸化チタンカラム通過モードであって、前記二酸化チタンカラム通過モードで、前記多重ポートの連結状態を変更することにより、前記流入ポートと前記第1二酸化チタンカラム連結ポートが、前記流出ポートと前記第2二酸化チタンカラム連結ポートが、それぞれ互いに流体連通される、二酸化チタンカラム通過モードと、を含み、
前記1次元分離カラムは、強陽イオン交換カラム、弱陰イオン交換カラム、親水クロマトグラフィー(HILIC)カラム、または強弱イオン混合カラムのうちの何れか一つであることをを特徴とする多機能選択具。
Applications Claiming Priority (3)
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