WO2018189871A1 - 液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法 - Google Patents

液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法 Download PDF

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俊和 箕畑
渡邉　淳
祥嗣 中山
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株式会社島津製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing a sample by liquid chromatography / mass spectrometry (LC / MS analysis or LC / MS / MS analysis), and particularly to analysis of a sample containing a component to be analyzed having a wide range of chemical or physical properties.
  • the present invention relates to a suitable analysis method.
  • LC / MS / MS analysis impurities in the sample are eluted with the same retention time as the analyte in liquid chromatography (LC), thereby suppressing ionization of the analyte in mass spectrometry (MS) (ion suppression). ) Or ionization promotion (ion enhancement) may occur (see, for example, Patent Document 1). Since ion suppression and ion enhancement cause a reduction in quantitative reproducibility, it is necessary to appropriately separate various analysis target components and contaminant components contained in the sample in the LC.
  • Such problems are not limited to the analysis of PFAAs and related substances as described above, but samples containing a large number of analytes having different chemical properties or physical properties can be analyzed by LC / MS analysis or LC / MS / This is a problem common to MS analysis.
  • the present invention has been made in view of the above points.
  • the object of the present invention is to perform a single LC / MS analysis or LC analysis on a sample containing a large number of analytes having different chemical or physical properties. It is to provide a method capable of simultaneous analysis by / MS / MS analysis.
  • the sample analysis method by liquid chromatograph mass spectrometry made to solve the above problems is as follows: a) Sample that is provided in the liquid chromatograph and that can be connected in series with each other, and injects the sample into the most upstream column of the column group consisting of a plurality of columns filled with different types of packing materials. An injection step; b) By sending the first eluent to one or a plurality of columns connected in series including the most downstream column in the column group, the one or the series is connected.
  • the “one column including the most downstream column or a plurality of columns connected in series” in the first analysis step and the second analysis step is a part of the plurality of columns constituting the column group. It may be all or all.
  • “one or a plurality of columns connected in series” in the second analysis step corresponds to “one or a plurality of columns connected in series” in the first analysis step. You don't have to.
  • each analysis target component can be appropriately separated from other analysis target components and contaminant components, thereby suppressing the effects of ion enhancement and ion suppression. Mass spectrometry with high reproducibility is possible.
  • the different types of fillers include at least a filler corresponding to the ion exchange mode and a filler corresponding to the reverse phase mode.
  • the sample analysis method according to the present invention is a trap column in which at least one of the plurality of columns constituting the column group excluding the most downstream column collects the sample,
  • the column can be a separation column that separates the sample.
  • the sample analysis method includes:
  • the liquid chromatograph includes a plurality of trap columns, and a trap column included in the column group can be selected from the plurality of trap columns by switching a flow path, and any one of the plurality of trap columns is selected. It is desirable that at least one of the remaining trap columns be cleaned while one is included in the column group.
  • At least one of the first eluent liquid feeding in the first analysis step and the second eluent liquid feeding in the second analysis step is used as a gradient liquid feeding. Is desirable.
  • the sample analysis method by liquid chromatograph mass spectrometry made to solve the above problems is as follows: a) a sample injection step for injecting a sample into a flow channel provided in a liquid chromatograph to a column filled with a mixture of a plurality of types of fillers; b) The first eluent is sent to the column, whereby a part of the analysis target component in the sample is separated in the column, eluted from the column, and analyzed by a mass spectrometer. 1 analysis step; c) By sending a second eluent having a composition different from that of the first eluent to the column, elution is performed in the first analysis step among the components to be analyzed in the column.
  • 1 is a flow path configuration diagram showing a first state of LC-MS in one embodiment of the present invention.
  • the flow-path block diagram which shows the 2nd state of LC-MS in the Example.
  • the sample analysis method uses a plurality of types of fillers and a plurality of types of eluents having different compositions, and performs each LC analysis having different separation characteristics to perform each analysis contained in the sample. Mass spectrometry is performed after the target component is appropriately separated from other analysis target components and contaminant components.
  • single analysis LC / MS / MS analysis or LC / MS analysis (hereinafter referred to as “single analysis”) that accompanies a single sample introduction, a large number of analytes having greatly different chemical properties or physical properties. It becomes possible to quantify the components with good reproducibility.
  • the mass spectrometer used in the present invention may be any apparatus that can analyze the sample components eluted from the liquid chromatograph.
  • a triple quadrupole mass spectrometer, a single four A quadrupole mass spectrometer, a mass spectrometer equipped with a MALDI ion source, or the like can be used.
  • the sample analysis method in the present invention is preferably used for analysis of samples containing a large number of contaminating components that cause ion suppression and ion enhancement, such as biological samples (blood, urine, etc.), environmental samples, food samples, etc. However, it is not limited to the analysis of these samples.
  • fillers corresponding to different separation modes include, for example, reverse phase mode, normal phase mode, HILIC mode, ion exchange mode, ligand exchange mode, ion exclusion mode, size exclusion mode (GPC mode or GFC mode), and affinity mode.
  • a filler corresponding to the ion exchange mode and a filler corresponding to the reverse phase mode can be used as the plurality of types of fillers.
  • the sample analysis method of the present invention includes a column group formed by connecting a plurality of columns 13 and 14 (two but three or more in the figure) in series.
  • LC-MS liquid chromatograph mass spectrometer
  • the columns 13 and 14 are filled with different kinds of fillers
  • a single column 16 is filled with a mixture of plural kinds of fillers.
  • at least one column may be filled with a mixture of a plurality of types of fillers.
  • all the columns may be separation columns, and at least one column may be a trap column.
  • the sample is injected from the sample injection section 12 into the eluent flow path from the liquid supply section 10 to the column 13 or 16.
  • separation of components to be analyzed (component separation) by the column 13, column 14, or column 16 is performed a plurality of times using eluents having different compositions, and the column 14 or column 16 is sequentially eluted accordingly.
  • the component to be analyzed is analyzed by the MS unit 15.
  • the solution for separating the components to be analyzed may be an isocratic solution for feeding an eluent having a constant composition, and an eluent obtained by mixing a plurality of solvents may be mixed.
  • Gradient liquid feeding may be performed while changing the ratio continuously or stepwise (in the case of changing stepwise, it is also called stepwise liquid feeding).
  • isocratic liquid feeding may be performed a plurality of times, or gradient liquid feeding may be performed a plurality of times.
  • the composition of the eluent is made different for each liquid feeding.
  • at least one of the combination of solvents used, the mixing ratio of each solvent at the start of the gradient, and the mixing ratio of each solvent at the end of the gradient is different at each liquid feeding. Like that.
  • an LC-MS having a configuration as shown in FIG. 3 or FIG. 4 can be used.
  • the flow path switching units 18 to 23 have a state in which the columns 13 and 14 are not connected to each other (first state), and a state in which these columns 13 and 14 are connected in series (second state). Can be switched.
  • the first state is a state in which the flow paths inside the flow path switching units 18 to 23 are connected as shown by the solid line in FIG. 3, and the second state is the flow path switching units 18 to 23 in FIG. It is the state which connected the internal flow path as shown with a broken line.
  • the eluent supplied from the first liquid supply unit 11 is sent directly to the column 14, and the eluent supplied from the second liquid supply unit 17 is sent to the drain through the column 13.
  • the eluent supplied from the first liquid supply unit 11 is sent to the column 14 via the column 13, and the eluent supplied from the second liquid supply unit 17 is sent directly to the drain.
  • the sample analysis method of the present invention is carried out in the following procedure.
  • Can do (1) In the first state, the sample is injected from the sample injection unit 12 into the flow path of the eluent supplied from the second liquid supply unit 17, and the analysis target component contained in the sample is collected in the column 13. Let (2) By switching to the second state and feeding a predetermined solvent from the first liquid feeding section 11, a part of the analysis target component collected in the column 13 is eluted and introduced into the column 14.
  • the flow path switching units 18 and 19 are configured so that the upstream column (13a or 13b in the figure) and the downstream column 14 are not connected to each other (first state).
  • the state in which these are connected in series (second state) can be switched, and the flow paths in the flow path switching units 24 and 25 are switched between a connection state indicated by a solid line and a connection state indicated by a dotted line in the figure.
  • second state can be switched, and the flow paths in the flow path switching units 24 and 25 are switched between a connection state indicated by a solid line and a connection state indicated by a dotted line in the figure.
  • FIG. 5 and FIG. 6 show the configuration of the LC-MS used for the sample analysis in this example.
  • This LC-MS embodies the configuration of FIG. 3 described above, in which the two columns 130 and 140 are not connected to each other (first state), and the two columns 130 and 140 are connected in series.
  • the state (second state) can be switched.
  • the LC-MS includes a first liquid feeding unit 110 for feeding an analysis solvent, a second liquid feeding unit 170 for feeding a sample introduction solvent, an autosampler 120, a first column 130, a second column 140, The first flow path switching valve 300, the second flow path switching valve 400, and the MS unit 150 are provided.
  • the first liquid delivery unit 110 includes solvent containers 111, 112, and 113 containing different solvents, and pumps A, B, and C for sucking the solvent from the solvent containers 111, 112, and 113, and the solvent container 111.
  • the second liquid feeding unit 170 is provided with a solvent container 171, a pump D for sucking the solvent from the solvent container 171, and a degasser 172 provided in a flow path between the solvent container 171 and the pump D. Yes.
  • the flow path on the downstream side of the pump A is connected to the MS section 150 via the solvent mixing section 116 and the second column 140, and the flow paths on the downstream side of the pump B and pump C merged in the solvent mixing section 115. Above, it is connected to the second flow path switching valve 400.
  • the flow path on the downstream side of the pump D is connected to the first flow path switching valve 300 via an autosampler 120 for automatically introducing a sample into the flow path.
  • the first flow path switching valve 300 and the second flow path switching valve 400 are both six-way valves, the first flow path switching valve 300 has ports a to f, and the second flow path switching valve 400 is a port. g ⁇ l. These flow path switching valves 300 and 400 are connected in a state where each port is connected as indicated by a solid line in FIG. 5 (first state) and as indicated by a solid line in FIG. The state (second state) can be switched.
  • the port a of the first flow path switching valve 300 is connected to the drain, and the port b is connected to the pump D via the autosampler 120.
  • the port c of the first flow path switching valve 300 is connected to the port h of the second flow path switching valve 400, and the ports d, e, and f of the first flow path switching valve 300 are closed.
  • the port g of the second flow path switching valve 400 is connected to the port j of the second flow path switching valve 400 via the first column 130, and the port i is connected to the drain.
  • the port k of the second flow path switching valve 400 is connected to a solvent mixing unit 116 provided in the middle of the flow path from the pump A to the second column 140.
  • the port 1 of the second flow path switching valve 400 is connected to a solvent mixing unit 115 provided downstream of the pump B and the pump C.
  • LCMS-8060 manufactured by Shimadzu Corporation
  • MS unit 150 mass spectrometer
  • Oasis WAX made by Waters
  • Triart C18 made by YMC Co., Ltd.
  • the solvent supplied by the pump A is a 2.5 mM ammonium acetate aqueous solution (2.5 mM NH 4 Ac_H 2 O) and is supplied by the pump B.
  • the solvent (solvent accommodated in the solvent container 112) is a 95% methanol solution containing 2.5 mM ammonium acetate (2.5 mM NH 4 Ac — 95% MeOH), and the solvent supplied by the pump C (solvent accommodated in the solvent container 113) was a 0.1% ammonia-containing methanol solution (0.1% NH 3 —MeOH), and the solvent fed by the pump D (the solvent accommodated in the solvent container 171) was ultrapure water.
  • plasma added with an organic fluorine compound was used, and the injection volume was 500 ⁇ L (water 250 ⁇ L + sample 250 ⁇ L).
  • a thick solid line indicates the total flow rate (mL / min) of pumps A, B, and C (hereinafter referred to as “total flow rate T”), and a thin solid line indicates the flow rate of pump B occupying the total flow rate T.
  • the broken line indicates the ratio (%) of the flow rate of the pump C in the total flow rate T.
  • the flow rate ratio (%) of pump A is not shown in FIG. 7, the value of the flow rate ratio is naturally from 100% to the flow rate ratio (%) of pump B and the flow rate ratio (%) of pump C. The value obtained by subtracting.
  • the dashed-dotted line in the figure has shown the flow volume (mL / min) of the pump D.
  • LC-MS is in the first state (FIG. 5), and the flow rate ratio of pump B: 65%, the flow rate ratio of pump C: 0%, the total flow rate: 0.3 mL / min, and The sample is injected (injected) from the autosampler 120 at a flow rate of the pump D of 1.0 mL / min (this time is 0.00 minutes of the liquid feeding profile), and the sample is collected in the first column 130. .
  • the components to be analyzed collected in the first column 130 the components that are weakly bound to the filler in the first column 130 (specifically, N-MeFOSA-M and N-EtFOSA-M ) Elutes from the first column 130 and flows into the second column 140.
  • the components (N-MeFOSA-M and N-EtFOSA-M) eluted from the first column 130 in (2) above are temporally separated by the second column 140 and eluted sequentially from the column 140. Analysis is performed by the MS unit 150. At this time, since the first column 130 is separated from the flow path of the mixed solution, the remaining analysis target components collected in the first column 130 are eluted from the first column 130. None happen.
  • the remaining analysis target components collected in the first column 130 are eluted by the action of NH 3 contained in the mixed solution and flow into the second column 140.
  • the mixed solution acts as an eluent having a weak dissolution power in the second column 140
  • the remaining components to be analyzed remain in the vicinity of the inlet of the second column 140 and are once concentrated.
  • the liquid in the second column 140 is filled with the mixed solution (that is, the column is equilibrated).
  • Second analysis step Thereafter, the flow rate ratio of pump B is gradually increased from 0% to 80% from 11.50 minutes to 23.00 minutes after sample injection (gradient liquid feeding). As a result, the elution power of the eluent flowing into the second column 140 gradually increases, and each component adsorbed near the inlet of the second column 140 is separated according to its polarity, and sequentially from the second column 140. It is eluted and analyzed by the MS unit 150. Subsequently, at 23.00 minutes after the sample injection, the flow rate ratio of the pump B is changed to 90%, whereby the second column 140 is washed.
  • Table 1 shows the recovery rate of the internal standard determined by the above analysis.

Abstract

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析において、試料を、液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続され且つそれぞれ異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群に至る流路に注入する試料注入ステップと、前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は複数のカラムに対して、溶離液を送給することにより、該一つ又は複数のカラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析する第１の分析ステップと、前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は複数のカラムに対して、前記溶離液とは組成の異なる溶離液を送給することにより、該一つ又は複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析する第２の分析ステップと、を実行する。これにより幅広い特性を有する多数の分析対象成分を１回の分析で定量することが可能となる。

Description

液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法
　本発明は、液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析）による試料の分析方法に関し、特に、幅広い化学的又は物理的性質の分析対象成分を含んだ試料の分析に好適な分析方法に関する。
　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析では、試料中の夾雑成分が、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）において分析対象成分と同じ保持時間で溶出することにより、質量分析（ＭＳ）における分析対象成分のイオン化抑制（イオンサプレッション）又はイオン化促進（イオンエンハンスメント）が生じる場合がある（例えば、特許文献１を参照）。イオンサプレッションやイオンエンハンスメントは、定量の再現性低下の要因となるため、ＬＣにおいて試料に含まれる各種分析対象成分と夾雑成分とを適切に分離する必要がある。
　ところで、近年、環境汚染物質の人体への影響を調査するため、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析による生体試料（例えば血漿）中の環境汚染物質の定量分析が広く行われている。環境汚染物質のうち、残留性有機汚染化学物質である有機フッ素化合物 (perfluoroalkyl acids：PFAAs)やそれらの類縁物質（PFCAs、PFASs、FOSA、FTS、PAPなど）は、炭素鎖の長短で化合物の特性（水溶性、脂溶性など）に大きな差異が生じる。そのため、単一条件によるＬＣでは、これらの成分をＭＳ／ＭＳに適した状態、すなわち、各分析対象成分が他の分析対象成分及び夾雑成分と十分に分離された状態にするのは困難であり、PFAAｓやそれらの類縁物質のうちの低分子化合物（PFBA、PFPeA、PFHxA、4:2FTS）のイオン化抑制や、N-MeFOSA-M、N-EtFOSA-Mのイオン化抑制、6:2FTS、8:2FTSのイオン化促進などの問題が避けられない。
　そのため、従来、血漿中のPFAAs及びそれらの類縁物質をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析する場合には、一つの血漿試料について、ＬＣ条件を変えた複数回（例えば３回）の分析を行っていた。
国際公開WO2009/123297公報（[0002]）
　しかしながら、このような方法では、当然ながら、一つの試料について複数回の分析を行うために分析のスループットが低下する。更に、複数回の分析のために試料を分割する必要があるという問題や、複数回のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析で得られたデータが同一試料のものであることを担保する必要がある、という問題もある。
　なお、こうした問題は、上記のようなPFAAsやそれらの類縁物質の分析に限らず、化学的性質又は物理的性質の異なる多数の分析対象成分を含む試料を、ＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析しようとする場合に共通する問題である。
　本発明は、上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、化学的又は物理的性質の異なる多数の分析対象成分を含む試料を１回のＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって一斉分析可能な方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために成された本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法は、
　a)液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続可能に構成され且つそれぞれ異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群のうち、最も上流側のカラムに試料を注入する試料注入ステップと、
　b)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、第１の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
　c)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
　を有することを特徴としている。
　ここで、第１の分析ステップ及び第２の分析ステップにおける「最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラム」は、前記カラム群を構成する複数のカラムの一部であっても全てであってもよい。また、第２の分析ステップにおける「一つ又は直列に接続された複数のカラム」は、第１の分析ステップにおける「一つ又直列に接続されたは複数のカラム」と一致していても一致していなくてもよい。
　上記本発明によれば、１回の試料注入に伴う液体クロマトグラフ質量分析（ＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析）において、分離特性の異なる複数回のＬＣ分離を行うことができる。そのため、幅広い特性の分析対象成分を含む試料の分析において、各分析対象成分を他の分析対象成分及び夾雑成分と適切に分離することが可能となり、その結果、イオンエンハンスメントやイオンサプレッションの影響を抑えた再現性の高い質量分析が可能となる。
　また、本発明に係る試料分析方法は、前記異なる種類の充填剤が、少なくとも、イオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を含むものとすることが望ましい。
　また、本発明に係る試料分析方法は、前記カラム群を構成する複数のカラムのうち、最も下流側のカラムを除くカラムの少なくとも１つのカラムが試料を捕集するトラップカラムであって、その他のカラムが試料を分離する分離カラムであるものとすることができる。
　この場合、前記試料注入ステップと第１の分析ステップの間、若しくは第１の分析ステップと第２の分析ステップの間、又はその両方において、前記トラップカラムに捕集されている分析対象成分の少なくとも一部を該トラップカラムから溶出させる溶出ステップを設けることが望ましい。
　また、本発明に係る試料分析方法は、
　前記液体クロマトグラフが複数のトラップカラムを備え、流路の切替によって前記複数のトラップカラムの中から前記カラム群に含めるトラップカラムを選択可能なものであって、前記複数のトラップカラムのいずれか一つが前記カラム群に含まれている間に、残りのトラップカラムのうちの少なくとも１つの洗浄を行うものとすることが望ましい。
　また、本発明に係る試料分析方法は、前記第１の分析ステップにおける第１の溶離液の送液又は前記第２の分析ステップにおける前記第２の溶離液の送液の少なくとも一方をグラジエント送液とすることが望ましい。
　また、上記課題を解決するために成された本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法は、
　a)液体クロマトグラフに設けられた、複数種類の充填剤の混合物が充填されたカラムへと至る流路中に試料を注入する試料注入ステップと、
　b)前記カラムに対して第１の溶離液を送液することにより、該カラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、該カラムから溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
　c)前記カラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該カラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップでは溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、該カラムから溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
　を有することを特徴としている。
　以上の通り、本発明に係る液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法によれば、試料中に含まれる幅広い特性を有する多数の分析対象成分を１回のＬＣ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって分析することが可能となる。
本発明の試料分析方法において複数のカラムを使用する場合におけるＬＣ－ＭＳの概略構成を示す図。 本発明の試料分析方法において単一のカラムを使用する場合におけるＬＣ－ＭＳの概略構成を示す図。 本発明の試料分析方法において複数のカラムを使用する場合におけるＬＣ－ＭＳの構成の別の例を示す図。 本発明の試料分析方法において複数のカラムを使用する場合におけるＬＣ－ＭＳの構成の更に別の例を示す図。 本発明の一実施例におけるＬＣ－ＭＳの第１状態を示す流路構成図。 同実施例におけるＬＣ－ＭＳの第２状態を示す流路構成図。 同実施例における送液プロファイルを示す図。
　本発明に係る試料分析方法は、複数種類の充填剤と、組成の異なる複数種類の溶離液とを使用して、分離特性の異なる複数回のＬＣ分離を行うことにより、試料に含まれる各分析対象成分を他の分析対象成分及び夾雑成分と適切に分離した上で質量分析するものである。これにより、１回の試料導入に伴うＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析又はＬＣ／ＭＳ分析（以下これを「１回の分析」とよぶ）において、化学的性質又は物理的性質の大きく異なる多数の分析対象成分を再現性よく定量することが可能となる。
　なお、本発明において使用する質量分析装置は、液体クロマトグラフから溶出した試料成分の分析が可能なものであればいかなるものであってもよく、例えば、トリプル四重極型質量分析計、シングル四重極型質量分析計、ＭＡＬＤＩイオン源を搭載した質量分析計などを用いることができる。
　また、本発明における試料分析方法は、イオンサプレッションやイオンエンハンスメントの原因となる夾雑成分を多数含む試料、例えば、生体試料（血液、尿等）、環境試料、食品試料等の分析に好適に用いることができるが、これらの試料の分析に限定されるものではない。
　前記複数種類の充填剤としては、それぞれ異なる分離モードに対応した充填剤を用いることが望ましい。液体クロマトグラフィにおける分離モードには、例えば、逆相モード、順相モード、HILICモード、イオン交換モード、配位子交換モード、イオン排除モード、サイズ排除モード（GPCモード又はGFCモード）、及びアフィニティモードなどがあり、本発明における試料分析方法では、前記複数種類の充填剤として、例えばイオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を使用することができる。なお、前記複数種類の充填剤として、同一の分離モードに対応したものであるが、充填剤を構成する基材の材質（シリカゲル、ポリマーゲルなど）、形状、粒度、細孔径、又は基剤に結合された官能基が異なるものを用いるようにしてもよい。
　本発明の試料分析方法は、例えば、図１に示すように、複数のカラム１３、１４（図中では２つであるが３つ以上でもよい）を直列に接続して成るカラム群を備えた液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ）によって実現できるのほか、図２に示すような、単一のカラム１６を備えたＬＣ－ＭＳによっても実現可能である。前者の場合は、各カラム１３、１４にそれぞれ異なる種類の充填剤を充填し、後者の場合は、単一のカラム１６に、複数種類の充填剤を混合したものを充填する。また、複数のカラムを用いる場合において、少なくとも一つのカラムを複数種類の充填剤の混合物を充填したものとしてもよい。なお、複数のカラムを用いる場合は、全てのカラムを分離カラムとしてもよく、少なくとも１つのカラムをトラップカラムとしてもよい。
　本発明に係る試料分析方法では、図１又は図２のような構成のＬＣ－ＭＳにおいて、送液部１０からカラム１３又はカラム１６に至る溶離液の流路中に、試料注入部１２から試料を導入し、その後、組成の異なる溶離液を用いてカラム１３、カラム１４、又はカラム１６による分析対象成分の分離（成分分離）を複数回行い、これに伴ってカラム１４又はカラム１６から順次溶出する分析対象成分をＭＳ部１５で分析する。ここで、分析対象成分の分離のための送液は、一定組成の溶離液を送液するアイソクラティック送液であってもよく、複数種類の溶媒を混合して成る溶離液を、その混合比を連続的又は段階的に変化させつつ送液するグラジエント送液（段階的に変化させる場合はステップワイズ送液ともよばれる）であってもよい。なお、本発明では、複数回のアイソクラティック送液を行うようにしてもよく、複数回のグラジエント送液を行うようにしてもよい。複数回のアイソクラティック送液を行う場合は、溶離液の組成が各送液時で異なるようにする。また、複数回のグラジエント送液を行う場合は、使用する溶媒の組み合わせ、グラジエント開始時における各溶媒の混合比、グラジエント終了時における各溶媒の混合比の少なくともいずれかが、各送液時で異なるようにする。
　なお、複数のカラムを使用する場合には、例えば、図３又は図４に示すような構成のＬＣ－ＭＳを用いることもできる。図３の構成では、流路切替部１８～２３により、カラム１３とカラム１４を互いに接続しない状態（第１状態）と、これらのカラム１３、１４を直列に接続した状態（第２状態）とを切り替え可能となっている。なお、第１状態は、図３において、流路切替部１８～２３内部の流路を実線で示すように接続した状態であり、第２状態は、図３において、流路切替部１８～２３内部の流路を破線で示すように接続した状態である。第１状態では、第１送液部１１から送給される溶離液は、直接カラム１４に送られ、第２送液部１７から送給される溶離液はカラム１３を経てドレインに送られる。一方、第２状態では、第１送液部１１から送給される溶離液はカラム１３を経てカラム１４に送られ、第２送液部１７から供給される溶離液は、直接ドレインに送られる。
　図３のような構成のＬＣ－ＭＳでは、例えば、カラム１３にトラップカラムを使用し、カラム１４に分離カラムを使用することにより、以下のような手順で本発明の試料分析方法を実施することができる。
　(1) 第１状態において、第２送液部１７より供給される溶離液の流路中に、試料注入部１２から試料を注入し、該試料に含まれる分析対象成分をカラム１３に捕集させる。
　(2) 第２状態に切り替え、第１送液部１１から所定の溶媒を送給することによりカラム１３に捕集されている分析対象成分の一部を溶出させてカラム１４に導入する。
　(3) 第１状態に切り替え、第１送液部１１から所定の溶離液を送給することにより、カラム１４で分析対象成分を分離させ、カラム１４から順次溶出する分析対象成分をＭＳ部１５で分析する（本発明における「第１の分析ステップ」に相当）。
　(4) 第２状態に切り替え、第１送液部１１から前記所定の溶離液とは異なる溶離液を送給することにより、カラム１３から残りの分析対象成分を溶出させると共に、該成分をカラム１４で分離してＭＳ部１５で分析する（本発明における「第２の分析ステップ」に相当）。
　図４のような構成のＬＣ－ＭＳでは、流路切替部１８、１９により、上流側のカラム（図中の１３ａ又は１３ｂ）と下流側のカラム１４を互いに接続しない状態（第１状態）と、これらを直列に接続した状態（第２状態）とを切り替え可能であると共に、流路切替部２４、２５内部の流路を図中の実線で示す接続状態と点線で示す接続状態の間で切り替えることにより、互いに並列に接続されたカラム１３ａとカラム１３ｂのいずれを分析に使用するかを選択することができる。このような構成により、図３と同様のＬＣ－ＭＳと同様の分析を行うことができると共に、カラム１３ａ又はカラム１３ｂのうち、一方を分析に使用している間に、他方を洗浄することができるため、より効率的な試料分析が可能となる。なお、カラム１３ａ及びカラム１３ｂとしては、同一種類の充填剤が充填されたものを使用する。
　以下、本発明に係る試料分析方法により実施した、血漿中のＰＦＡＡｓ及びそれらの類縁物質のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析について説明する。
　本実施例における試料分析に使用したＬＣ－ＭＳの構成を図５及び図６に示す。このＬＣ－ＭＳは、上述した図３の構成を具現化したものであり、二つのカラム１３０、１４０を互いに接続しない状態（第１状態）と、該二つのカラム１３０、１４０を直列に接続した状態（第２状態）とを切り替え可能な構成を有している。
　このＬＣ－ＭＳは、分析用溶媒を送給する第１送液部１１０と、試料導入用溶媒を送給する第２送液部１７０、オートサンプラ１２０、第１カラム１３０、第２カラム１４０、第１流路切替バルブ３００、第２流路切替バルブ４００、及びＭＳ部１５０を備えている。第１送液部１１０には、それぞれ異なる溶媒が収容された溶媒容器１１１、１１２、１１３、これらの溶媒容器１１１、１１２、１１３から溶媒を吸引するためのポンプＡ、Ｂ、Ｃ、溶媒容器１１１、１１２、１１３とポンプＡ、Ｂ、Ｃの間の流路に設けられたデガッサ１１４、ポンプＢにより吸引された溶媒とポンプＣにより吸引された溶媒を混合するための溶媒混合部１１５、及び溶媒混合部１１５で混合された溶媒とポンプＡにより吸引された溶媒を混合するための溶媒混合部１１６が設けられている。また、第２送液部１７０には、溶媒容器１７１、溶媒容器１７１から溶媒を吸引するためのポンプＤ、及び溶媒容器１７１とポンプＤの間の流路に設けられたデガッサ１７２が設けられている。ポンプＡの下流側の流路は、溶媒混合部１１６及び第２カラム１４０を介してＭＳ部１５０に接続されており、ポンプＢ及びポンプＣの下流側の流路は溶媒混合部１１５で合流した上で、第２流路切替バルブ４００に接続されている。ポンプＤの下流側の流路は、流路中に試料を自動的に導入するためのオートサンプラ１２０を介して第１流路切替バルブ３００に接続されている。
　第１流路切替バルブ３００及び第２流路切替バルブ４００は、いずれも六方バルブであり、第１流路切替バルブ３００は、ポートａ～ｆを有し、第２流路切替バルブ４００はポートｇ～ｌを備えている。これらの流路切替バルブ３００、４００は、バルブの内部で各ポートが、図５中の実線で示すように接続された状態（第１状態）と、図６中の実線で示すように接続された状態（第２状態）とを切り替え可能となっている。第１流路切替バルブ３００のポートａはドレインに接続され、ポートｂはオートサンプラ１２０を介してポンプＤに接続されている。第１流路切替バルブ３００のポートｃは第２流路切替バルブ４００のポートｈに接続されており、第１流路切替バルブ３００のポートｄ、ｅ、ｆは閉鎖されている。第２流路切替バルブ４００のポートｇは第１カラム１３０を介して第２流路切替バルブ４００のポートｊに接続されており、ポートｉはドレインに接続されている。第２流路切替バルブ４００のポートｋはポンプＡから第２カラム１４０に至る流路の途中に設けられた溶媒混合部１１６に接続されている。また、第２流路切替バルブ４００のポートｌは、ポンプＢ及びポンプＣの下流に設けられた溶媒混合部１１５に接続されている。
　本実施例では、液体クロマトグラフとしてNexcera（株式会社島津製作所製）を使用し、質量分析装置（ＭＳ部１５０）としてLCMS-8060（株式会社島津製作所製）を使用した。また、第１カラム１３０としてトラップカラムであるOasis WAX（Waters社製）を使用し、第２カラム１４０として分離カラムであるTriart C18（株式会社ワイエムシィ製）を使用した。更に、本実施例では、ポンプＡにより送給される溶媒（すなわち溶媒容器１１１に収容される溶媒）を2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液（2.5 mM NH4Ac_H2O）とし、ポンプＢにより送給される溶媒（溶媒容器１１２に収容される溶媒）を2.5 mM 酢酸アンモニウム含有95%メタノール溶液（2.5 mM NH4Ac_95%MeOH）とし、ポンプＣにより送給される溶媒（溶媒容器１１３に収容される溶媒）を0.1%アンモニア含有メタノール溶液（0.1%NH3_MeOH）とし、ポンプＤにより送給される溶媒（溶媒容器１７１に収容される溶媒）を超純水とした。試料としては、血漿に有機フッ素化合物を添加したものを使用し、インジェクションボリュームは500 μL（水250 μL＋試料250 μL）とした。
　本実施例における分析動作を図７の送液プロファイルを参照しつつ説明する。なお、同図において、太い実線はポンプＡ、Ｂ、Ｃの流量（mL/min）の合計（以下「合計流量Ｔ」とよぶ）を示し、細い実線は合計流量Ｔに占めるポンプＢの流量の比率（％）を、破線は合計流量Ｔに占めるポンプＣの流量の比率（％）を示している。なお、図７ではポンプＡの流量の比率（％）を示していないが、該流量比率の値は、当然ながら、１００％からポンプＢの流量比率（％）とポンプＣの流量比率（％）を減じた値となる。また、図中の一点鎖線はポンプＤの流量（mL/min）を示している。
　（１）試料ロード工程
　まず、ＬＣ－ＭＳが第１状態（図５）であり、且つポンプＢの流量比率：65%、ポンプＣの流量比率：0%、合計流量：0.3 mL/min、及びポンプＤの流量：1.0 mL/minの状態で、オートサンプラ１２０から試料の注入（インジェクション）を行い（この時点が送液プロファイルの0.00分となる）、該試料を第１カラム１３０に捕集させる。
　（２）第１溶出工程
　試料の注入後、2.00分の時点でポンプＢ及びポンプＣの流量比率並びに合計流量Ｔを維持したままポンプＤの流量を０とし、ＬＣ－ＭＳを第２状態（図６）とする。これにより、ポンプＡからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液）が35%と、ポンプＢからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム_95%メタノール）が65%の割合で混合された混合液が第１カラム１３０及び第２カラム１４０に流入する。その結果、第１カラム１３０に捕集されている分析対象成分のうち、第１カラム１３０中の充填剤との結合が弱い成分（具体的には、N-MeFOSA-MとN-EtFOSA-M）のみが第１カラム１３０から溶出して第２カラム１４０に流入する。
　（３）第１分析工程
　その後、試料注入後3.50分の時点で、ＬＣ－ＭＳを第１状態（図５）とし、ポンプＢの流量比率：87.5%、ポンプＣの流量比率：0%、合計流量Ｔ：0.5 mL/minに変更する。これにより、ポンプＡからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液）が12.5%、ポンプＢからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム_95%メタノール）が87.5%の割合で混合された混合液が第２カラム１４０に流入し、上記（２）で第１カラム１３０から溶出した成分（N-MeFOSA-MとN-EtFOSA-M）が第２カラム１４０によって時間的に分離され、該カラム１４０から順次溶出してＭＳ部１５０で分析される。なお、このとき、第１カラム１３０は、前記混合液の流路から切り離された状態にあるため、第１カラム１３０中に捕集されている残りの分析対象成分が第１カラム１３０から溶出されることはない。
　（４）第２溶出工程
　続いて、試料注入後7.50分の時点で、ＬＣ－ＭＳを第２状態（図６）とし、ポンプＢの流量比率：0%、ポンプＣの流量比率：7.5%、合計流量Ｔ：0.25 mL/minに変更する。これにより、ポンプＡからの溶媒（2.5 mM 酢酸アンモニウム水溶液）が92.5%、ポンプＣからの溶媒（NH3_MeOH）が7.5%の割合で混合された混合液が第１カラム１３０及び第２カラム１４０に流入する。このとき、前記混合液に含まれるNH3の作用により、第１カラム１３０に捕集されていた残りの分析対象成分が溶出され、第２カラム１４０に流入する。但し、前記混合液は、第２カラム１４０においては溶出力の弱い溶離液として働くため、前記残りの分析対象成分は、第２カラム１４０の入口付近に留まって、一旦濃縮される。また、このとき第２カラム１４０内の液体が前記混合液により満たされた状態となる（すなわちカラムが平衡化される）。
　（５）第２分析工程
　その後、試料注入後11.50分から23.00分に掛けてポンプＢの流量比率を0%から80%まで徐々に上げていく（グラジエント送液）。これにより、第２カラム１４０に流入する溶離液の溶出力が徐々に高くなり、第２カラム１４０の入口付近に吸着していた各成分がその極性に応じて分離され、第２カラム１４０から順次溶出してＭＳ部１５０で分析される。続いて、試料注入後23.00分の時点でポンプＢの流量比率が90%に変更され、これにより、第２カラム１４０が洗浄される。
　（６）平衡化工程
　その後、試料注入後26.50分の時点で、ＬＣ－ＭＳを第１状態（図５）とし、ポンプＡ～Ｃの流量比率を維持したまま、合計流量Ｔを0.3 mL/min、ポンプＤの流量を1.0 mL/minとすることで、第１カラム１３０及び第２カラム１４０を平衡化する。
　以上の分析により求められた内部標準の回収率を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、本実施例による測定によれば、PFtriDA、PFteDA、PFHxDA、PFODA、及び4:2FTSを除く全ての対象化合物について５０％以上の回収率が得られた。これはイオンサプレッションが改善された結果と考えられる。また、PFtriDA、PFteDA、PFHxDA、PFODA、及び4:2FTSについても４０％以上の比較的高い回収率が得られた。なお、6:2FTS及び8:2FTSについてはイオンエンハンスメントが改善されず１００％を超える回収率を示したが、これはカラムの洗浄不足によるものと考えられる。
１０…送液部
１１、１１０…第１送液部
１７、１７０…第２送液部
１２…試料注入部
１２０…オートサンプラ
１３、１３ａ、１３ｂ、１４、１６…カラム
１３０…第１カラム
１４０…第２カラム
１５、１５０…ＭＳ部
１８、２４…流路切替部
３００…第１流路切替バルブ
４００…第２流路切替バルブ

Claims (6)

  1. 　a)液体クロマトグラフに設けられた、互いに直列に接続可能に構成され且つそれぞれ異なる種類の充填剤が充填された複数のカラムから成るカラム群のうち、最も上流側のカラムに試料を注入する試料注入ステップと、
    　b)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、第１の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
    　c)前記カラム群のうち、最も下流側のカラムを含む一つ又は直列に接続された複数のカラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該一つ又は直列に接続された複数のカラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップで溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、前記最も下流側のカラムから順次溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
    　を有することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
  2. 　前記異なる種類の充填剤が、少なくとも、イオン交換モードに対応した充填剤と、逆相モードに対応した充填剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
  3. 　前記複数のカラムのうち、前記最も下流側のカラムを除くカラムの少なくとも１つのカラムがトラップカラムであって、その他のカラムが分離カラムであることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
  4. 　前記液体クロマトグラフが複数のトラップカラムを備え、流路の切替によって前記複数のトラップカラムの中から前記カラム群に含めるトラップカラムを選択可能なものであって、前記複数のトラップカラムのいずれか一つが前記カラム群に含まれている間に、残りのトラップカラムのうちの少なくとも１つの洗浄を行うことを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
  5. 　前記第１の分析ステップにおける第１の溶離液の送液又は前記第２の分析ステップにおける前記第２の溶離液の送液の少なくとも一方がグラジエント送液であることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
  6. 　a)液体クロマトグラフに設けられた、複数種類の充填剤の混合物が充填されたカラムへと至る流路中に試料を注入する試料注入ステップと、
    　b)前記カラムに対して第１の溶離液を送液することにより、該カラム中で前記試料中の分析対象成分の一部を分離し、該カラムから溶出させて質量分析装置で分析する第１の分析ステップと、
    　c)前記カラムに対して、前記第１の溶離液とは組成の異なる第２の溶離液を送液することにより、該カラム中で、前記分析対象成分のうち前記第１の分析ステップでは溶出しなかった成分の少なくとも一部を分離し、該カラムから溶出させて前記質量分析装置で分析する第２の分析ステップと、
    　を有することを特徴とする液体クロマトグラフ質量分析による試料分析方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2020230284A1 (ja) * 2019-05-15 2020-11-19

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6066161A (ja) * 1983-09-21 1985-04-16 Yokogawa Hokushin Electric Corp 異種イオンの同時測定方法およびその装置
JPH1190102A (ja) * 1997-09-19 1999-04-06 Director General Of The Environmental Health Bureau 水中の成分濃縮用多段式固相及びそれを用いた水中の成分濃縮方法
JP2002372522A (ja) * 2001-06-13 2002-12-26 Shimadzu Corp 高速液体クロマトグラフ
JP2003202332A (ja) * 2002-01-08 2003-07-18 Shimadzu Corp 高速液体クロマトグラフ
JP2008096455A (ja) * 2008-01-07 2008-04-24 Shimadzu Corp 液体クロマトグラフ
JP2008304435A (ja) * 2007-06-11 2008-12-18 Shimadzu Corp 多成分分析方法および多成分分析装置
JP2008309699A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Hitachi High-Technologies Corp イオン交換および順相カラムによる２次元液体クロマトグラフ
JP2010276358A (ja) * 2009-05-26 2010-12-09 Shimadzu Corp 高速液体クロマトグラフ

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4450900A (en) * 1999-04-23 2000-11-10 Advanced Bioanalytical Services, Inc. High-throughput parallel liquid chromatography system
JP2002257806A (ja) 2001-03-05 2002-09-11 Hitachi Ltd フラン環成分分析システム及び分析方法
US6802967B2 (en) * 2002-03-06 2004-10-12 Shimadzu Corporation Multi-dimension liquid chromatography separation system
JP3868899B2 (ja) * 2002-12-25 2007-01-17 株式会社島津製作所 液体クロマトグラフ
JP3816883B2 (ja) * 2003-03-06 2006-08-30 株式会社日立ハイテクノロジーズ 液体クロマトグラフ質量分析装置
JP4093201B2 (ja) * 2004-03-30 2008-06-04 株式会社島津製作所 液体クロマトグラフ
JP4467454B2 (ja) * 2005-03-31 2010-05-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 多次元液体クロマトグラフ及びそれを用いた分析方法
GB2465956B (en) * 2007-10-02 2012-05-09 Shimadzu Corp Preparative separation/ purification system
JP5337144B2 (ja) 2008-04-03 2013-11-06 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置を用いた定量分析方法
CN107073358B (zh) * 2014-10-27 2019-09-17 豪夫迈·罗氏有限公司 用于两向rplc-sfc色谱的系统和方法
US10969368B2 (en) * 2016-09-16 2021-04-06 Shimadzu Corporation Liquid chromatograph

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6066161A (ja) * 1983-09-21 1985-04-16 Yokogawa Hokushin Electric Corp 異種イオンの同時測定方法およびその装置
JPH1190102A (ja) * 1997-09-19 1999-04-06 Director General Of The Environmental Health Bureau 水中の成分濃縮用多段式固相及びそれを用いた水中の成分濃縮方法
JP2002372522A (ja) * 2001-06-13 2002-12-26 Shimadzu Corp 高速液体クロマトグラフ
JP2003202332A (ja) * 2002-01-08 2003-07-18 Shimadzu Corp 高速液体クロマトグラフ
JP2008304435A (ja) * 2007-06-11 2008-12-18 Shimadzu Corp 多成分分析方法および多成分分析装置
JP2008309699A (ja) * 2007-06-15 2008-12-25 Hitachi High-Technologies Corp イオン交換および順相カラムによる２次元液体クロマトグラフ
JP2008096455A (ja) * 2008-01-07 2008-04-24 Shimadzu Corp 液体クロマトグラフ
JP2010276358A (ja) * 2009-05-26 2010-12-09 Shimadzu Corp 高速液体クロマトグラフ

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINK, A.J. ET AL.: "Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 17, July 1999 (1999-07-01), pages 676 - 682, XP002184653 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2020230284A1 (ja) * 2019-05-15 2020-11-19
WO2020230284A1 (ja) * 2019-05-15 2020-11-19 株式会社島津製作所 液体クロマトグラフ
JP7259946B2 (ja) 2019-05-15 2023-04-18 株式会社島津製作所 液体クロマトグラフ

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