CN107073358B - 用于两向rplc-sfc色谱的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于分离和/或分析有机化合物的复杂混合物的两向色谱系统和方法。具体地，描述了两向反相液相色谱(RPLC)‑超临界流体色谱(SFC)系统，其包括在界面上采集从第一方向色谱中洗脱的分析物、同时使得RPLC流动相通过的捕集柱。来自RPLC维度柱(dimension column)的感兴趣的峰被有效地聚焦为捕集柱上的尖锐浓度脉冲，随后将被注入到第二维度SFC柱上。该系统可用于药物化合物的同时非手性和手性分析。第一维度RPLC分离提供非手性纯度结果，且第二维度SFC分离提供手性纯度结果(对映体过量)。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2014年10月27日提交的美国临时专利申请号62/069,219的优先权，将该文献的公开内容以其完整的形式并入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及用于正交分离和分析化合物的混合物的多维色谱系统和方法。公开了示例性的两向反相液相色谱-超临界流体色谱系统及其使用方法。
发明背景
色谱法广泛应用于分离和分析化合物的混合物。由于单向色谱法的峰容量限制，所以已经发明了具有增加的峰容量的多维色谱系统用于分析复杂的样品。两向(2D)色谱技术尤其是在分析复杂的混合物中已经成为极为普遍的。与单向(1D)色谱法相比，2D色谱技术具有更高的选择性和分辨能力，推定保留机制是互补的。当各个分离的选择性独立时(正交)，实现了在两向分离系统中的最大峰容量，使得在单向中难以分辨的成分可以在第二维度上得到完全分辨。如果正交分离机制用于两向，则该系统的理论峰容量为各个峰容量的乘积。参见Giddings，J.C.Ana 1.Chem.1984，56：1258A；Giddings，J.C.：Cortes，H.J.(Ed.)，MultidimensionalChromatogra-phy：Techniques和Applications，Marcel Dekker，New York1990，p.1；Jandera，P.等人，Chromatographia 2004，60：S27。
然而，对于2D色谱在灵敏度和溶剂兼容性方面存在一些限制。例如，从第一维度上携带的流动相通常产生对第二维度的干扰，由此限制了第二维度的分离能力。用于第一维度和第二维度的溶剂的不兼容性可以导致严重的带分散或增宽和峰衰退，由此对界面设计提出了巨大的挑战。Tian，H.，等人，J.Chroma togr.A 2006，1137：42。为了缓解溶剂的不混溶性担忧，研究人员已经研发了几种在两个维度上使用兼容性流动相的2D系统。一些实例包括如下：2D反相液相色谱(RPLC x RPLC)(Venkatramani，C.J.等人，J.Sep.Sci.2012，35：1748；Zhang，J.等人，J.Sep.Sci.2009，32：2084；Song，C.X.等人，Ana1.Chem.2010，82：53；Liu，Y.M.等人，J.Chromatogr.A 2008，1206：153)、2D亲水性相互作用液相色谱(HILICxRPLC)(Liu，Y.M.等人，J.Chromatogr.A 2008，1208：133；Wang，Y.等人，Ana1.Chem.2008，80：4680；Louw，S.等人，J.Chroma togr.A 2008，1208：90)、2D正相液相色谱x超临界流体色谱(NPLC x SFC)(Gao，L.等人，J.Sep.Sci.2010，33：3817)和2D SFC x SFC(Zeng，L.等人，J.Chromatogr.A2011，1218：3080；Lavison，G.等人，J.Chromatogr.A 2007，1161：300；Hirata，Y.等人，J.Sep.Sci.2003，26：531；Okamoto，D.等人，Ana1.Sci.2006，22：1437；Guibal，P.等人，J.Chromatogr.A 2012，1255：252)。Anderer等人的US 2013/0134095公开了2D LC系统和方法，它们尝试通过控制与第二LC状态相关的将第一LC的输出量注入第二LC的注射结果来进一步减少第一LC对第二LC的干扰。
偶联不兼容性“正相”和“反相”维度的一种技术是2D SFC x RPLC(Francois，I.等人，J.Sep.Sci.2008，31：3473-3478；Francois，I.和Sandra，P.J.Chroma togr.A 2009，1216：4005)。在这种情况中，SFC级分中的非极性超临界二氧化碳被蒸发掉(此时暴露于大气压下)，得到与第二RPLC维度具有兼容性流动相的级分(通常是醇调节剂)。Francois，I.等人的SFC x RPLC系统采用用于第一维度SFC单元与第二维度RPLC单元之间的界面的2-位/10-孔口切换阀。该系统在界面上采用填充环路以防止从SFC柱上洗脱下的分析物被CO2蒸气压迫入废物管线和水被导入所述环路以减少第二维度中残留CO2气体的干扰。
Cortes和合作者(J.Microcol.Sep.1992，4：239-244；和美国专利US 5,139,681)描述了2D LC x SFC系统，其包括样品进入毛细管，其中来自第一维度LC的挥发性溶剂被通道的氮气消除，遗留洗脱的分析物的沉积物，然后其被CO2流动相吸附用于第二维度SFC。然而，用通道的氮气消除溶剂对于采用水性流动相的RPLC而言不切实际。
仍然需要用于分离和分析复杂样品的有效的色谱系统和方法，其中有利地进行第一维度RPLC和第二维度SFC分离。
发明概述
公开了用于分离和/或分析复杂有机化合物的混合物的多维色谱系统和方法，例如，两向反相液相色谱(RPLC)-超临界流体色谱(SFC)系统，特别是RPLC×SFC系统，其包括能够保留从RPLC柱上洗脱下的分析物、同时使RPLC流动相通过的界面，由此减少了SFC柱上携带的RPLC溶剂的量。
在一个方面，提供了用于分离样品的色谱系统，包含：(i)第一分离单元，包含：a)第一泵组件，用于驱动第一流动相通过第一分离单元，b)用于将样品导入第一分离单元的加样注射器，和c)反相液体色谱(RPLC)柱；(ii)第二分离单元，包含：a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件，和b)超临界流体色谱(SFC)柱；和(iii)包含多个试样环管的第一流体传送路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至第一分离单元和第二分离单元，其中多个试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；并且其中所述色谱系统被配置用于首先分离所述第一分离单元中的样品，并随后将从RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。在一些实施方案中，该系统还包含用于第一分离单元和/或第二分离单元的检测器。该系统还可以包含可操作地连接至系统组件中的一个或多个的一个或多个控制装置。
在一些实施方案中，2D RPLC x SFC系统包含第一流体传送路线单元，其包含两个试样环管；其中两个试样环管中的一个与第一分离单元流体连通，并且两个试样环管中的另一个与第二分离单元流体连通。在一些实施方案中，第一流体传送路线单元包含三个或更多个试样环管，并且其中试样环管的一个或多个与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。在一个变型中，与第一分离单元和第二分离单元流体隔离的至少一个试样环管包含装载有固定相材料的捕集柱。在一些实施方案中，第一流体传送路线单元被配置为允许逆流洗脱保留在捕集柱中的分析物。在一些实施方案中，第一流体传送路线单元被配置为允许保留在捕集柱中的分析物的并流洗脱。
在一些实施方案中，2D RPLC x SFC系统包含第二分离单元，其包含一个SFC柱，以及任选地位于SFC柱上游的聚焦柱(focus column)。在一些实施方案中，第二分离单元包含SFC柱的平行阵列，它们各自任选地包含位于SFC柱上游的聚焦柱。
还提供了使用本文所述的色谱系统的方法。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的色谱系统分析样品(例如复杂样品)的方法，其包含：首先通过RPLC将复杂样品分离成级分；并且通过第二维度中的SFC进一步分离来自RPLC维度的级分。
在一个实施方案中，提供了使用本文所述的色谱系统对包含立体异构体成分的混合物的样品进行同步非手性-手性分析的方法，包含：通过RPLC在第一维度中分离(或拆分)样品中感兴趣的一种或多种非对映体成分，这提供样品的非手性纯度；并且在相同分析运行中在第二维度中通过SFC分离(或拆分)感兴趣的对映异构体对，这进一步提供样品中成分的手性纯度。
在另一方面，提供了通过多维色谱(例如2D RPLC x SFC)分离样品的方法，包含以下步骤：(i)在捕集柱上俘获至少一部分样品，所述部分来自通过反相液相色谱(RPLC)分离的样品，所述捕集柱包含固定相；和(ii)通过超临界流体色谱(SFC)对俘获在捕集柱上的样品部分进行进一步分离。
附图简述
图1是示例性多维色谱系统10的示意图。
图2A是与第一流体传送路线30接口的示例性第一分离单元20的示意图。
图2B是与第一流体传送路线单元30接口的示例性第二分离单元40A和40B的示意图。
图3A和图3B是包含捕集柱330的示例性第一流体传送路线单元30的示意图，其中第一流体传送路线单元30的结构被配置为用于使第一流动相和第二流动相逆流通过所述捕集柱330。
图3C和图3D是包含捕集柱370的示例性第一流体传送路线单元30的示意图，其中第一流体传送路线单元30的结构被配置为使用于第一流动相和第二流动相并流通过所述捕集柱370。
图4A和图4B是包含捕集柱430的示例性第一流体传送路线单元30的示意图，其中第一流体传送路线单元30的结构被配置为用于使第一流动相和第二流动相并流通过所述捕集柱430。
图5A和图5B是包含两个捕集柱530和560的示例性第一流体传送路线单元30的示意图。其中，第一流体传送路线单元30的结构被配置为用于使第一流动相位和第二流动相逆流通过捕集柱530和560的每一个。
图6A-图6D是示例性第一流体传送路线单元30的示意图，其包含两个传送路线结构600和620。
图7A和图7B是包含SFC柱阵列的第二分离单元40B的示例性下游子单元的示意图。
图8A和图8B分别示出了具有一个捕集柱(并流)的示例性2D RPLC x SFC系统的归属/分析位置和俘获位置。
图9显示了使用捕集柱、聚焦柱和第二SFC柱的阵列的2D RPLC-SFC的示意图。
图10是示例性停车甲板阀的摄影图像。
图11是使用具有三个试样环管配置(6μL、12μL、24μL)的系统对反式茋氧化物(TSO)的多维分离的随时间(分钟)变化的吸光度测量值(mAU)叠加色谱图。
图12是TSO的评价浓度范围(0.005-0.25mg/ml)的多维分离的UV吸光度测量(mAU)随时间(分钟)变化的叠加色谱图。
图13是从2D RPLC-SFC系统获得的药物物质A样品的未加标和加标分析的叠加色谱图。
图14A和图14B分别是包含不同水平的不期望的对映异构体(0.1-2.0％范围)的药物物质A样品的常规SFC和2D RPLC-SFC色谱图。
图15是一系列色谱图，其示例了使用2D RPLC-SFC系统分离药物物质A的样品的8种立体异构体。下部的色谱图显示在第一RPLC维度中药物物质A的样品的4个非对映异构体对的分离。四个上部色谱图显示在第二SFC维度中进一步分离每个非对映异构体对。
图16是使用带有和不带有位于SFC柱上游头部的聚焦柱的2D
RPLC-SFC系统的来自TSO分析的峰高与峰面积在浓度范围内变化的曲线图。
发明详述
本发明提供了用于分离和分析复杂样品的有效色谱系统和方法，特别是两向RPLCx SFC系统及其使用方法。
除非另有明确说明，否则本文所用的术语“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或多个。
本文涉及的“约”值或参数包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包含“X”的描述。
系统
在一个方面，本发明提供了用于分离样品的两向RPLC×SFC色谱系统，其中样品在第一维度RPLC中分离，且然后在第二维度SFC中分离，该系统包含用于反相液相色谱的第一分离单元、用于超临界流体色谱的第二分离单元和作为流体路线传送单元的界面。流体路线传送单元包含多个试样环管，它们各自具有可以放置在第一分离单元的流体路径中的预定体积，用于收集从RPLC柱上洗脱的级分。随后将其中收集级分的试样环管放置在第二分离单元的流体路径中，用于将收集在试样环管中的级分转移到SFC柱以便进一步分离。在本发明的系统中，试样环管的至少一个包含捕集柱，该捕集柱包含固定相，用于保留从RPLC柱上洗脱的分析物，同时使流动相通过。新的界面设计允许RPLC和SFC的偶联。
在一些实施方案中，提供了使用在第一维度中的RPLC和第二维度中的SFC的在线两向色谱系统，这可以实现药物化合物的同时非手性和手性分析。在一些实施方案中，界面包含具有小体积C-18捕集柱的2-位/8-端口切换阀。来自第一RPLC维度柱的感兴趣的峰被有效地聚焦为小体积捕集柱(例如C-18捕集柱)上的尖锐浓度脉冲，且然后被注入到第二维度SFC柱上。第一维度RPLC分离提供了非手性纯度结果，而第二维度SFC分离提供手性纯度结果(对映体过量)。
参考附图，图1描绘了示例性多维色谱系统10的概述示意图。第一分离单元20和第二分离单元40A和40B与第一流体传送路线单元30相接。第一流动相通过第一分离单元20直接流至第一流体传送路线单元30由箭头50指示。由箭头60指示的定向流通过第二分离单元的上游子单元40A传送至第一流体传送路线单元30并且随后沿箭头70指示的方向通过第二分离单元的下游子单元40B被引导返回。
在一些实施方案中，该系统包含一个或多个可操作地连接至系统的一个或多个部件的控制装置，用于控制系统的操作，例如泵组件、加样注射器、第一流体传送路线单元(界面)和存在的检测器。所述控制装置可以包括配备有用于控制每个单独装置的操作和用于自动化样品分析的适当软件(例如Agilent仪器控制软件或Automation Studio软件)的计算机系统。参考图1，控制装置80可操作地连接至以下中的至少一个：第一分离单元20、第一传送路线单元30和第二分离单元40A和40B。
色谱中流动相的组成可以随时间保持恒定，本领域已知作为等度模式。或者，可以随时间改变流动相的组成，在本领域中称为梯度模式。
2D RPLC x SFC色谱系统的第一分离单元包含用于驱动流动相通过第一分离单元的第一泵组件、用于将样品导入第一分离单元的样品注射器和反相液相色谱(RPLC)柱。RPLC的流动相可以包含双溶剂系统(例如水-乙腈和水-甲醇混合物)和任选的某些添加剂(例如乙酸、三氟乙酸、甲酸、氢氧化铵、乙酸铵、乙酸钠等))。泵组件包含用于驱动RPLC的流动相的一个或多个泵。虽然用于液相色谱的适合的泵在本领域中是众所周知的，但是在一些实施方案中，泵可以是往复泵、置换泵、气动泵和/或上述至少一个的任何组合。该系统可以包含用于将样品注入RPLC的流动相的任何适合的加样注射器，例如手动加样注射器或自动进样器。RPLC柱包含反相固定相例如C-18固定相的珠。反相固定相可以是基于二氧化硅的(例如包含硅胶的核心结构)或基于聚合物的(例如包含有机聚合物的核心结构(例如聚苯乙烯))。适合于反相固定相的材料的非限制性实例包括C-18、C-8、C-4、苯基和苯基衍生物、极性包埋相、混合模式相等。
在一些实施方案中，第一分离单元还包括位于RPLC柱下游的检测器，以检测从RPLC柱洗脱的存在的分析物。可以使用适合于检测样品中化合物的任何检测器，例如差示折射计、紫外分光光度计、紫外-可见分光光度计检测器、带电荷的气溶胶检测器、荧光检测器和质谱仪。在一些实施方案中，RPLC维度的检测器是紫外-可见分光光度计检测器、带电荷的气溶胶检测器、荧光检测器和质谱仪。
检测器在系统中可以是任选的，其中分析物在预定时间被洗脱，例如，当RPLC在预先编程的条件下运行时，且感兴趣的分析物的保留时间是预先测定的。
参考附图，图2A显示了与第一流体路线传送单元30接口的示例性的第一分离单元20的示意图。第一分离单元20包含第一个泵100，用于驱动第一流动相沿着由箭头110指示的方向通过第一分离单元。在一些实施方案中，第一流动相可以仅由一种溶剂组成。在一些实施方案中，第一流动相可以由多种混合溶剂组成。在一些实施方案中，第一流动相的溶剂的混合可以被设置在泵100的上游，使得泵100接收作为第一流动相的混合溶剂。在一些实施例中，第一流动相被储存在容器120中。在一些实施方案中，泵100可以由多个单独的泵送单元构成，其中多个泵送单元各自接收和泵送不同的溶剂或溶剂混合物，使得混合发生在泵100的下游。在一些实施方案中，第一流动相可以进一步包含一种或多种添加剂。用于RPLC流动相的添加剂的非限制性实例包含磷酸、磷酸盐缓冲液、乙酸、三氟乙酸、甲酸、氢氧化铵、乙酸铵、乙酸钠，烷基磺酸盐等。
在一些实施方案中，第一流动相的组成可以随时间保持恒定(以等度模式运行)。在一些实施方案中，第一流动相的组成可能会随时间变化(以梯度模式运行)。在梯度模式下的操作通常需要两个泵-一个用于驱动流动相中更具极性的溶剂(例如水)；另一个用于驱动极性较低的溶剂(例如乙腈或甲醇)。在等度模式下的操作可以使用具有两个以恒定比例递送两种溶剂的泵的系统，或者使用具有一个驱动预混合流动相的泵的系统。
此外，图2A的示意图示例了位于泵100与反相液相色谱(RPLC)柱150之间的加样品注射器130。加样注射器130将样品沿箭头140指示的方向导入第一分离单元。在一些实施方案中，配备加样注射器130以便将样品添加到第一分离单元。在一些实施方案中，加样注射器130可以包含阀和用于将样品导入到第一分离单元的试样环管。在一些实施方案中，加样注射器130可以包含自动进样器。
如图2A的示意图中所示，RPLC柱150位于加样注射器130的下游。RPLC柱150可以包含反相固定相。在一些实施方案中，RPLC柱150可以包含碳链键合的硅胶。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为18个碳的碳链(即C18-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为8个碳的碳链(即C8-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为4个碳的碳链(即C4-反相硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核心键合的烃链，例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)。
在一些实施方案中，可以将RPLC柱150的温度维持在选定的温度。在一些实施方案中，可以将RPLC柱150的温度维持在约10℃至约50℃的范围内。在一些实施方案中，可以将RPLC柱150的温度维持在约40℃。
任选地位于第一分离单元20的RPLC柱150与第一流体路线传送单元30之间的是第一检测器160(图2A)。第一检测器测量从RPLC柱150洗脱的至少一部分样品的存在。在一些实施方案中，第一检测器150是光学检测器。在一些实施方案中，第一检测器150是分光光度检测器。在一些实施方案中，第一检测器150选自以下的一种或多种：紫外分光光度计、紫外-可见分光光度计检测器和荧光检测器。
2D RPLC x SFC色谱系统的第二分离单元包含驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件和超临界流体色谱(SFC)柱。SFC的流动相包含超临界流体(例如超临界二氧化碳)和改性剂或共溶剂(例如甲醇、乙醇和异丙醇)、任选的一种或多种添加剂(例如氢氧化铵)。第二泵组件包含用于驱动超临界流体流动相的一个或多个泵。适合于SFC的任何固定相可用于SFC柱。固定相材料的选择可以取决于第二维度的分离标准。在一些实施方案中，SFC柱包含正相固定相，例如硅胶。在一些实施方案中，所述色谱系统还包含位于SFC柱下游的检测器，用于检测从SFC柱洗脱的分析物的存在。可以使用适合于SFC的任何检测器，例如UV检测器、光电二极管阵列检测器、带电荷的气溶胶检测器、荧光检测器和质谱仪(MS)。
参考附图，图2B描绘了示例性第二分离单元的示意图，其包含与第一流体传送路线单元30接口的上游子单元40A和下游子单元40B。第二分离单元的上游子单元40A包含第二个泵200，其用于驱动第二流动相沿箭头210指示的方向通过第二分离单元40A和40B。第二分离单元的下游子单元40B包含SFC柱240，以及任选的聚焦柱260和/或检测器250。在一些实施方案中，第二流动相可以仅由一种溶剂组成。在一些实施方案中，第二流动相可以由多种混合溶剂组成。在一些实施方案中，第二流动相的溶剂的混合可以设置在泵200的上游，使得泵200接收作为第二流动相的混合溶剂。在一些实施方案中，第二流动相被储存在容器220中。在一些实施方案中，泵200可以由多个单独的泵送单元组成，其中多个泵送单元各自接收和泵送不同的溶剂或溶剂的混合物，使得在泵200的下游发生混合。
在一些实施方案中，第二流动相的组成可以随时间保持恒定(以等度模式运行)。在一些实施方案中，第二流动相的组成可能随时间变化(以梯度模式运行)。虽然适合于超临界流体色谱法的泵在本领域中是众所周知的，但是在一些实施方案中，该泵可以是往复泵、置换泵、气动泵和/或至少一个的任意组合。
如图2B中所示，第二分离单元的上游子单元40A与泵200的下游的第一流体传送路线单元30相接。第二流动相通过第二分离单元的下游子单元40B定向流动至第一流体传送路线单元30下游由箭头230示出。SFC柱240可以包含正相固定相。在一些实施方案中，正相固定相为二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用氰基丙基官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用氨基丙基官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用乙基吡啶官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用磺酸和/或苯基官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用1，2-二羟丙基丙基醚官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是聚合物，例如用官能团(例如氰基丙基、氨基丙基、乙基吡啶、磺酸、苯基或1，2-二羟丙基丙基醚官能团)修饰的有机聚合物(例如聚苯乙烯)。适用于SFC固定相的材料的其它实例包括二氧化硅、乙基吡啶、氰基、表二醇(epic diol)、吡啶基酰胺，硝基等。
在一些实施方案中，可以将SFC柱240的温度维持在选定的温度。在一些实施方案中，可以将SFC柱240的温度维持在约35℃至约45℃的范围内。在一些实施方案中，可以将SFC柱240的温度维持在约40℃。
参考图2B，在一些实施方案中，可选的聚焦柱260位于SFC柱240的上游。聚焦柱260包含固定相。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，反相固定相可以包含碳链键合的硅胶。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为18个碳的碳链(即C18-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为8个碳的碳链(即C8-反相哇胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为4个碳的碳链(即C4-反相硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核心、例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)键合的碳链(例如C-18、C-8或C-4链)。通常，聚焦柱将与在界面中使用的主维度和/或捕集柱中使用的反相匹配。
在一些实施方案中，可以将聚焦柱260的温度维持在选定的温度。在一些实施方案中，可以将聚焦柱维持与SFC柱相同的温度。在一些实施方案中，可以将聚焦柱260的温度维持在约35℃至约45℃。在一些实施方案中，可以将聚焦柱260的温度维持在约40℃。
位于SFC柱240下游的是第二检测器250(图2B)。该检测器测量从SFC柱240洗脱的分析物的存在和量。在一些实施方案中，第二检测器250是光学检测器。在一些实施方案中，第二检测器250是分光光度检测器。在一些实施方案中，第二检测器250选自以下的一个或多个：差示折射计、紫外分光光度计、紫外-可见分光光度计检测器、荧光检测器和红外分光光度计。在一些实施方案中，第二检测器250是质谱仪。在一些实施方案中，所述质谱仪可以选自以下的一种或多种：扇形仪器、四极滤质器、飞行时间仪器、离子阱仪器、四极离子阱仪器、线性四极离子阱仪器、轨道离子阱仪器、傅里叶变换离子回旋共振仪器以及所列仪器类型的任意组合或混合体。如本领域众所周知的，通过电离技术将样品导入质谱仪，例如但不限于快原子轰击、化学电离、大气压化学电离、电喷雾电离和纳米电喷雾电离。在一些实施方案中，通过大气压化学电离或电喷雾电离将样品导入质谱仪。
在一些实施方案中，第二分离单元40B的下游部分还可以包含在适当位置上、在第二检测器之后或与第二检测器平行位置上的级分收集器。
任选地，在一些实施方案中，控制装置80可操作地连接至以下中的至少一个：泵100和/或200、样品注射器130、第一检测器160、第一流体传送路线单元30和第二检测器250。
2D色谱系统中的两个维度之间的界面控制分离和从第一维度中洗脱出来的分析物传送至用于进一步分离的第二维度，并确定操作模式。本发明的2D色谱系统被配置为首先通过RPLC分离第一分离单元中的样品，且随后将从RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元，以通过SFC进一步分离。
第一流体传送路线单元包含多个试样环管，所述第一流体传送路线单元连接至第一分离单元和第二分离单元，其中多个试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相。捕集柱中的固定相材料可以与RPLC柱中使用的固定相材料相同，或者与RPLC柱中使用的固定相材料不同。在一些实施方案中，在捕集柱中使用的固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，反相固定相可以包含碳链键合的硅胶。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为18个碳的碳链(即C18反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为8个碳的碳链(即C8-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为4个碳的碳链(即C4反相硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核心、例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)键合的碳链(例如C-18、C-8或C-4链)。
在一些实施方案中，第一流体传送路线单元包括包含多个端口的传送路线结构(例如切换阀)、允许液体在端口之间流动的通道和连接至端口的试样环管。在一些实施方案中，传送路线结构是2-位/8-端口切换阀。在一些实施方案中，传送路线结构是2位/10-端口切换阀。在一些实施方案中，传送路线结构是一个2-位/4-端口双向阀。在一些实施方案中，传送路线结构是2位8端口或10-端口切换阀。
在一些实施方案中，2D RPLC x SFC系统的第一流体传送路线单元包含两个试样环管；其中两个试样环管中的一个与第一分离单元流体连通，并且两个试样环管中的另一个处于与第二分离单元的流体连通。在一些实施方案中，两个试样环管之一包含含有固定相的捕集柱。在一些实施方案中，两个试样环管各自包含含有固定相的捕集柱。
图3A描绘了与第一分离单元20和第二分离单元40A和40B接口的示例性第一流体传送路线单元30的示意图。在这种情况下，接口流体传送路线单元包含传送路线结构300，其在一种变型中是2-位/8-端口切换阀，包含多个端口305A-305H、多个通道310A-310D和两个试样环管315和320。如图3A中所示，在两个可能的配置中的第一个中示出了多个通道310A-310D。
如图3A中所示例的，第一分离单元20在端口305A连接至传送路线结构300。第一流动相通过第一分离单元20沿箭头325指示的方向被驱动，并且传送路线结构300通过通道310A将第一流动相引导至试样环管315。试样环管315在端口305B和端口305F连接至传送路线结构300。试样环管315包含捕集柱330，所述捕集柱包含固定相。
传送路线结构300通过通道310C将第一流动相沿箭头345指示的方向引导至下游容器340。在一些实施方案中，下游容器340是废物容器。在一些实施方案中，下游容器340是级分收集器。
如图3A中所示，第二分离单元的上游子单元40A在端口305G连接至传送路线结构300。第二流动相通过第二分离单元40A沿箭头350指示的方向被驱动，并且传送路线结构300通过通道310D将第二流动相引导至试样环管320。试样环管320在端口305H和端口305D连接至传送路线结构300，其中第一流动相沿箭头355指示的方向行进。传送路线结构300通过端口305C连接至第二分离单元的下游子单元40B。传送路线结构300沿箭头360指示的方向将第二流动相引导通过第二分离单元的下游子单元40B。
图3B中所示例的示意图描绘了如图3A中所示的第一流体传送路线单元的相同配置，除外图3A中的传送路线结构300的多个通道310A-310D现在处于两个可能位置中的第二个，即通道310E-310H，如图3B所示。图3B中的传送路线结构将来自第一分离单元20的第一流动相沿箭头325指示的方向通过通过310H引导至试样环管320。试样环管320在端口305H和端口305D连接至传送路线结构300，其中通过通道310F，第一流动相通过箭头345指示的方向被引导到下游容器340。
如图3B中所示，第二分离单元的上游子单元40A在端口305G连接至传送路线结构300。第二流动相通过第二分离单元40A沿箭头350指示的方向被驱动，并且传送路线结构300现在通过通道310G将第二流动相引导至试样环管315。试样环管315在端口305B和端口305F连接至传送路线结构。传送路线结构300沿箭头365指示的方向引导第二流动相流过捕集柱330。与图3A相比，如图3B中所示的传送路线结构300引导第二流动相沿通过与图3A所示相同的试样环管315的第一流动相相反的流动方向流过试样环管315。传送路线结构300的示例性配置以在本领域中已知为“逆流”方式引导流动相流过试样环管315。
图3C和图3D中示例的示例性示意图描绘了图3A和图3B中所示的第一流体传送路线单元的类似配置，除外如图3C和图3D所示，捕集柱370位于加样试管320上。传送路线结构300沿箭头355指示的方向引导第一流动相的流过包含捕集柱370的试样环管320(图3C)。在图3D中，传送路线结构300的多个通道310A-310D处于两个可能位置的第二位置。传送路线结构300引导第二流动相从第二分离单元的上游子单元40A通过包含捕集柱370的试样环管320，并通过箭头355和360指示的方向通过第二分离单元40B的下游部分。如图3C和图3D中所示例的，第一流动相和第二流动相的流动按照在本领域中称为“并流”的方式沿相同的方向行进通过捕集柱370。
在接口流体传送路线单元中使用2-位/8-端口切换阀(300)的系统的情况下，可以通过将捕集柱(370)放置在试样环管315或320中来控制并流/逆流配置。或者，可以通过将第二分离单元的上游子单元40A和下游子单元40B的连接端口切换到接口流体传送路线单元来改变并流/逆流配置。
图4A描绘了与第一分离单元20和第二分离单元40A和40B接口的示例性第一流体传送路线单元30的示意图。在这种情况下，接口流体传送路线单元包含传送路线结构400，其在一种变型中是2-位/10-端口切换阀，其包含多个端口405A-405J、多个通道410A-410E和两个试样环管415和420。如图4A中所示，在两个可能的配置中的第一个中示出了多个通道410A-410E。
如图4A中所示，第一分离单元20连接至在端口405A处的传送路线结构400。传送路线结构400通过通道410A沿着箭头425指示的方向将第一流动相引导至多个试样环管415中的一个。试样环管415连接至在端口405B和端口405E处的传送路线结构400。试样环管415包含捕集柱430，所述捕集柱包含固定相。
传送路线结构400通过通道410C将第一流动相引导至下游容器440。在一些实施方案中，下游容器440是废物容器。在一些实施方案中，下游容器440是级分收集器。
如图4A中所示，第二分离单元40在端口405C连接至传送路线结构400。传送路线结构400通过两个连接的通道410D和410E将第二流动相引导至试样环管420。试样环管420在端口405J和端口405G连接至传送路线结构400。传送路线结构400通过端口405H连接至第二分离单元的下游子单元40B。传送路线结构400引导第二流动相沿箭头435指示的方向通过第二流体传送路线单元40B的下游部分。
图4B中所示例的示意图描绘了如图4A所示的第一流体传送路线单元的相同配置，除外图4A中的传送路线结构400的多个通道410A-410E现在处于两个可能位置中的第二个，即通道410F-410J，如图4B所示。如图4A和图4B所示，第一分离单元30的传送路线结构400可以被配置为使得通过试样环管415的第一流动相的流动方向(图4A)处于与第二流动相流过同一试样环管415相同的方向(图4B)，由箭头425指示。传送路线结构400的这种示例性配置引导流动相以并流方式流过试样环管415。
在接口流体传送路线单元中使用2-位/10-端口切换阀(400)的系统的情况下，如图4A和图4B中所示，两个试样环管以并流方式配置。然而，通过将第二分离单元的上游子单元40A和下游子单元40B的连接端口切换到接口流体传送路线单元，可以将两个试样环管配置为逆流方式。
图5A描绘了与第一分离单元20和第二分离单元40A和40B接口的示例性第一流体传送路线单元30的示意图。在这种情况下，接口流体传送路线单元包括传送路线结构500，其在一种变型中是2-位/4-端口二重阀，包含多个端口505A-505H、多个通道510A-510D和两个试样环管515和520。如图5A中所示，在两个可能配置中的第一个中示出了多个通道510A-510D。
如图5A中所示例的，第一分离单元20在端口505G连接至传送路线结构500。第一流动相通过第一分离单元20沿箭头525指示的方向被驱动，并且传送路线结构500通过通道510A引导第一流动相通过试样环管520。试样环管520连接至在端口505H和端口505B处的传送路线结构500。传送路线结构500沿箭头535指示的方向引导第一流动相通过试样环管520。试样环管520包含捕集柱530，所述捕集柱包含固定相。
传送路线结构500通过通道510B将第一流动相沿箭头545指示的方向引导至下游容器540。在一些实施方案中，下游容器540是废物容器。在一些实施方案中，下游容器540是级分收集器。
如图5A中所示，第二分离单元的上游子单元40A连接至在端口505E的传送路线结构500。第二流动相通过第二分离单元40A沿箭头550指示的方向被驱动，并且传送路线结构500通过通道510C将第二流动相引导至试样环管515。试样环管515连接至在端口505F和端口505C处的传送路线结构500，其中第一流动相沿箭头555指示的方向行进。试样环管515包含捕集柱560，所述捕集柱包含固定相。传送路线结构500通过端口505D连接至第二分离单元的下游子单元40B。传送路线结构500沿着箭头565指示的方向引导第二流动相通过第二分离单元的下游子单元40B。
在一些实施方案中，捕集柱530和560包含相同的固定相。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，捕集柱530和560包含不同的固定相。
图5B中所示例的示意图描绘了与如图5A中所示的第一流体传送路线单元的相同配置，除外图5A中的传送路线结构500的多个通道510A-510D现在处于两个可能位置中的第二个，即通道510E-510G，如图5B所示。图5B中的传送路线结构500现在将来自第一分离单元20的第一流动相沿箭头525指示的方向通过通道510E引导至试样环管515。试样环管515连接至在端口505C和端口505F处的传送路线结构500，其中第一流动相通过通道510F沿箭头545指示的方向定向于下游容器540。在图5B中，传送路线结构500引导第一流动相沿与第二流动相通过图5A中同一试样环管515相反的方向流过试样环管515。
如图5B中所示，第二分离单元的上游子单元40A在端口505E处连接至传送路线结构500。第二流动相通过第二分离单元40A沿箭头550指示的方向被驱动，并且传送路线结构500现在通过通道510G将第二流动相引导至试样环管520。试样环管520在端口505B和端口505H处连接至传送路线结构。传送路线结构500沿箭头575指示的方向引导第二流动相流过捕集柱530。在图5B中，传送路线结构500引导第二流动相沿与第一流动相通过图5A中同一试样环管520相反的方向流过试样环管520。
在接口流体传送路线单元中使用2-位/4-端口二重阀(500)的系统的情况下，两个试样环管以逆流方式配置，如图5A和图5B所示。然而，如果期望，可以通过将用于第二分离单元的上游子单元40A和下游子单元40B的连接端口切换到接口流体传送路线单元，可以以并流方式配置两个试样环管。
在一些实施方案中，2D RPLC x SFC系统的第一流体传送路线单元包含至少三个试样环管，并且其中试样环管的至少一个与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。在这样的系统中，一个试样环管与第一分离单元流体连通，一个试样环管与第二分离单元流体连通，并且一个或多个试样环管与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。在一些实施方案中，试样环管的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相。在一些实施方案中，包含捕集柱的至少一个试样环管与第一分离单元和第二分离单元流体隔离，所述捕集柱包含固定相。在一些实施方案中，第一流体传送路线单元包含多个捕集柱，每个捕集柱位于试样环管中。在一些实施方案中，每个捕集柱上装载有相同的固定相材料。在其它实施方案中，固定相材料可适于保留的特定分析物，因此，不同的固定相材料可用于从第一分离单元洗脱的不同级分。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，反相固定相可以包含碳链键合的硅胶。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为18个碳的碳链(即C18反相硅胶或C18硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为8个碳的碳链(即C8-反相硅胶或C8硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为4个碳的碳链(即C4反相硅胶或C4硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核心、例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)结合的碳链(例如C-18、C-8或C-4碳链)。
包含接口流体传送路线单元的系统(其中一个或多个试样环管可以放置在与第一分离单元和所述第二分离单元流体隔离的位置上)提供了一种用于“峰停车”特征。当从第一维度色谱分离和洗脱的多个级分需要在第二维度进一步分离时，从第一分离单元洗脱的级分之间的时间间隔可能不足以用于第一级分运行通过第二分离单元中。而第二分离单元在使用中用于分析的早期级分时，可以在附加环管的捕集柱中采集后期的级分(或截留的级分(cuts))并且保持它们在流体隔离(“停放”)，直到第二分离单元准备分析下一个级分。
参考附图，图6A描绘了与第一分离单元20和第二分离单元40A和40B接口的示例性第一流体路线单元30的示意图。在这种情况下，接口流体传送路线单元包括：第一传送路线结构600，其在一种变型中是2-位/4-双重阀，包含多个端口605A-605H、多个通道610A-610D、一个试样环管615和第二传送路线结构620，其包含多个端口，例如625A-625E、多个试样环管例如630A-630C、多个捕集柱635A-635E和多个通道675A和675B。试样环管630B提供了没有捕集柱的旁路环管。如图6A中所示，在两种可能配置中的第一种中示出了第一传送路线结构600的多个通道610A-610D。
如图6A中所示例的，第一分离单元20在端口605G处连接至传送路线结构600。第一流动相通过第一分离单元20沿箭头640指示的方向被驱动，并且传送路线结构600通过通道610A引导第一流动相通过试样环管615。试样环管615在端口605H和端口605B处连接至第一传送路线结构600。第一传送路线结构600沿箭头645指示的方向引导第一流动相通过试样环管615。如图6A中所示，传送路线结构600通过通道610B将第一流动相沿箭头655指示的方向引导至下游容器650。在一些实施方案中，下游容器650是废物容器。在一些实施方案中，下游容器650是级分收集器。
如图6A中所示，第二分离单元的上游子单元40A在端口605E连接至传送路线结构600。第二流动相通过第二分离单元的上游子单元40A沿箭头660指示的方向被驱动。传送路线结构600通过通道610C将第二流动相沿箭头665指示的方向引导至第二传送路线结构620。第一传送路线结构600和第二传送路线结构620通过端口605F和端口625A连接。
在图6A中，第二传送路线结构620被配置为通过通道675A沿箭头670指示的方向引导第二流动相通过试样环管630B。试样环管630B通过端口625B和端口625E连接至第二传送路线结构620，端口625E通过通道675B连接至端口625D。第二传送路线结构620和第一传送路线结构600通过端口625F和端口605C连接。第二传送路线结构620将第二流动相沿箭头680指示的方向流过第一传送路线结构600。第一传送路线结构600引导第二流动相沿箭头690指示的方向经由通道610D流动通过第二分离单元的下游亚单元40B。
图6A描绘了没有捕集柱与第一分离单元或第二分离单元流体连通的配置。例如，当无感兴趣的峰从第一维度柱出来或在第二维度柱中被分析时，系统可以被设置为这种配置。当两个分离单元中的柱处于空闲状态或柱正在进行再生/平衡时，该系统也可以被设定为这种配置。捕集柱635A-635E中的每一个与第一和第二分离单元流体隔离。
图6B中所示例的示意图描绘了与如图6A中所示的第一流体传送路线单元的相同配置，除外图6A中的第一传送路线结构600的多个通道610A-610D现在处于如图6B中所示的两个可能位置610E-610H的第二个。图6B中的传送路线结构600现在将来自第一分离单元20的第一流动相沿箭头640指示的方向通过通道610E引导至第二传送路线结构620。第一传送路线结构600和第二传送路线结构620连接在端口605C和端口625F。此外，在图6B中，第二传送路线结构620现在被配置为沿箭头705指示的方向引导第一流动相的流动通过试样环管630A。试样环管630A包含捕集柱635A。试样环管630A通过端口625F和端口625C连接至第二传送路线结构620。如图6B中所示，第二传送路线结构620和第一传送路线结构600通过端口625A和端口605F连接。第二传送路线结构620引导第一流动相沿箭头710指示的方向到达第一传送路线结构600。第一传送路线结构600引导第一流动相沿箭头655指示的方向通过通道610F到达下游容器650。在一些实施方案中，下游容器650是废物容器。在一些实施方案中，下游容器650是级分收集器。在一些实施方案中，可以使用Flexcube(Agilent)用作第二传送路线结构的一部分。
在一些实施方案中，图6B所示的第一流体传送路线单元30的配置可以用于引导从第一分离单元洗脱的样品的一部分被选择性地保留在捕集柱上，例如635A。在一些实施方案中，捕集柱可包含固定相。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，反相固定相可以包含碳链键合的硅胶(例如C18硅胶、C8硅胶和C4硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核心、例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)结合的碳链(例如C-18、C-8或C-4碳链)。
在捕集柱例如635A上保留了峰之后，传送路线结构600和620可被切换或设置为允许进行洗脱和进一步分析保留峰的位置，例如图6C中所示；或传送路线结构600和620可以被切换或设置为允许在捕集柱635A上保留的峰停放以及在不同捕集柱(例如635B)上采集另一个峰的位置，如图6D中所示。
图6C中所示例的示意图描绘了第一流体传送路线单元30的示例性配置，其中第一传送路线结构600被配置为将第一流动相引导流至下游容器650，如图6A所示。如图6C中所示例的，第一流动相通过第一分离单元20沿箭头640指示的方向被驱动，并且传送路线结构600通过通道610A引导第一流动相通过试样环管615。试样环管615在端口605H和端口605B处连接至第一传送路线结构600。第一传送路线结构600沿箭头645指示的方向引导第一流动相通过试样环管615。如图6A中所示，传送路线结构600引导第一流动相沿箭头655指示的方向通过通道610B到达下游容器650。在一些实施方案中，下游容器650是废物容器。在一些实施方案中，下游容器650是级分收集器。
在图6C中，第一传送路线结构600将第二流动相流动沿箭头665指示的方向引导至第二流体传送路线结构620。第二传送路线结构620被配置为将第二流动相沿箭头715指示的方向通过通道675D引导至试样环管635A。试样环管635A通过端口625C和端口625F连接至第二流体传送路线结构。第二流体传送路线结构620被配置为沿箭头680指示的方向通过通道675C将第二流动相的流动引导至第一流体传送路线结构600。第二流体传送路线结构和第一流体传送路线结构通过端口625D和605C连接，并且第二流动相沿箭头690指示的方向通过通道610D被引导至第二分离单元的下游部分40B。
图6D中所示例的示意图描绘了与如图6B中所示的第一流体传送路线结构600和第二流体传送路线结构620的相同配置，除外在图6D中，第二流体传送路线结构现在引导第一流动相流动沿箭头720指示的方向到达试样环管630C。试样环管630C通过端口625G和端口625H连接至第二流体传送路线结构。通道675F连接端口625A和端口625G。通道675E连接端口625D和端口625H。如图6B所示，试样环管630C包含捕集柱635B，捕集柱635B可以包含固定相，例如本文所述的固定相。
如图6D中所示例的，从第一分离单元洗脱并且选择性地保留在捕集柱635A上的样品的部分现在与第一分离单元20和第二分离单元40A和40B隔离。
在一些实施方案中，多个捕集柱635A-635E、如图6A-图6D中所示可以包含相同的固定相。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，例如图6A-图6D中所示的多个捕集柱635A-635E中的至少一个可以包含与在第一维度RPLC柱中使用的固定相材料相同的固定相。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，反相固定相可以包含碳链键合的硅胶。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为18个碳的碳链(即C18-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为8个碳的碳链(即C8-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链的键合硅胶可以包含长度为4个碳的碳链(即C4-反相硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核心、例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)结合的烃链(例如C-18、C-8或C-4链)。
2D色谱可以在中心切割、假拟综合或综合模式下进行。中心切割提供了色谱图选定区域的表征，而综合模式提供了整个色谱图的表征。假拟综合模式提供了色谱图的所选区域的全面分离。参见Venkatramani，C.J.等人，J.Sep.Sci.2014，22，印刷中。2D RPLC xSFC系统中的接口，即第一流体传送路线单元，可适用于以中心切割、假拟综合和综合模式的任意一种或多种进行。例如，具有如图3-6中所示的任何接口流体传送路线单元的2DRPLC x SFC系统可以用于中心切割模式。具有如图5A和5B中所示的包含两个试样环管(各种具有捕集柱)的接口流体传送路线单元的系统可以用于假拟综合模式，条件是与第一维度中的流动相的慢流速相结合的长RPLC柱在将允许在第二维度分离中完全运行一个级分，而在第二个试样环管中收集另一个级分。具有如图6A-6D中所示的采样停车特征的界面流体传送路线单元的系统可以以综合模式或假拟综合模式使用，因为可以收集来自第一维度分离的多个级分，并保留以便当第二分离单元可用时用于第二维度中的后续分析。
第二维度中的分离标准可以取决于所分离的分析物的性质。SFC柱可能需要不同的固定相材料，以便为从第一维度RPLC柱洗脱的各种分析物提供最佳分离。因此，提供了本文所述的2D RPLC x SFC色谱系统，其中第二分离单元包含SFC柱阵列，其中该阵列中的SFC柱以平行配置排列；以及第二流体布线单元，其用于引导第二个流动相流动至阵列中期望的(或预先鉴定的)SFC柱。在一些实施方案中，第二分离单元还包含位于SFC柱阵列中的每个SFC柱的上游的聚焦柱。在一些实施方案中，聚焦柱包含固定相。在一些实施方案中，固定相可以包含反相固定相。在一些实施方案中，反相固定相可以包含碳链键合的硅胶。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为18个碳的碳链(即C18-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为8个碳的碳链(即C8-反相硅胶)。在一些实施方案中，碳链键合的硅胶可以包含长度为4个碳的碳链(即C4-反相硅胶)。在一些实施方案中，反相固定相可以包含与聚合物核结合的烃链(例如C-18、C-8或C-4链)，例如有机聚合物(例如聚苯乙烯)。
参考附图，图7A和图7B是包含第二流体传送路线单元800和SFC柱阵列的第二分离单元的示例性下游子单元40B的示意图。第一流体传送路线单元30在端口805A连接至第二流体传送路线单元800。第一流体传送路线单元30沿箭头810指示的方向将第二流动相引导至第二传送路线单元800。第二传送路线单元800包含多个端口、例如端口805A和端口805B以及多个通道、例如810A。如图7A中所示，第二流体路线单元800将第二流动相沿箭头825指示的方向引导至期望的(或预先鉴定的)SFC柱815A。任选地，聚焦柱820A位于SFC柱815A的上游。
在一些实施方案中，传送路线结构830任选地位于SFC柱的下游。如图7A中所示，传送路线结构830沿箭头835指示的方向通过通道810B将第二流动相引导至检测器250。
图7B描绘了与如图7A中所示相同的SFC柱阵列，但是在图7B中，第二流体路线单元800被配置为将第二流动相从第一流体路线单元引导至第二期望的SFC色谱柱815B。如图7B中所示，第二期望的SFC色谱柱通过端口805E和端口805F连接至第二流体传送路线单元800和传送路线结构830。第二流体路线单元800沿箭头840指示的方向引导第二流动相。任选地，聚焦柱820B位于SFC柱815B的上游。
在一些实施方案中，SFC柱阵列包含多个SFC柱，其中单独的SFC柱(例如815A)可以包含与阵列中的至少一个其它单独SFC柱相同的固定相，例如815B。在一些实施方案中，SFC柱阵列包含多个SFC柱，其中单个SFC柱(例如815A)可以包含与阵列中的所有其它单独SFC柱不同的固定相，例如815B。在一些实施方案中，固定相可以包含正相固定相。在一些实施方案中，正相固定相为二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用丙基氰官能团二氧化硅修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用氨基丙基官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用乙基吡啶官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用磺酸和/或苯基官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是用1，2-二羟丙基丙基醚官能团修饰的二氧化硅。在一些实施方案中，正相固定相是聚合物，例如用官能团(例如氰基丙基、氨基丙基、乙基吡啶、磺酸、苯基或1，2-二羟丙基丙醚官能团)修饰的有机聚合物(例如聚苯乙烯)。
在一些实施方案中，SFC柱阵列包含多个聚焦柱，其中单个聚焦柱(例如820A)可以包含与该阵列中的至少另一个单独的聚焦柱相同的固定相，例如820B。在一些实施方案中，SFC柱阵列包含多个聚焦柱，其中单个聚焦柱(例如820A)可以包含与该阵列中的所有其它单独聚焦柱不同的固定相，例如820B。
图8A和图8B描绘了具有涉及电子控制的2-位/4-端口二重阀V1和捕集柱阱1的界面的示例性2D LC-SFC系统的示意图。来自泵1的流动相流经注射器到反相主柱。检测后洗脱液D1流至取样阀V1。在原位/分析位置，主柱洗脱液流经试样环管环管1出口排出废物。来自SFC泵的流动相流经捕集柱阱1-SFC柱(图8A)。这样可以决定捕集陷阱1和SFC柱的条件。流动相不间断流过主柱和辅助柱。当感兴趣的成分从主柱洗脱时，阀V1被转换(俘获位置)，将主柱洗脱液转移到捕集柱阱1(图8B)。将阀V1切换原位/分析位置，从捕集柱T1-SFC柱中冲洗样品成分。使用UV检测器D2和/或质谱仪监测SFC柱分离。SFC泵和阀V1的交替位置会在阀切换期间产生逆流。
在涉及二维中的重复梯度的2D色谱中，将主柱洗脱液转移(采样)到辅助柱中的频率取决于辅助柱的拆分速度，包含再平衡时间。在2DLC-SFC中，二维分离持续约2-3分钟，从而限制了将主柱洗脱液转移到辅助柱的频率。如果在2-3分钟内从主柱洗脱多个分析物级分(例如包含立体异构体混合物的样品中的非对映异构体对)，则具有图8A和图8B中所示的单一捕集柱的2D LC-SFC界面可能不切实际。降低主柱流速和梯度以补偿辅助柱速度的采样需求是一个选择。然而，这将导致峰形差，且由此排除同时的非手性/手性分析。这将需要与多个捕集柱的接口来满足辅助柱的采样需求。
图9显示了使用捕集柱和辅助SFC柱阵列的界面的示例性2D LC-SFC系统的示意图。这种配置用于分析色谱图的多个部分。在图9中所示的原位/分析位置，来自检测后主柱的洗脱液流经全自动的2-位/4-端口二重阀V1排出废物(exciting to waste)。SFC流动相流程如下：SFC泵通过阀V1，到达停车甲板阀V2，返回到阀V1，然后到SFC柱。在阀V2中，SFC流动相流经旁路管或捕集柱阵列。这样可以调节阱和SFC柱。流动相通过主柱和辅助柱不间断流动。当感兴趣的成分从主柱洗脱时，阀V1被切换(主转移)，将主柱洗脱液转移到停放甲板阀V2(出)。通过在旁路模式和俘获位置之间向后和向前切换停车甲板阀V2，将成分转移到不同的捕集柱。在转移主柱洗脱液之后，将阀V1切换到原位，从而将主柱洗脱液转移到废液中。这样可以使进入阀V2的流动相的流向反转(V2-出到V2-进)。停车甲板阀V2中SFC流动方向相反。随后将保留在捕集柱中的成分反冲洗入SFC柱或SFC柱阵列，以便根据应用的不同进一步分离。SFC柱阵列为系统提供了额外的灵活性，因为在单一手性固定相上拆分不同的成分可能不切实际。使用UV或MS检测器监测辅柱分离。自动化界面是2D LC-SFC系统的关键组件，可在单一色谱运行中同时对样品进行非手性、手性分析。
应当预期和理解，在2D色谱系统中，本文所述的第一分离单元的每个和每一变型可以与本文所述的第二分离单元的每个和每一变型和/或本文所述的第一流体传送路线单元每个和每一组合进行组合，如同每个和每一组合被单独描述一样。例如，在一些实施方案中，提供了2D色谱系
统，包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入到第一分离单元的加样注射器；
c)反相液相色谱(RPLC)柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)超临界流体色谱(SFC)柱；和
c)第二检测器；
和
(iii)包含多个试样环管的第一流体传送路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至所述第一分离单元和所述第二分离单元，
其中所述多个试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包
含固定相；
且
其中该色谱系统被配置用于首先分离第一分离单元中的样品，且然后将从RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。
在一些实施方案中，提供了2D色谱系统，包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入到第一分离单元的加样注射器；
c)反相液相色谱(RPLC)柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)超临界流体色谱(SFC)柱；和
c)第二检测器；
(iii)包含两个试样环管的第一流体路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至第一分离单元和第二分离单元，
其中所述试样环管中的一个与第一分离单元流体连通，并且所述
试样环管中的另一个与第二分离单元流体连通；
并且其中试样环管的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含C-18固定相(例如C-18二氧化硅)；
和
(iv)至少一个控制装置，其可操作地连接至以下的一个或多个：
a)第一泵组件；
b)加样注射器；
c)第一检测器；
d)第一流体传送路线单元；
e)第二泵组件；和
f)第二检测器；
且
其中该色谱系统被配置用于首先分离第一分离单元中的样品，且
然后将从RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。
在一种变型中，2D色谱系统还包含至少一个可操作地连接至以下一个或多个的控制装置：a)第一泵组件；b)加样注射器；c)第一检测器；d)第一流体传送路线单元；e)第二泵组件；和f)第二检测器。
在一些实施方案中，提供了2D色谱系统，包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入第一分离单元的加样注射器；
c)包含C-18固定相(例如C-18二氧化硅)的RPLC柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)包含正相固定相的SFC柱；和
c)第二检测器；
(iii)包含至少三个试样环管的第一流体路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至所述第一分离单元和所述第二分离单元，
其中所述试样环管中的一个与所述第一分离单元流体连通，所述试样环管中的另一个与所述第二分离单元流体连通，并且所述试样环管中的至少一个与所述第一分离单元和第二分离单元流体隔离；
并且其中试样环管的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含C-18固定相(例如C-18二氧化硅)；
和
(iv)至少一个控制装置，其可操作地连接至以下的一个或多个：
a)第一泵组件；
b)加样注射器；
c)第一检测器；
d)第一流体传送路线单元；
e)第二泵组件；和
f)第二检测器；
且
其中色谱系统被配置用于首先分离第一分离单元中的样品，然后将从RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。
在一种变型中，第二分离单元包含：a)SFC柱阵列，其中该阵列中的SFC柱以平行配置排列；和b)第二流体传送路线单元，用于将第二流动相的流动引导至阵列中期望的(或预先鉴定的)SFC柱。在另一种变型中，第二分离单元还包含位于SFC柱上游的聚焦柱(例如，包含C-18固定相材料(例如C-18二氧化硅)的聚焦柱)。
在一些实施方案中，提供了2D色谱系统，包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入第一分离单元的加样注射器；
c)RPLC柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)SFC柱阵列，其中该阵列中的SFC柱以平行配置排列；
c)第二流体传送路线单元，用于将第二流动相的流动引导至阵列中期望的(或预先鉴定的)SFC柱；和
c)第二检测器；
和
(iii)包含至少三个试样环管的第一流体路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至所述第一分离单元和所述第二分离单元，
其中所述试样环管中的一个与第一分离单元流体连通，所述试样环管中的另一个与第二分离单元流体连通，并且所述试样环管中的至少一个与所述第一分离单元和第二分离单元流体隔离；
并且其中所述试样环管的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；
且
其中色谱系统被配置用于首先分离第一分离单元中的样品，然后将从RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。
在一些变型中，RPLC柱包含C-18固定相(例如C-18二氧化硅)。在一些变型中，SFC柱包含正相二氧化硅固定相。在一些变型中，该系统还包含至少一个控制装置，其可操作地连接至以下中的一个或多个：
a)第一泵组件；
b)加样注射器；
c)第一检测器；
d)第一流体传送路线单元；
e)第二泵组件；和
f)第二检测器。
本发明的2D RPLC x SFC系统通过使用捕集柱解决与第一维RPLC中使用的溶剂的不相容性和第二维度SFC相关的问题。捕集柱中的固定相保留分析物，同时使来自RPLC的溶剂流过。这样可以使分析物浓缩在小体积中，以便注入SFC以进一步分离。SFC维度中较高的含水量会降低分辨率/灵敏度。如实施例2中所示，使用没有捕集柱的系统，只有少部分可以被转移到SFC柱，而不会对SFC分析的分辨率和灵敏度产生不利影响(图11)。12μL转移体积导致第二个峰的轻微增宽。当转移24μL级分时，观察到第二个峰的显著增宽，这转化为显著的灵敏度损失。相反，如实施例3中所示，当使用具有包含C-18固定相材料(例如C-18二氧化硅)的捕集柱的如图8A和8B中所示的系统时，转移160μL窗口，并且得到极佳的分辨率和灵敏度(图12)。该系统允许将峰从第一维度RPLC注射到第二维度SFC，其中对SFC分析的分辨率和灵敏度影响最小。例如，实施例5比较了使用本发明的常规SFC系统和2DLC-SFC系统将手性药物物质与其对映异构体的分离。结果表明，与常规SFC相比，2D LC-SFC中的分辨率和灵敏度均得到保持。由于多维系统的倍增峰容量，所以两维度中的正交方法、反相和正相条件可用于增加HPLC峰纯度评价的置信水平。
使用方法
开发2D系统时需考虑的另一个因素是在线模式下运行的能力。这种方法的一些优点包含易于自动化、分析的可重复性和从第一维度到第二维度精确地传递级分，而没有任何收率损耗或污染。
2D系统被忽视的应用是在高流通量分析中的应用。在制药行业，例如，根据ICH指南，必须对活性药物成分(API)进行全面表征。参见
International Conference on Harmonisation(2006)，Q3A(R2)：Impurities inNew Drug Substances。对于纯度分析，开发了两种独立的分析方法。RPLC方法通常评估非手性纯度(杂质和相关物质方法)，以及用于评价手性纯度(不期望的对映异构体的量)的手性方法。可以同时产生非手性和手性结果的2D系统将在API过程开发过程中产生巨大的影响。样品制备、色谱分析次数和数据分析将减少，以允许更高的流通量分析。
我们预先报道了使用2D RPLC x RPLC分析同时进行非手性-手性分析(J.Sep.Sci.2012，35：1748)。然而，在API世界中，大多数手性方法是NPLC方法，因此，2DRPLC x NPLC系统将在同时实现非手性-手性分析方面具有重要意义。如上所述，反相和正相流动相的不相容性将使得该方法非常具有挑战性。超临界流体色谱法是一种正相技术，其也用于分析和制备规模的API手性分析。除了作为“绿色”技术之外，由于其通用性、更高的效率、更高流通量和更快的分析时间，SFC优于NPLC。超临界流体具有低粘度和高扩散性(类似于气体)，以允许更高的流速和更快的再平衡时间，并且具有高密度(类似于液体)以提供高溶剂化能力。Cortes等人于1992年报道了第一个在线2D LC x SFC(J.Microcol。9月1992，4：239-244)。Cortes等人开发的界面相当复杂并且涉及多个阶段：通过氮气消除第一维度溶剂，使用加压CO2将分析物转移到冲击器界面上，且然后通过二氧化碳流动相的压力编程将分析物从冲击器界面洗脱至SFC毛细管柱。由于溶剂消除步骤，采用该常规2D RPLCx SFC分离的界面将受到限制。Cortes等人使用THF(相对低沸点，66℃)作为LC流动相，而大多数常规的RPLC分离是基于水的。
本发明展示了一种新的自动化接口来偶合RPLC和SFC。因此，提供了使用本文描述的2D RPLC x SFC色谱系统的方法来分离和分析样品，例如可能难以通过1D色谱法或其它2D色谱法进行综合分析的复杂样品混合物。
在一些实施方案中，提供了使用本文所述的色谱系统分析样品(例如复杂样品)的方法，其包含：首先通过反相液相色谱(RPLC)将复杂样品分离成级分；并进一步通过第二维度中的超临界流体色谱(SFC)分离来自RPLC维度的级分。第一维度中的分离(例如C-18固定相上的RPLC)依赖于复杂样品中成分的某些特征或特性的差异(例如疏水性)；而在第二维度中的分离(例如在正相硅胶上的SFC凝胶固定相)依赖于成分的其它属性或特性的差异(例如手性)，从而提供比使用一维度色谱法更好的综合分析。
当潜在的立体异构体的数量随着手性中心数量的增加(立体异构体数＝2N，其中N是化合物中的手性中心数)而显著增加时，开发具有多个手性中心的化合物的手性色谱方法可能是具有挑战性的。手性方法开发大多是一个试验和错误过程，其中进行了广泛的柱和流动相筛选以鉴定潜在的命中数。然而，由于立体异构体数量的显著增加，开发具有3个或更多个手性中心的化合物的手性色谱方法可能是非常具有挑战性的。对于具有多个手性中心的药物化合物，一种常见的做法是控制进入的原料的对映体纯度，并显示过程控制(差向异构化的可能性)。这将限制最终API中潜在的立体异构体的数量。然而，这一控制策略可能受到一些监管结构的质疑，这些监管结构要求开发API手性方法。
本发明的在线2D RPLC x SFC允许对药物样品同时进行非手性和手性分析(通过单一样品注射或在相同的分析运行中进行分析)。在水和有机物内含物的混合物中的API峰将保留在小体积C-18捕集柱上，且然后被反冲洗到第二维度SFC柱上。因此，在一些实施方案中，提供了使用本文所述的色谱系统对包含立体异构成分的混合物的样品进行非手性-手性分析的方法，其包含：通过在第一维度中的RPLC拆分样品中的非对映异构体成分，这提供样品的非手性纯度；以及在相同分析允许条件下通过在第二维度中的SFC拆分对映异构体对，这进一步提供样品中成分的手性纯度(％对映异构体过量)。样品的非手性纯度可以基于来自RPLC分离的色谱图确定，例如通过在第一分离单元的UV检测器上获得的色谱图上的峰的相对峰面积来确定。每个对映异构体对的手性纯度或对映异构体过量可以基于SFC分离的色谱图确定，例如根据在第二分离单元的UV检测器上获得的色谱图上的峰的相对峰面积或连接至第二分离单元的MS光谱仪上获得的总离子色谱图来确定。
应当预期和理解，可以将2D色谱系统的每个和每一实施方案用于分析复杂样品的方法中或同时进行非手性-手性分析的方法中，就如同每个和每一组合被单独描述一样。例如，在一些实施方案中，提供了使用2D色谱系统对包含立体异构体成分的混合物的样品同时进行非手性-手性分析的方法，所述2D色谱系统包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入第一分离单元的加样注射器；
c)反相液相色谱(RPLC)柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)超临界流体色谱(SFC)柱；和
c)第二检测器；
和
(iii)包含多个试样环管的第一流体传送路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至所述第一分离单元和所述第二分离单元，
其中所述多个试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；
该方法包含：首先通过RPLC在第一分离单元上拆分样品中的非对映体成分，且然后在同一分析试验中通过SFC在第二分离单元上拆分对映异构体对。
在一些实施方案中，提供了使用2D色谱系统对包含立体异构体成分的混合物的样品同时进行非手性-手性分析的方法，所述2D色谱系统包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入第一分离单元的加样注射器；
c)RPLC柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)SFC柱阵列，其中该阵列中的SFC柱以平行配置排列；
c)第二流体传送路线单元，其用于将第二流动相的流动引导至阵列中期望的(或预先鉴定的)SFC柱；和
d)第二检测器；
和
(iii)包含至少三个试样环管的第一流体路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至所述第一分离单元和所述第二分离单元，
其中所述试样环管中的一个与上述第一分离单元流体连通，所述试样环管中的另一个与第二分离单元流体连通，并且所述试样环管中的至少一个与第一分离单元和第二分离单元流体隔离；
并且其中所述试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；
该方法包含：首先通过RPLC在第一分离单元上拆分样品中的非对映体成分，且然后在同一分析试验中通过SFC在第二分离单元上拆分对映异构体对。
在一些实施方案中，提供了使用2D色谱系统对包含立体异构体成分的混合物的样品同时进行非手性-手性分析的方法，所述2D色谱系统包含：
(i)第一分离单元，包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入第一分离单元的加样注射器；
c)RPLC柱；和
d)第一检测器；
(ii)第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；
b)SFC柱；和
c)第二检测器；
(iii)包含至少三个试样环管的第一流体路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至所述第一分离单元和所述第二分离单元，
其中所述试样环管中的一个与所述第一分离单元流体连通，所述试样环管中的另一个与所述第二分离单元流体连通，并且所述试样环管中的至少一个与所述第一分离单元和第二分离单元流体隔离；
并且其中所述试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；
和
(iv)至少一个控制装置，其可操作地连接至以下的一个或多个：
a)第一泵组件；
b)加样注射器；
c)第一检测器；
d)第一流体传送路线单元；
e)第二泵组件；和
f)第二检测器；
该方法包含：首先通过RPLC在第一分离单元上拆分样品中的非对映体成分，且然后在同一分析试验中通过SFC在第二分离单元上拆分对映异构体对。
方法
在另一个方面，提供了一种通过多维色谱(例如2D RPLC×SFC)分离样品的方法，包含对俘获在捕集柱上的一部分样品进行处理，所述部分通过反相液相色谱法(RPLC)分离样品而获得，所述捕集柱包含固定相，以便通过超临界流体色谱(SFC)进一步分离。在一些实施方案中，提供了一种用于分离样品的方法，包含以下步骤：(i)在俘获柱上俘获至少一部分样品，所述部分通过反相液相色谱法(RPLC)分离样品而获得，所述捕集柱包含固定相；和(ii)通过超临界流体色谱(SFC)使捕集在捕集柱上的样品的部分进一步分离。
在一些实施方案中，该方法还包含通过反相液相色谱(RPLC)分离样品的步骤，包含：(i)将样品导入第一流动相；(ii)驱动含有样品的第一流动相通过RPLC柱；和(iii)在RPLC柱上分离样品。在一些实施方案中，该方法还包含在通过RPLC柱之后检测在第一流动相中样品成分的存在。在一些实施方案中，该方法还包含从捕集柱上洗脱捕集柱上俘获的样品的部分。在一些实施方案中，该方法还包含在进一步分离后通过SFC检测样品的成分。
在一些实施方案中，该方法还包含将捕集柱定位在RPLC柱下游的第一流动相的流动路径中，以俘获由RPLC柱分离的样品的至少一部分，和/或将携带俘获部分的捕集柱切换至第二流动相的流动路径，用于从捕集柱洗脱下俘获的部分。RPLC/SFC单元的流动相的流动路径的捕集柱进/出定位/切换可以在与2D RPLC x SFC色谱系统中的RPLC单元和SFC单元接口的流体传送路线装置中进行该装置接口。
在一些实施方案中，该方法可以在2D RPLC x SFC色谱系统上进行，配置该系统用于俘获在捕集柱上的分析物的逆流洗脱。在这种变型中，第一流动相在第一方向上流经捕集柱，并且俘获在捕集柱上的部分样品通过使第二流动相沿与第一方向相反的方向流过捕集柱而从捕集柱被洗脱出来。在一些实施方案中，该方法可以在2D RPLC x SFC色谱系统上进行，配置该系统用于并流洗脱捕集柱上俘获的分析物。在这种变型中，第一流动相在第一方向上流经捕集柱，并且俘获在捕集柱上的部分样品通过使第二流动相沿与第一个方向相同的方向流过捕集柱而从捕集柱被洗脱出来。
在一些实施方案中，提供了用所述的多维色谱(例如本文所述的2DRPLC×SFC色谱系统或其任何变化形式)分离样品的方法，其包含以下步骤：
(i)将样品导入第一流动相中；
(ii)驱动包含样品的第一流动相通过RPLC柱；
(iii)在RPLC柱上分离样品；
(iv)在通过RPLC柱后检测第一流动相中样品成分的存在；
(v)在第一捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少第一部分，所述第一捕集柱包含固定相；
(vi)将在第一捕集柱上俘获的样品的第一部分从第一捕集柱上洗脱出来；
(vii)通过SFC对第一捕集柱上俘获的样品的第一部分进行进一步分离；和
(viii)在进一步分离后通过SFC检测样品的成分。
在2D色谱的某些情况下，例如在综合或假拟综合模式中，可以将俘获来自第一维度RPLC的一个以上的级分俘获在一个或多个捕集柱上，并在第二维度SFC中释放用于分析。因此，在一些实施方案中，该方法还包含以下步骤：
(ix)在第二捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少第二部分，所述第二捕集柱包含固定相；
(x)将俘获在第二捕集柱上的样品的第二部分从第二捕集柱洗脱出来；
(xi)通过SFC对俘获在第二捕集柱上的样品的第二部分进行进一步分离。
这些步骤可以重复多次以俘获/释放多个级分。
在一些实施方案中，提供了使用多维色谱(例如本文所述的2D RPLCx SFC色谱系统或其任何变化形式)分离样品的方法，包含以下步骤：
(i)将样品导入第一流动相中；
(ii)驱动包含样品的第一流动相通过RPLC柱；
(iii)在RPLC柱上分离样品；
(iv)在通过RPLC柱后检测第一流动相中样品成分的存在；
(v)将捕集柱定位在RPLC柱下游的第一流动相的流动路径中；
(vi)在捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少一部分，所述捕集柱包含固定相；
(vii)将携带俘获部分的捕集柱切换到第二流动相的流动路径；
(viii)将从捕集柱上俘获的样品的部分从捕集柱上洗脱出来；
(ix)通过SFC对俘获在捕集柱上的样品的一部分进行进一步分离；和
(x)通过SFC进一步分离后检测样品的成分。
在一些实施方案中，步骤(i)至(x)按照列出的顺序进行。在一些实施方案中，重复步骤(iv)至(x)一次或多次，直到所有感兴趣的级分得到分析为止。
在这些实施方案的一些中，RPLC柱包含反相固定相，例如，包含反相材料例如C-18相(例如C-18二氧化硅)、C-8相(例如C-8二氧化硅)、C-4相(例如C-4二氧化硅)或本文所述的其它反相材料的固定相。在这些实施方案的一些中，捕集柱中的固定相包含反相材料，例如C-18相(例如C-18二氧化硅)、C-8相(例如C-8二氧化硅)、C-4相(例如C-4二氧化硅)或本文所述的其它反相材料。
在这些实施方案的一些中，SFC分离在包含正相固定相的SFC柱上进行，例如包含正相硅胶或本文所述的其它正相材料的固定相。在这些实施方案的一些中，SFC分离在选自平行配置的SFC柱的阵列的SFC柱上进行，该阵列中的每个SFC柱可以包含可以相同或不同的固定相。SCF柱中的固定相材料可以适于分离样品中的特定成分。
在这些实施方案中的一些中，该方法还可以包含在SFC柱上进一步分离之前，将俘获在捕集柱上的级分洗脱的分析物集中于聚焦柱上。聚焦柱包含固定相，其可以与捕集柱中使用的固定相相同，也可以不同。在一些实施方案中，聚焦柱装载了包含反相材料例如本文所述的C-18相、C-8相、C-4相或其它反相材料的固定相。
用于分离本文所描述的样本的方法可以适用于本文描述的2D RPLC xSFC色谱系统或其所描述的任何实施方案或其变化形式。
实施例
提供以下实施例来示例而不是限制本发明。
化学品和试剂
二氧化碳(CO2)得自Praxair(Danbury，CT，USA)。乙腈(ACN)购自Avantor’sJ.T.Baker(Center Valley，PA，USA)。甲醇(MeOH)、异丙醇(IPA)、乙醇(EtOH)、98.0％-100.0％甲酸和28.0％-30.0％氢氧化铵(NH4OH)购自EMD chemicals(Gibbstown，NJ，USA)。甲酸铵购自SigmaAldrich(St.Louis，MO，USA)。HPLC级微孔水得自Purelab超微孔水分配器。反式茋氧化物(TSO)购自TCI(Tokyo，Japan)。本研究中使用的药物物质A由Genentech，CA，USA的加工化学系合成。
实施例1-仪器
分析仪器是带有来自Agilent Technologies(Santa Clara，CA，USA)的质谱仪的Agilent Technologies(Santa Clara，CA，USA)定制的二维12602D-LC-SFC系统。RPLC单元由Agilent 1260四元泵(G1311B)、1260HiPALS自动进样器(G1367E)和Agilent 1260多波长紫外检测器(G1365C)组成。由于高压考虑，整个系统都使用不锈钢管件和管道。SFC单元由带有三位溶剂控制阀的1260SFC二元泵(G4302A)、1260HiP脱气器(G4225A)、1290恒温柱室(G1316C)、8-位Agilent 1290无限远程阀门驱动器(G1170A)、配备高压流动池的Agilent1260DAD(G1315C)和Agilent 1260无限SFC控制模块(G4301A)组成。SFC流动的一部分定向于Agilent 6120四极MS。使用Agilent 1260Iso泵(G1310B)产生0.15mL/min的补充流量，以补偿scCO2的损耗。安装了Agilent 1290Flexcube(G4227A)，以便能够使用定制的12-端口切换阀在不同的捕集柱上实现多峰停车。仪器控制和数据采集由Agilent Chemstation软件(Santa Clara，CA，USA)完成。
图10是示例性停车甲板阀(例如图9中中所示的阀V2)的摄影图像。如图10中所示，有四个捕集柱可用于峰停车。另外，如图中所示，存在旁路环管，其允许来源于第一分离单元的流动相或来源于第二分离单元的流动相流向下游而不通过捕集柱。
实施例2
这项研究的主要目的在于评价从第一维度向第二维度转移的流动相的体积对第二维度(SFC)中分离的分辨率的影响。此处，使用多维色谱系统分离反式茋氧化物(TSO)的对映异构体。第一维度(RPLC)使用具有无捕集柱的试样环管的阀与第二维(SFC)接口。试样环管用于存储选定体积的第一流动相，其含有从第一维度洗脱的样品的一部分。随后，将存储在试样环管中的第一流动相的体积转移到第二维以便进一步分离。使用允许存储和随后转移6μL、12μL和24μL流动相的试样环管。
对于第一RPLC维度，在0.2mL/min的流速下，在使用90/10ACN/水的等度条件下使用ACQUITY UPLC HSS T31.8μm2.1×50mm柱。UV检测在225nm进行。
对于第二SFC维度，在40℃下使用Chiralcel OD33.0μm4.6mm×50mm柱，其具有95：5scCO2(MPA)/IPA与0.1％NH4OH(MPB)的等度流。流量为4.0mL/min，出口压力为130巴，喷嘴温度为60℃。
用于该实验的俘获环管是弯曲毛细管(0.5mm×150mm，内部体积约29μL)。三次切换时间为分别相当于6μL、12μL和24μL转移体积(基于0.2mL/min的流速)的0.03min、0.06min和0.12min。
图11是使用具有三个试样环管配置(6μL、12μL、24μL)的系统的TSO的多维分离的UV吸光度测量(mAU)随时间(分钟)变化的编辑色谱图。如图11中所示，将第一流动相的转移体积增加到第二维度降低了第二维度中的分辨率和灵敏度。
实施例3
在本实施例中，评价了使用包含捕集柱的界面将样品从第一维度(RPLC)转移到第二维度(SFC)的效率。
使用图8A和图8B中所示例的2D LC-SFC系统分析了从0.005mg/mL至0.25mg/ml的TSO标准溶液。第二检测器是UV检测器。基于来自实施例2的结果，评价内部体积低的C18反相捕集柱。
在第一维度中使用的反相色谱仪是来自Waters Corporation(Milford，MA，USA)的AcquityUPLC HSS T3柱(50×2.1mm，1.8μm)。第一维度中的分离在0.2mL/min的流速下、在50：50(50％甲酸水溶液)：0.05％ACN中的甲酸)的等度条件下进行。RPLC柱在40℃下置于SFC热柱室中。在225nm处进行UV检测。第一维度注射体积为5μL。
在第二维度中使用的超临界流体色谱仪是来自Chiral Technologies(WestChester，PA，USA)的Chiralcel OD3柱(50×4.6mm，3.0μm)。在第二维度中的分离在95：5(scCO2)：异丙醇与0.1％氢氧化铵的等度流下进行。使用的柱温为40℃，并且将流速设定在4.0mL/min，出口压力为130巴，喷嘴温度为60℃。SFC柱顶部处使用聚焦柱是可选的。
如上所述，在二维界面中使用了小体积捕集柱。具体地，使用的捕集柱是来自ChromaNik Technologies(Osaka，Japan)的SunShell C18柱(5.0×1.0mm，5μm)。
在50∶50ACN/水中制备TSO标准溶液(0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005mg/mL)。将跨越TSO峰顶点的0.8min(～160μL)的窗口转移到用初始SFC条件(100％scCO2)调节的捕集柱。初始保持在0％(IPA与0.1％NH4OH)，切换后维持第一个0.2min，然后在0.1min内升至5％(IPA与0.1％NH4OH)，保持2.35min。柱用0％(IPA与0.1％NH4OH)再平衡0.2min。样品一式三份运行。在第二维度中的检测通过在225nm处的UV检测进行。
图12是不同浓度的TSO的多维分离的UV吸光度测量(mAU)随时间(分钟)变化的编辑色谱图。在第一维度中分离后测量上部色谱图。观察到TSO标准品的对映异构体在反相主柱中共洗脱。从检测后主柱洗脱出来的峰被转移到捕集柱，并反冲洗入次级柱用于进一步分离。如图12中所示，在第二维度中分离后测量下部色谱图。此处，观察到TSO标准品的对映体为在第二手性柱中拆分的基线。
此外，如图12中所示，叠加图显示了检测器响应在相关系数大于0.99的评价浓度范围内的线性(数据未显示)。在不同的研究中，将10至100μL(通过定时阀V1)的体积转移到次级SFC柱。本研究的结果显示了在评价范围内的线性响应(结果未显示)。
实施例4
在本实施例中，进一步测试实施例3中描述的2D LC-SFC系统，以证明对药物物质A的样品同时进行非手性-手性分析的能力。
在第一维度中使用的反相色谱图是来自Waters Corporation(Milford，MA，USA)的SunFire C18柱(150×3.0mm，3.5μm)，温度为40℃。MPA为5mM甲酸铵，pH 3.3而MPB在ACN中为0.05％甲酸。RPLC柱的MP程序在5分钟内为5％B至25％B，在25分钟内至29％B，30分钟内至90％B，然后在5％B下再平衡5min。将流速设定为1.0mL/min。第一维度UV检测在340nm进行。第一维注射体积为5μL。
在第二维度中使用的超临界流体色谱图是来自Chiral Technologies(WestChester，PA，USA)的Chiralpak IC3柱(50×4.6mm，3μm)，其中温度为40℃，初始MP流量为包含0.1％氢氧化铵(MPB)的65：35scCO2(MPA)/甲醇。流速为4.0mL/min，出口压力为130巴，喷嘴温度为60℃。来自Agilent Technologies(Santa Clara，CA，USA)的四个ZorbaxEclipseXDB-C18柱(5.0x 2.1mm，1.8μm)用作捕集柱。
在具有0.05％FA的25：75ACN/水中以0.5mg/mL制备药物物质A的样品。将跨越顶点的0.1min(100μL)的窗口转移到预调整的捕集柱。将SFC柱维持在等度保持(35％MPB)0.5min，然后在2min分钟内至55％B，保持3min分钟。将柱在35％B下再平衡0.2min。第二维度中的检测通过在565m/z的SIM-MS检测进行。
如图13中所示，非手性和手性纯度结果分别为99.0％和100％对映异构体过量(％ee)。未检测到测定对映体的未标记样品(下部)、具有0.1％不期望的对映异构体的样品(中部)以及具有0.5％不期望的对映异构体的样品(上部)的重叠图显示该系统检测不期望的对映异构体在0.1％的水平的能力。
实施例5
进行本研究以证明在2D LC-SFC系统的第二维度SFC和常规(1D)SFC之间的灵敏度和分辨率的可比性。
2D LC-SFC系统与实施例4中使用的系统相同。流动相程序和切换时间被修改。在第一维度中，流动相程序为25％B，5分钟，25％至90％B，15分钟，然后在25％B下再平衡5分钟。在峰顶的0.1min(100μL)的窗口被转移到捕集柱。常规SFC的条件与2D LC-SFC(在实施例4中描述)的第二维度中使用的条件相同。
使用两种技术(2D LC-SFC和SFC)分析包含不同水平的不期望的对映异构体(0.1-2.0％范围)的药物物质A样品的标准溶液。来自SFC和2DLC-SFC技术的标准色谱图的叠加分别显示在图14A和图14B中。结果示例了用两种技术获得的相差无几的分离。与常规SFC相比，在2D LC-SFC中的分辨率和灵敏度均保留下来。
如实施例2中所示，将反相流动相导入SFC维度不利地影响SFC分离的分辨率和灵敏度。尽管此处描述的2D LC-SFC系统仍将反相流动相导入SFC维度，但是使用捕集柱可以允许不损害下游SFC分离的LC-SFC界面。
实施例6
在本实施例中，显示了在单一分析中期望的灵敏度和选择性的复杂手性色谱分离。
药物物质A具有三个手性中心且由此具有四对非对映体(八个潜在的立体异构体)。在30/70ACN/水中以0.05mg/mL制备4种非对映异构体对的混合物。每对中两种对映异构体的比例(RRS/SRR，SRS/RSR，SSS/RRR；RRS/SSR)约为2∶1。
使用图9中所示的2D LC-SFC系统分离各立体异构体。主柱中的实验条件与实施例4中所述的实验条件相同。使用四个捕集柱与第二维度中的Flexcube(Agilent)一起以俘获4个非对映异构体对。样品注射后，捕集柱用包含0.1％氢氧化铵(MPB)的60∶40scCO2(MPA)/甲醇(MPB)调节1分钟，捕集柱2除外，其用含有0.1％氢氧化铵(MPB)的65∶35scCO2(MPA)/甲醇调节。相当于在10.55min、10.95min、11.80min和13.30min的非对映峰顶点的0.1min(100μL)窗口的主柱洗脱液依次被转移入四个捕集柱中。将俘获的成分在第二维度分别于14.0min、18.0min、23.5min和27.5min依次开始进行色谱。初始保持包含0.1％氢氧化铵(MPB)的60∶40scCO2(MPA)/甲醇，在切换后维持第一个0.5min，然后在2.5min内升至包含0.1％氢氧化铵(MPB)的40∶60scCO2(MPA)/甲醇，保持0.3min，除外俘获的成分2。对于成分2，初始保持在包含0.1％氢氧化铵(MPB)的65∶35scCO2(MPA)/甲醇中，在切换后第一分钟维持1min，然后在3.0min内升至包含0.1％氢氧化铵(MPB)的55∶45scCO2(MPA)/甲醇(MPB)，保持0.3min。第二维度中的检测通过在565m/z的SIM-MS检测进行。
如图15中所示例的，主要的非手性RPLC柱拆分了来自API的四种非对映体对(RSS/SRR，SRS/RSR，RRR/SSS，SSR/RRS)和其它与工艺相关的杂质，从而提供了非手性纯度。然后将这些非对映异构体对中的每一个从主RPLC柱(检测后)依次转移到阀2中的四个不同的捕集柱(V2；图9)。然后将俘获的非对映体级分依次反冲洗并在次级SFC手性柱上进行分析，从而提供手性纯度。通过向次级手性柱提供更简单的样品混合物，可以更有效地拆分潜在的立体异构体。如图15中所示，相当于四个非对映异构体对的八个立体异构体在第二SFC维度上使用MS检测被成功拆分。使用停车甲板阀，2D LC-SFC的应用扩展到具有难以通过常规手性色谱法拆分的多个手性中心的化合物的分析。
实施例7
进行本研究以测试2D LC-SFC系统，其中聚焦柱位于SFC柱的顶部。
2D LC-SFC条件与实施例3中所述的相同。此外，以与实施例3中所述相同的方式制备TSO样品。简言之，TSO标准溶液(0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005mg/mL)在50∶50ACN/水中制备。第一维度注射体积为5μL。此外，对于用聚焦柱完成的那些分析，将聚焦柱放置在SFC柱的顶部。使用的聚焦柱是来自Agilent Technologies(Santa Clara，CA，USA)的Pursuit XR C18(20x 2.0mm，5um)。
图16中显示了使用和不使用聚焦柱的TSO标准品的一系列浓度的2DLC-SFC分离。在两种条件下对TSO对映异构体进行基线拆分。然而，使用聚焦柱，导致峰高v/s峰面积的斜率的增加，从而改善了第二维度(峰1)中的信噪比(S/N)比。对峰2观察到类似的结果(数据未显示)。
示例性实施方案
通过以下实施方案进一步描述本发明。如果适合和切实可行，则所述实施方案各自的特征可以与另外的实施方案的任一项组合。
实施方案1.在一个实施方案中，本发明提供用于分离样品的色谱系统，包含：
第一分离单元，其包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件，
b)用于将样品导入到第一分离单元的加样注射器；和
c)反相液相色谱(RPLC)柱；
第二分离单元，包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件，
和
b)超临界流体色谱(SFC)柱；
和
包含多个试样环管的第一流体传送路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至第一分离单元和第二分离单元，
其中所述多个试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；
且
其中色谱系统被配置用于首先分离第一分离单元中的样品，且然后将从RPLC柱上洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。
实施方案2.在实施方案1的另一个实施方案中，第一流体传送路线单元包含两个试样环管；其中两个试样环管中的一个与第一分离单元流体连通，并且两个试样环管中的另一个与第二分离单元流体连通。
实施方案3.在实施方案1的另一个实施方案中，其中第一流体传送路线单元包含至少三个样品环管，并且其中至少一个样品环管与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。
实施方案4.在实施方案3的另一个实施方案中，包含固定相材料的至少一个试样环管与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。
实施方案5.在实施方案1的另一个实施方案中，第一流体传送路线单元包含多个捕集柱，每个捕集柱位于试样环管中。
实施方案6.在实施方案1-5的任一项的另一个实施方案中，第一流体传送路线单元被配置为当所述试样环管位于与第一分离流体连通时，允许流体沿第一方向流过试样环管，并且当所述试样环管位于与第二分离单元流体连通时，允许流体沿着与第一方向相反的方向流过所述试样环管。
实施方案7.在实施方案1-5的任一项的另一个实施方案中，第一流体传送路线单元被配置为当所述试样环管位于与第一分离单元流体连通时允许流体沿第一方向流过试样环管，并且当所述试样环管位于与第二分离单元流体连通时，允许流体沿与第一方向相同的方向流过所述试样环管。
实施方案8.在实施方案1-7的任一项的另一个实施方案中，RPLC柱包含反相固定相。
实施方案9.在实施方案8的另一个实施方案中，反相固定相包含C-18相(例如C-18二氧化硅)。
实施方案10.在实施方案8或9的另一个实施方案中，捕集柱中的固定相包含反相材料。
实施方案11.在实施方案9的另一个实施方案中，反相材料包含C-18相(例如C-18二氧化硅)。
实施方案12.在实施方案1-11的任一项的另一个实施方案中，第二分离单元包含一个SFC柱。
实施方案13.在实施方案12的另一个实施方案中，SFC柱包含正相固定相。
实施方案14.在实施方案13的另一个实施方案中，正相固定相包含硅胶。
实施方案15.在实施方案1-14的任一项的另一个实施方案中，第二分离单元还包含位于SFC柱上游的聚焦柱。
实施方案16.在实施方案15的另一个实施方案中，所述聚焦柱包含反相材料。
实施方案17.在实施方案1-11的任一项的另一个实施方案中，第二分离单元包含：a)SFC柱阵列，其中该阵列中的SFC柱以平行结构排列；和b)第二流体传送路线单元，用于将第二流动相的流体引导至所述阵列中期望的(或预先鉴定的)SFC柱。
实施方案18.在实施方案17的另一个实施方案中，第二分离单元还包含位于SFC柱阵列中的每个SFC柱的上游的聚焦柱。
实施方案19.在实施方案1-18的任一项的另一个实施方案中，还包含位于RPLC柱下游的第一检测器。
实施方案20.在实施方案1-19的任一项的另一个实施方案中，还包含位于SFC柱下游的第二检测器。
实施方案21.在实施方案1-20的任一项的另一个实施方案中，还包含至少一个可操作地连接至以下一个或多个的控制装置：a)第一泵组件；b)加样注射器；c)第一检测器；d)第一流体传送路线单元；e)第二泵组件；和f)第二检测器。
实施方案22.在一个实施方案中，本发明提供用于分离样品的方法，包含以下步骤：
(i)在捕集柱上俘获样品的至少一部分，所述部分通过反相液相色谱(RPLC)分离样品获得，所述捕集柱包含固定相；和
(ii)通过超临界流体色谱(SFC)对俘获在捕集柱上的样品的部分进行分离。
实施方案23.在实施方案22的另一个实施方案中，还包含用反相液相色谱分离样品，包含：
(i)将样品导入第一流动相中；
(ii)驱动含有样品的第一流动相通过RPLC柱；和
(iii)在RPLC柱上分离样品。
实施方案24.在实施方案23的另一个实施方案中，还包含在通过RPLC柱之后检测在第一流动相中样品成分的存在。
实施方案25.在实施方案22-24的任一项的另一个实施方案中，还包含将捕集柱俘获上的样品的部分从捕集柱上洗脱掉。
实施方案26.在实施方案22-25的任一项的另一个实施方案中，还包含检测通过SFC进一步分离后样品的成分。
实施方案27.在实施方案22-26的任一项的另一个实施方案中，还包含将捕集柱定位在RPLC柱第一流动相下游的流动路径中，用于俘获通过RPLC柱分离的样品的至少一部分。
实施方案28.在实施方案27的另一个实施方案中，还包含将携带俘获部分的捕集柱切换到第二流动相的流动路径，用于从捕集柱上洗脱俘获的部分。
实施方案29.在实施方案28的另一个实施方案中，将捕集柱定位在第一流动相的流动路径中的步骤或将捕集柱切换到第二流动相的流动路径的步骤在与PRLC的流体路径和SFC的流体路径的接口的流体传送路线单元中进行。
实施方案30.在实施方案22-29的任一项的另一个实施方案中，还包含在通过SFC进一步分离之前，再俘获从聚焦柱上的捕集柱上洗脱出来的至少一部分样品。
实施方案31.在实施方案22-30的任一项的另一个实施方案中，第一流动相沿第一个方向流过捕集柱，且俘获在捕集柱上的部分样品从俘获通过使第二流动相以与第一方向相反的方向流过捕集柱从捕集柱上被洗脱出来。
实施方案32.在实施方案22-30的任一项的另一个实施方案中，第一个流动相沿第一个方向流过捕集柱，且俘获在捕集柱上的部分样品通过使第二流动相以与第一方向相同的方向流过捕集柱从捕集柱上被洗脱出来。
实施方案33.在实施方案22的另一个实施方案中，包含下列步骤：
(i)将样品导入第一流动相中；
(ii)驱动包含样品的第一流动相通过RPLC柱；
(iii)在RPLC柱上分离样品；
(iv)在通过RPLC柱后检测第一流动相中样品成分的存在；
(v)在第一捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少第一部分，所述第一捕集柱包含固定相；
(vi)从第一捕集柱上洗脱下在第一捕集柱上俘获的样品的第一部分；
(vii)通过SFC对第一捕集柱上俘获的样品的第一部分进行进一步分离；和
(viii)检测通过SFC进一步分离后样品的成分。
实施方案34.在实施方案33的另一个实施方案中，还包含下列步骤：
(ix)在第二捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少第二部分，所述第二捕集柱包含固定相；
(x)从第二捕集柱上洗脱下俘获在第二捕集柱上的样品的第二部分；
(xi)通过SFC对俘获在第二捕集柱上的样品的第二部分进行进一步分离。
实施方案35.在实施方案22-34的任一项的另一个实施方案中，RPLC柱包含反相固定相。
实施方案36.在实施方案22-35的任一项的另一个实施方案中，捕集柱中的固定相包含反相材料。
实施方案37.在实施方案22-36的任一项的另一个实施方案中，通过SFC的进一步分离在包含正相固定相的SFC柱上进行。
实施方案38.在实施方案22-36的任一项的另一个实施方案中，通过SFC的进一步分离在包含SFC柱阵列的SFC系统上进行。
实施方案39.在实施方案38的另一个实施方案中，SFC柱各自独立地包含正相固定相。
实施方案40.在实施方案39的另一个实施方案中，还包含使捕集柱上俘获的样品的部分按照传送路线至SFC柱以进一步分离，所述SFC柱包含适于分离样品中的成分的固定相。
实施方案40A.在实施方案22的另一个实施方案中，包含使俘获在捕集柱上的样品的部分按照传送路线至SFC柱以用于进一步分离，所述SFC柱包含适于分离样品中的成分的固定相。
实施方案41.在一个实施方案中，本发明提供使用实施方案1的色谱系统分析样品的方法，包含：通过反相液相色谱(RPLC)在第一分离单元上将复杂样品分离成第一组级分；并且在第二分离单元上通过超临界流体色谱(SFC)进一步分离一个或多个级分。
实施方案42.在实施方案41的另一个实施方案中，第一分离单元上通过RPLC的分离部分地基于复杂样品的第一个特征，且在第二分离单元上通过SFC的分离部分地基于复杂样品的第二个特征，所述复杂样品的第二个特征与复杂样品的第一个特征不同。
实施方案43.在实施方案41的另一个实施方案中，所述复杂样品包含立体异构体成分的混合物。
实施方案44.在实施方案43的另一个实施方案中，通过第一分离单元上的RPLC将非对映异构体成分分离为一个或多个级分，所述级分各自包含对映异构体对。
实施方案45.在实施方案44的另一个实施方案中，第一分离单元上通过RPLC的分离部分地基于复杂样品的疏水性。
实施方案46.在实施方案44或45的另一个实施方案中，在第二分离单元上通过SFC进一步将对映异构体对分离为单独的对映异构体。
实施方案47.在实施方案46的另一个实施方案中，第二分离单元上通过SFC的分离部分地基于复杂样品的手性。
实施方案48.在一个实施方案中，本发明提供使用实施方案1的色谱系统对包含立体异构体成分的混合物的样品进行非手性手性分析的方法，包含：在第一分离单元上通过RPLC分离样品中感兴趣的一个或多个非对映体成分；和在相同的分析试验中在第二分离单元上通过SFC分离感兴趣的对映异构体对。
实施方案49.在实施方案48的另一个实施方案中，还包含基于来自RPLC分离的色谱图确定非手性纯度，并且基于来自SFC分离的色谱图确定手性纯度。
将贯穿于始终的全部参考文献例如出版物、专利、专利申请和公布的专利申请以其完整的形式并入本文作为参考。
尽管已经为清楚理解的目的通过示例和实施例在一定程度上详细描述了上述发明，但是本领域技术人员显而易见，可以实施一些小的改变和变型。因此，所述描述和实施例不应当被视为限定本发明的范围。
Claims (47)
1.用于分离样品的色谱系统，其包含：
第一分离单元，其包含：
a)用于驱动第一流动相通过第一分离单元的第一泵组件；
b)用于将样品导入到第一分离单元的加样注射器；和
c)反相液相色谱RPLC柱；
第二分离单元，其包含：
a)用于驱动第二流动相通过第二分离单元的第二泵组件；和
b)超临界流体色谱SFC柱；
其中第二分离单元还包含位于SFC柱上游的聚焦柱；和
包含多个试样环管的第一流体传送路线单元，所述第一流体传送路线单元连接至第一分离单元和第二分离单元，
其中所述多个试样环管中的至少一个包含捕集柱，所述捕集柱包含固定相；
且
其中该色谱系统被配置用于首先分离第一分离单元中的样品，然后将从第一分离单元的RPLC柱洗脱的样品的至少一部分导入第二分离单元。
2.权利要求1的色谱系统，其中第一流体传送路线单元包含两个试样环管；其中两个试样环管中的一个与第一分离单元流体连通，并且两个试样环管中的另一个与第二分离单元流体连通。
3.权利要求1的色谱系统，其中第一流体传送路线单元包含至少三个试样环管，并且其中试样环管的至少一个与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。
4.权利要求3的色谱系统，其中至少一个包含固定相材料的试样环管与第一分离单元和第二分离单元流体隔离。
5.权利要求1的色谱系统，其中第一流体传送路线单元包含多个捕集柱，每个捕集柱均位于试样环管中。
6.权利要求1-5任一项的色谱系统，其中第一流体传送路线单元被配置为当所述试样环管位于与第一分离单元流体连体连通时允许流体沿第一方向流过试样环管，并且当所述试样环管位于与第二分离单元流体连通时，允许流体沿着与第一方向相反的方向流过所述试样环管。
7.权利要求1-5任一项的色谱系统，其中第一流体传送路线单元被配置为当所述试样环管位于与第一分离单元流体连通时，允许流体沿第一方向流过试样环管，并且当所述试样环管位于与第二分离单元流体连通时，允许流体沿与第一方向相同的方向流过所述试样环管。
8.权利要求1-5任一项的色谱系统，其中RPLC柱包含反相固定相。
9.权利要求8的色谱系统，其中反相固定相包含C-18相。
10.权利要求8的色谱系统，其中捕集柱中的固定相包含反相材料。
11.权利要求9的色谱系统，其中反相材料包含C-18相。
12.权利要求1-5任一项的色谱系统，其中第二分离单元包含一个SFC柱。
13.权利要求12的色谱系统，其中SFC柱包含正相固定相。
14.权利要求13的色谱系统，其中正相固定相包含硅胶。
15.权利要求1的色谱系统，其中聚焦柱包含反相材料。
16.权利要求1-5任一项的色谱系统，其中第二分离单元包含：
a)SFC柱的阵列，其中该阵列中的SFC柱以平行结构排列；和
b)第二流体传送路线单元，用于将第二流动相的流体引导至所述阵列中的预先鉴定的SFC柱。
17.权利要求16的色谱系统，其中第二分离单元还包含位于SFC柱阵列中每个SFC柱上游的聚焦柱。
18.权利要求1-5任一项的色谱系统，还包含位于RPLC柱下游的第一检测器。
19.权利要求1-5任一项的色谱系统，还包含位于SFC柱下游的第二检测器。
20.权利要求1-5任一项的色谱系统，还包含至少一个控制装置，其可操作地连接至以下的一个或多个：
a)第一泵组件；
b)加样注射器；
c)第一检测器；
d)第一流体传送路线单元；
e)第二泵组件；和
f)第二检测器。
21.用于分离样品的方法，其包含以下步骤：
(i)在捕集柱上俘获至少一部分样品，所述部分通过反相液相色谱RPLC分离样品获得，所述捕集柱包含固定相；和
(ii)通过超临界流体色谱SFC将俘获在捕集柱上的样品的部分进行进一步分离，还包含在通过SFC进一步分离之前，再俘获从聚焦柱上的捕集柱上洗脱出来的至少一部分样品。
22.权利要求21的方法，还包含用反相液相色谱分离样品，包含：
(i)将样品导入第一流动相中；
(ii)驱动包含样品的第一流动相通过RPLC柱；和
(iii)在RPLC柱上分离样品。
23.权利要求22的方法，还包含在通过RPLC柱之后检测在第一流动相中样品的成分的存在。
24.权利要求21-23任一项的方法，还包含将捕集柱上俘获的样品的部分从捕集柱洗脱掉。
25.权利要求21-23任一项的方法，还包含检测通过SFC进一步分离后样品的成分。
26.权利要求21-23任一项的方法，还包含将捕集柱定位在RPLC柱的第一流动相下游的流动路径中，以俘获由RPLC柱分离的至少一部分样品。
27.权利要求26的方法，还包含将携带俘获部分的捕集柱切换到第二流动相的流动路径，用于从捕集柱洗脱俘获的部分。
28.权利要求27的方法，其中将捕集柱定位在第一流动相的流动路径中的步骤或将捕集柱切换到第二流动相的流动路径的步骤在与RPLC的流体路径和SFC的流体路径的接口的流体传送路线单元中进行。
29.权利要求21-23任一项的方法，其中第一流动相沿第一方向流过捕集柱，且俘获在捕集柱上的部分样品通过使第二流动相以与第一方向相反的方向流过捕集柱从捕集柱上被洗脱出来。
30.权利要求21-23任一项的方法，其中第一流动相以第一方向流过捕集柱，且俘获在捕集柱上的样品的部分通过使第二流动流动相以与第一方向相同的方向流过捕集柱被洗脱出来。
31.权利要求21的方法，其包含以下步骤：
(i)将样品导入第一流动相中；
(ii)驱动包含样品的第一流动相通过RPLC柱；
(iii)在RPLC柱上分离样品；
(iv)在通过RPLC柱之后检测第一流动相中存在的样品的成分；
(v)在第一捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少第一部分，所述第一捕集柱包含固定相；
(vi)从第一捕集柱上洗脱下俘获在第一捕集柱上的样品的第一部分；
(vii)通过SFC对第一捕集柱上俘获的样品的第一部分进行进一步分离；和
(viii)检测通过SFC进一步分离后样品的成分。
32.权利要求31的方法，还包含下列步骤：
(ix)在第二捕集柱上俘获在RPLC柱上分离的样品的至少第二部分，所述第二捕集柱包含固定相；
(x)从第二捕集柱上洗脱下俘获在第二捕集柱上的样品的第二部分；
(xi)通过SFC对俘获在第二捕集柱上的样品的第二部分进行进一步分离。
33.权利要求21-23任一项的方法，其中RPLC柱包含反相固定相。
34.权利要求21-23任一项的方法，其中捕集柱中的固定相包含反相材料。
35.权利要求21-23任一项的方法，其中通过SFC的进一步分离在包含正相固定相的SFC柱上进行。
36.权利要求21-23任一项的方法，其中通过SFC的进一步分离在包含SFC柱阵列的SFC系统上进行。
37.权利要求36的方法，其中SFC柱各自独立地包含正相固定相。
38.权利要求37的方法，还包含使俘获在捕集柱上的样品的部分按照传送路线至SFC柱以进一步分离，所述SFC柱包含适于分离样品中的成分的固定相。
39.使用权利要求1的色谱系统分析样品的方法，其包含：
在第一分离单元上通过反相液相色谱RPLC将复杂样品分离成第一组级分；和
通过超临界流体色谱SFC在第二分离单元上进一步分离所述级分的一种或多种。
40.权利要求39的方法，其中在第一分离单元上通过RPLC的分离部分地基于复杂样品的第一个特征，且在第二分离单元上通过SFC的分离部分地基于复杂样品的第二个特征，所述复杂样品的第二个特征与所述复杂样品的第一个特征不同。
41.权利要求39的方法，其中所述复杂样品包含立体异构体成分的混合物。
42.权利要求41的方法，其中非对映体成分在第一分离单元上通过RPLC被分离为一个或多个级分，所述级分各自包含对映异构体对。
43.权利要求42的方法，其中在第一分离单元上通过RPLC的分离部分基于复杂样品的疏水性。
44.权利要求42或43的方法，其中所述对映异构体对通过SFC在第二分离单元上进一步被分离为单独的对映异构体。
45.权利要求44的方法，其中在第二分离单位上通过SFC的分离部分基于复杂样品的手性。
46.使用权利要求1的色谱系统对包含立体异构体成分的混合物的样品进行非手性手性分析的方法，其包含：
在第一分离单元上通过RPLC分离样品中感兴趣的一个或多个非对映异构体成分；和
在相同的分析试验中，在第二分离单元上通过SFC分离感兴趣的对映异构体对。
47.权利要求46的方法，还包含基于来自RPLC分离的色谱图确定非手性纯度，并且基于来自SFC分离的色谱图确定手性纯度。
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