ES2831012T3 - Sistemas y procedimientos para cromatografía RPLC-SFC bidimensional - Google Patents
Sistemas y procedimientos para cromatografía RPLC-SFC bidimensional Download PDFInfo
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Abstract
Un sistema de cromatografía (10) para separar una muestra que comprende: a) un primer conjunto de bomba (100) para impulsar una primera fase móvil a través de la primera unidad de separación, b) un inyector de muestra (130) para introducir una muestra en la primera unidad de separación; y c) una columna de cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) (150); una primera unidad de separación (20) que comprende: una segunda unidad de separación (40A, 40B) que comprende: a) un segundo conjunto de bomba (200) para impulsar una segunda fase móvil a través de la segunda unidad de separación, b) una columna de cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) (240), y c) una columna concentradora (260) localizada corriente arriba de la columna SFC (240); y una primera unidad de enrutamiento fluídico (30) que comprende una pluralidad de circuitos de muestra (315, 320, 415, 420, 515, 520, 615, 630A-C), estando conectada dicha primera unidad de enrutamiento fluídico (30) a la primera unidad de separación (20) y la segunda unidad de separación (40A, 40B), en el que al menos uno de la pluralidad de circuitos de muestra comprende una columna de atrapamiento (330, 370, 430, 530, 560, 635A-E), comprendiendo dicha columna de atrapamiento una fase estacionaria; y en el que el sistema de cromatografía está configurado para separar en primer lugar la muestra en la primera unidad de separación y posteriormente introducir al menos una parte de la muestra eluida de la columna RPLC de la primera unidad de separación en la segunda unidad de separación.
Description
DESCRIPCIÓN
Sistemas y procedimientos para cromatografía RPLC-SFC bidimensional
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere a sistemas de cromatografía multidimensional y procedimientos para separación ortogonal y análisis de mezclas de compuestos. Se divulgan sistemas de cromatografía de líquidos en fase inversa-cromatografía de fluidos supercríticos bidimensional ejemplares y procedimientos de uso de los mismos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La cromatografía se usa ampliamente en la separación y análisis de mezclas de compuestos. Debido a las limitaciones en la capacidad de pico de la cromatografía unidimensional, se han diseñado sistemas de cromatografía multidimensional con un incremento significativo en la capacidad de pico para el análisis de muestras complejas. Las técnicas cromatográficas bidimensionales (2D) se han vuelto muy populares, en especial en el análisis de mezclas complejas. En comparación con la cromatografía unidimensional (1D), las técnicas cromatográficas 2D tienen mayor selectividad y poder de resolución asumiendo que los mecanismos de retención son complementarios. La capacidad de pico máxima en un sistema de separación bidimensional se logra cuando la selectividad de las separaciones individuales es independiente (ortogonal), de modo que los componentes que están mal resueltos en la primera dimensión se pueden resolver completamente en la segunda dimensión. Si se usan mecanismos de separación ortogonales en las dos dimensiones, la capacidad de pico teórica del sistema es el producto de las capacidades de pico individuales. Véase Giddings, J.C. Anal. Chem. 1984, 56:1258A; Giddings, J. C., en: Cortes, H. J. (Ed.), Multidimensional Chromatography: Techniques and Applications, Marcel Dekker, New York 1990, p. 1; Jandera, P. et al., Chromatographia 2004, 60:s 27.
Sin embargo, existen algunas restricciones para la cromatografía 2D en términos de sensibilidad y compatibilidades de disolventes. Por ejemplo, la fase móvil que se transfiere desde la primera dimensión a menudo crea interferencia con la segunda dimensión, limitando por tanto la capacidad de separación de la segunda dimensión. La incompatibilidad de los disolventes usados en la primera y segunda dimensiones puede provocar dispersión o ensanchamiento de banda grave y deterioro de pico, lo que representa por tanto una gran dificultad para el diseño de la interfaz. Tian, H., et al., J. Chromatogr. A 2006, 1137:42. Para aliviar el problema de la inmiscibilidad del disolvente, los investigadores han desarrollado varios sistemas 2D que usan fases móviles compatibles en ambas dimensiones. Algunos ejemplos incluyen lo siguiente: cromatografía de líquidos en fase inversa 2D (RPLC x RPLC) (Venkatramani, C.J. et al., J. Sep. Sci. 2012, 35:1748; Zhang, J. et al., J. Sep. Sci. 2009, 32:2084; Song, C.X. et al., Anal. Chem. 2010, 82:53; Liu, Y.M. et al., J. Chromatogr. A 2008, 1206:153), cromatografía de líquidos de interacción hidrófila 2D (HILIC x RPLC) (Liu, Y.M. et al., J. Chromatogr. A 2008, 1208:133; Wang, Y. et al., Anal. Chem. 2008, 80:4680; Louw, S. et al., J. Chromatogr. A 2008, 1208:90), Cromatografía de líquidos en fase normal 2D x cromatografía de fluidos supercríticos (NPLC x SFC) (Gao, L. et al., J. Sep. Sci. 2010, 33:3817), y SFC x SFC 2D (Zeng, L. et al., J. Chromatogr. A 2011, 1218:3080; Lavison, G. et al., J. Chromatogr. A 2007, 1161:300; Hirata, Y. et al., J. Sep. Sci. 2003, 26:531; Okamoto, D. et al., Anal. Sci. 2006, 22:1437; Guibal, P. et al., J. Chromatogr. A 2012, 1255:252). Anderer et al., documento US 2013/0134095, divulgaron un sistema de LC 2D y procedimientos que intentan reducir además la interferencia con la segunda LC por la primera LC controlando el acontecimiento de inyección de inyectar una salida de la primera LC en la segunda LC en relación con el estado de la segunda LC.
Una técnica que acopla las dimensiones de “fase normal” y “fase inversa” incompatibles es SFC x RPLC 2D (Francois, I. et al., J. Sep. Sci. 2008, 31:3473-3478; Francois, I. y Sandra, P. J. Chromatogr. A 2009, 1216:4005). En este caso, el dióxido de carbono supercrítico apolar en las fracciones de SFC se separa por evaporación (cuando se expone a presión atmosférica) para proporcionar fracciones con fases móviles compatibles para la segunda dimensión de RPLC (normalmente un modificador de alcohol). El sistema SFC x RPLC de Francois, I. et al. emplea una válvula de conmutación de 2 posiciones/10 puertos para la interfaz entre la unidad SFC de primera dimensión y la unidad RPLC de segunda dimensión. El sistema usa circuitos de relleno en la interfaz para evitar forzar que los analitos eluidos de la columna SFC vayan a la línea de desechos por la corriente de CO2, y se introduce agua en el circuito para reducir la interferencia del gas CO2 residual en la segunda dimensión.
Cortes y colaboradores (J. Microcol. Sep. 1992, 4:239-244; y patente de EE. UU. n.° 5.139.681) describieron un sistema LC x SFC 2D que incluye un capilar de entrada de muestra donde los disolventes volátiles de la LC de primera dimensión se eliminan por el paso de gas nitrógeno dejando un depósito de los analitos eluidos, que a continuación se absorbe por la fase móvil de CO2 para la SFC de segunda dimensión. Sin embargo, la eliminación del disolvente por el paso de gas nitrógeno no es práctica para RPLC que usa una fase móvil acuosa.
Sigue existiendo la necesidad de obtener un sistema de cromatografía y procedimientos eficaces para separar y analizar muestras complejas cuando sea ventajoso realizar una separación por RPLC de primera dimensión y SFC de segunda dimensión.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Se divulgan sistemas de cromatografía multidimensional y procedimientos para separar y/o analizar mezclas complejas de compuestos orgánicos, por ejemplo, un sistema de cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) -cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) bidimensional, en particular un sistema RPLC * SFC que incluye una interfaz que puede retener los analitos eluidos de la columna RPLC mientras deja pasar la fase móvil de RPLC, reduciendo por tanto la cantidad de disolventes de RPLC transportados a la columna SFC.
En un aspecto, se proporciona un sistema de cromatografía de acuerdo con la reivindicación 1.
Se proporcionan además procedimientos de uso de los sistemas de cromatografía descritos en el presente documento. En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para analizar una muestra de acuerdo con la reivindicación 23.
En otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para análisis aquiral-quiral simultáneo de una muestra de acuerdo con la reivindicación 27.
y
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento para separar una muestra por cromatografía multidimensional (tal como RPLC x SFC 2d ) de acuerdo con la reivindicación 5.
Otros aspectos de la invención se proporcionan por las reivindicaciones dependientes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un esquema de un sistema de cromatografía multidimensional ejemplar 10.
La FIG. 2A es un esquema de una primera unidad de separación ejemplar 20, interconectada con una primera unidad de enrutamiento fluídico 30.
La FIG. 2B es un esquema de una segunda unidad de separación ejemplar 40A y 40B interconectada con una primera unidad de enrutamiento fluídico 30.
La FIG. 3A y FIG. 3B son esquemas de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 que comprende una columna de atrapamiento 330, en la que la configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 está configurada para el flujo en contracorriente de la primera fase móvil y la segunda fase móvil a través de dicha columna de atrapamiento 330.
La FIG. 3C y FIG. 3D son esquemas de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 que comprende una columna de atrapamiento 370, en la que la configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 está configurada para el flujo en equicorriente de la primera fase móvil y la segunda fase móvil a través de dicha columna de atrapamiento 370.
La FIG. 4A y FIG. 4B son esquemas de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 que comprende una columna de atrapamiento 430, en la que la configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 está configurada para el flujo en equicorriente de la primera fase móvil y la segunda fase móvil a través de dicha columna de atrapamiento 430.
La FIG. 5A y FIG. 5B son esquemas de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 que comprende dos columnas de atrapamiento 530 y 560, en la que la configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 está configurada para el flujo en contracorriente de la primera fase móvil y la segunda fase móvil a través de cada una de las columnas de atrapamiento 530 y 560.
La FIG. 6A-FIG. 6D son esquemas de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 que comprende dos mecanismos de enrutamiento 600 y 620.
La FIG. 7A y FIG. 7B son esquemas de una subunidad corriente abajo ejemplar de la segunda unidad de separación 40B que comprende una agrupación de columnas SFC.
La FIG. 8A y FIG. 8B representan la posición de inicio/análisis y la posición de atrapamiento, respectivamente, de un sistema RPLc x SFC 2D ejemplar con una columna de atrapamiento (flujo equicorriente).
La FIG. 9 muestra un diagrama esquemático de RPLC-SFC 2D usando una agrupación de columnas de atrapamiento, columnas concentradoras y columnas SFC secundarias.
La FIG. 10 es una imagen fotográfica de una válvula de disco de detención ejemplar.
La FIG. 11 es un cromatograma de superposición de las mediciones de absorbancia (mUA) con el tiempo (minutos) para la separación multidimensional de óxido de trans-estilbeno (TSO) usando un sistema con tres configuraciones de circuito de muestra (6 pl, 12 pl, 24 pl).
La FIG. 12 es un cromatograma de superposición de las mediciones de absorbancia UV (mUA) con el tiempo (minutos) para la separación multidimensional de un intervalo de concentración evaluado (0,005-0,25 mg/ml) de TSO.
La FIG. 13 es un cromatograma de superposición de análisis no enriquecidos y enriquecidos de una muestra de la sustancia farmacéutica A obtenida a partir de un sistema RPLC-SFC 2D.
La FIG. 14A y FIG. 14B son cromatogramas de SFC y RPLC-SFC 2D convencionales, respectivamente, de una muestra de la sustancia farmacéutica A que contiene niveles variables de un enantiómero no deseado (intervalo de un 0,1 a un 2,0 %).
La FIG. 15 es una serie de cromatogramas que ilustran la separación de 8 estereoisómeros de una muestra de la sustancia farmacéutica A usando un sistema RPLC-SFC 2D. El cromatograma inferior muestra la separación de 4 pares diastereómeros de una muestra de la sustancia farmacéutica A en la primera dimensión de RPLC. Los cuatro cromatogramas superiores demuestran que cada par diastereómero se separó además en la segunda dimensión de SFC.
La FIG. 16 es una curva de la altura de pico frente al área de pico de los análisis de TSO en un intervalo de concentración usando un sistema RPLC-SFC 2D con y sin una columna concentradora localizada en la parte superior corriente arriba de la columna SFC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención proporciona sistemas de cromatografía y procedimientos eficaces para separar y analizar muestras complejas, en particular sistemas RPLC x SFC bidimensionales y procedimientos de uso de los mismos.
El término “un” o “uno” como se usa en el presente documento, a menos que se indique claramente de otro modo, se refiere a uno o más.
La referencia a “aproximadamente” un valor o parámetro en el presente documento incluye (y describe) modos de realización que se refieren a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a “aproximadamente X” incluye la descripción de “X”.
Sistemas
En un aspecto, la invención proporciona un sistema de cromatografía RPLC x SFC bidimensional para separar una muestra, en el que la muestra se separa en la RPLC de primera dimensión y a continuación en la SFC de segunda dimensión, comprendiendo el sistema una primera unidad de separación para cromatografía de líquidos en fase inversa, una segunda unidad de separación para cromatografía de fluidos supercríticos y una interfaz que es una unidad de enrutamiento fluídico. La unidad de enrutamiento fluídico comprende múltiples circuitos de muestra teniendo cada uno un volumen predefinido que se puede colocar en la vía fluídica de la primera unidad de separación para recoger las fracciones eluidas de la columna RPLC. Un circuito de muestra en el que se ha recogido una fracción se coloca posteriormente en la vía fluídica de la segunda unidad de separación para transferir la fracción recogida en el circuito de muestra sobre la columna SFC para otra separación. En un sistema de la presente invención, al menos uno de los circuitos de muestra comprende una columna de atrapamiento que contiene una fase estacionaria para retener los analitos eluidos de la columna RPLC mientras se deja pasar a través la fase móvil. El nuevo diseño de interfaz permite el acoplamiento de RPLC y SFC.
En algunos modos de realización, se proporciona un sistema cromatográfico bidimensional en línea que utiliza RPLC en la primera dimensión y SFC en la segunda dimensión, lo que puede lograr un análisis aquiral y quiral simultáneo de compuestos farmacéuticos. En determinados modos de realización, la interfaz comprende una válvula de conmutación de 2 posiciones/8 puertos con columnas de atrapamiento con C-18 de volumen pequeño. Los picos de interés de la columna RPLC de primera dimensión se concentraron eficazmente como pulsos de concentración nítidos en columna(s) de atrapamiento de volumen pequeño (por ejemplo, columna(s) de atrapamiento con C-18) y a continuación se inyectaron en la columna SFC de segunda dimensión. La separación por RPLC de primera dimensión proporciona el resultado de pureza aquiral, y la separación por SFC de segunda dimensión proporciona el resultado de pureza quiral (exceso enantiómero).
En referencia a los dibujos, la FIG. 1 representa una visión general esquemática de un sistema de cromatografía multidimensional ejemplar 10. Una primera unidad de separación 20 y una segunda unidad de separación 40A y 40B están interconectadas con una primera unidad de enrutamiento fluídico 30. El flujo direccional de una primera fase móvil a través de la primera unidad de separación 20 hasta la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 está indicado
por la flecha 50. Una segunda fase móvil, el flujo direccional indicado por la flecha 60, se desplaza a través de la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación hasta la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 y posteriormente se dirige de vuelta a través de la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación en el sentido indicado por la flecha 70.
En algunos modos de realización, el sistema comprende uno o más dispositivos de control conectados de forma funcional a uno o más componentes del sistema para controlar el funcionamiento del sistema, por ejemplo, los conjuntos de bomba, el inyector de muestra, la primera unidad de enrutamiento fluídico (interfaz) y los detectores que están presentes. El dispositivo de control puede incluir un sistema informático equipado con un programa informático apropiado para controlar el funcionamiento de cada uno de los dispositivos individuales y para el análisis de muestras automatizado (por ejemplo, el programa informático Instrument Control de Agilent o el programa informático Automation Studio). En referencia a la FIG. 1, un dispositivo de control 80 está conectado de forma funcional a al menos uno de los siguientes: la primera unidad de separación 20, la primera unidad de enrutamiento 30, y la segunda unidad de separación 40A y 40B.
La composición de la fase móvil en cromatografía se puede mantener constante con el tiempo, lo que es conocido en la técnica como modo isocrático. De forma alternativa, la composición de la fase móvil se puede variar con el tiempo, lo que es conocido en la técnica como modo de gradiente.
La primera unidad de separación del sistema de cromatografía RPLC x SFC 2D comprende un primer conjunto de bomba para impulsar una fase móvil a través de la primera unidad de separación, un inyector de muestra para introducir una muestra en la primera unidad de separación y una columna de cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC). La fase móvil para RPLC puede comprender un sistema de dos disolventes (por ejemplo, mezclas de aguaacetonitrilo y agua-metanol) y opcionalmente determinados aditivos (por ejemplo, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fórmico, hidróxido de amonio, acetato de amonio, acetato de sodio y similares). El conjunto de bomba comprende una o más bombas para impulsar una fase móvil para RPLC. Aunque las bombas adecuadas para cromatografía de líquidos son fácilmente conocidas en la técnica, en algunos modos de realización, la bomba puede ser una bomba alternativa, una bomba de desplazamiento, una bomba neumática y/o cualquier combinación de las al menos una de las anteriores. El sistema puede comprender cualquier inyector de muestra adecuado para inyectar una muestra en la fase móvil para RPLC, tal como un inyector de muestra manual o un muestreador automático. La columna RPLC comprende una fase estacionaria en fase inversa, tal como perlas de fase estacionaria C-18. La fase estacionaria en fase inversa puede estar basada en sílice (por ejemplo, que contiene una estructura central de gel de sílice) o basada en polímero (por ejemplo, que contiene una estructura central de un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno)). Los ejemplos no limitantes de materiales adecuados para la fase estacionaria en fase inversa incluyen C-18, C-8, C-4, fenilo y derivados de fenilo, fase incluida polar, fase de modo mezclado y similares.
En algunos modos de realización, la primera unidad de separación incluye además un detector situado corriente abajo de la columna RPLC para detectar la presencia de los analitos eluidos de la columna RPLC. Se puede usar cualquier detector adecuado para detectar los compuestos en la muestra, tal como un refractómetro diferencial, espectrofotómetro ultravioleta, detector espectrofotómetro ultravioleta-visible, detector aerosol cargado, detector de fluorescencia y espectrómetro de masas. En algunos modos de realización, el detector para la dimensión RPLC es un detector espectrofotómetro ultravioleta-visible, detector aerosol cargado, detector de fluorescencia y espectrómetro de masas.
El detector puede ser opcional en un sistema donde los analitos se eluyen en un tiempo predeterminado, por ejemplo, cuando la RPLC se realiza en condiciones preprogramadas y el tiempo de retención para los analitos de interés está predeterminado.
En referencia a los dibujos, la FIG. 2A muestra un esquema de una primera unidad de separación ejemplar 20 interconectada con la primera unidad de enrutamiento fluídico 30. La primera unidad de separación 20 comprende una primera bomba 100 para impulsar la primera fase móvil a través de la primera unidad de separación en el sentido indicado por la flecha 110. En algunos modos de realización, la primera fase móvil puede estar compuesta de un solo disolvente. En algunos modos de realización, la primera fase móvil puede estar compuesta de una pluralidad de disolventes mezclados. En algunos modos de realización, la mezcla de disolventes de la primera fase móvil se puede proporcionar corriente arriba de la bomba 100 de modo que la bomba 100 recibe el disolvente mezclado como primera fase móvil. En algunos modos de realización, la primera fase móvil se almacena en un receptáculo 120. En algunos modos de realización, la bomba 100 puede estar compuesta de una pluralidad de unidades de bombeo individuales, con una pluralidad de unidades de bombeo recibiendo y bombeando cada una un disolvente o mezcla de disolventes diferente de modo que la mezcla se produce corriente abajo de la bomba 100. En algunos modos de realización, la primera fase móvil puede comprender además uno o más aditivos. Los ejemplos no limitantes de aditivos usados en la fase móvil de RPLC incluyen ácido fosfórico, tampones de fosfato, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido fórmico, hidróxido de amonio, acetato de amonio, acetato de sodio, alquilsulfonatos y similares.
En algunos modos de realización, la composición de la primera fase móvil se puede mantener constante con el tiempo (realizándose en modo isocrático). En algunos modos de realización, la composición de la primera fase móvil se puede variar con el tiempo (realizándose en modo de gradiente). El funcionamiento en el modo de gradiente típicamente
requiere dos bombas: una para impulsar el disolvente más polar en la fase móvil (por ejemplo, agua); la otra para impulsar el disolvente menos polar (por ejemplo, acetonitrilo o metanol). El funcionamiento en el modo isocrático puede emplear un sistema con dos bombas que suministran dos disolventes en una proporción constante, o un sistema con una bomba que impulsa una fase móvil premezclada.
Además, el esquema de la FIG. 2A ilustra un inyector de muestra 130 localizado entre la bomba 100 y una columna de cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) 150. El inyector de muestra 130 introduce la muestra en la primera unidad de separación en el sentido indicado por la flecha 140. En algunos modos de realización, se proporciona el inyector de muestra 130 para añadir una muestra a la primera unidad de separación. En algunos modos de realización, el inyector de muestra 130 puede comprender una válvula y un circuito de muestra para introducir la muestra en la primera unidad de separación. En algunos modos de realización, el inyector de muestra 130 puede comprender un muestreador automático.
Como se muestra en el esquema de la FIG. 2A, la columna RPLC 150 está localizada corriente abajo del inyector de muestra 130. La columna RPLC 150 puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la columna RPLC 150 puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono. En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 18 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C18). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 8 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C8). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 4 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de hidrocarburo unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno).
En algunos modos de realización, la temperatura de la columna RPLC 150 se puede mantener a una temperatura seleccionada. En algunos modos de realización, la temperatura de la columna RPLC 150 se puede mantener en un intervalo de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 50 °C. En algunos modos de realización, la temperatura de la columna RPLC 150 se puede mantener a aproximadamente 40 °C.
Opcionalmente, localizado entre la columna RPLC 150 de la primera unidad de separación 20 y la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 hay un primer detector 160 (FIG. 2A). El primer detector mide la presencia de al menos una parte de la muestra eluida de la columna RPLC 150. En algunos modos de realización, el primer detector 150 es un detector óptico. En algunos modos de realización, el primer detector 150 es un detector espectrofotométrico. En algunos modos de realización, el primer detector 150 se selecciona de uno o más de los siguientes: espectrofotómetro ultravioleta, detector espectrofotómetro ultravioleta-visible y detector de fluorescencia.
La segunda unidad de separación del sistema de cromatografía RPLC x SFC 2D comprende un segundo conjunto de bomba para impulsar una segunda fase móvil a través de la segunda unidad de separación y una columna de cromatografía de fluidos supercríticos (SFC). La fase móvil para SFC comprende un fluido supercrítico (por ejemplo, dióxido de carbono supercrítico) y un modificador o codisolvente (por ejemplo, metanol, etanol y alcohol isopropílico), opcionalmente uno o más aditivos (por ejemplo, hidróxido de amonio). El segundo conjunto de bomba comprende una o más bombas para impulsar la fase móvil de fluido supercrítico. Se puede usar cualquier fase estacionaria adecuada para SFC en la columna SFC. La elección del material de fase estacionaria puede depender de los criterios de separación para la segunda dimensión. En algunos modos de realización, la columna SFC comprende una fase estacionaria en fase normal, tal como gel de sílice. En algunos modos de realización, el sistema de cromatografía comprende además un detector situado corriente abajo de la columna SFC para detectar la presencia de analitos eluidos de la columna SFC. Se puede usar cualquier detector adecuado para SFC, tal como un detector UV, un detector de agrupación de fotodiodos, detector aerosol cargado, detector de fluorescencia y un espectrómetro de masas (EM).
En referencia a los dibujos, la FIG. 2B representa un esquema de una segunda unidad de separación ejemplar, que comprende una subunidad corriente arriba 40A y una subunidad corriente abajo 40B, interconectada con la primera unidad de enrutamiento fluídico 30. La subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación comprende una segunda bomba 200 para impulsar una segunda fase móvil a través de la segunda unidad de separación 40A y 40B en el sentido indicado por la flecha 210. La subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación comprende una columna SFC 240, una columna concentradora 260 y opcionalmente un detector 250. En algunos modos de realización, la segunda fase móvil puede estar compuesta de un solo disolvente. En algunos modos de realización, la segunda fase móvil puede estar compuesta de una pluralidad de disolventes mezclados. En algunos modos de realización, la mezcla de disolventes de la segunda fase móvil se puede proporcionar corriente arriba de la bomba 200 de modo que la bomba 200 recibe los disolventes mezclados como segunda fase móvil. En algunos modos de realización, la segunda fase móvil se almacena en un receptáculo 220. En algunos modos de realización, la bomba 200 puede estar compuesta de una pluralidad de unidades de bombeo individuales, con una pluralidad de unidades de bombeo recibiendo y bombeando cada una un disolvente o mezcla de disolventes diferente de modo que la mezcla se produce corriente abajo de la bomba 200.
En algunos modos de realización, la composición de la segunda fase móvil se puede mantener constante con el tiempo
(realizándose en modo isocrático). En algunos modos de realización, la composición de la segunda fase móvil puede variar con el tiempo (realizándose en modo de gradiente). Aunque las bombas adecuadas para cromatografía de fluidos supercríticos son fácilmente conocidas en la técnica, en algunos modos de realización, la bomba puede ser una bomba alternativa, una bomba de desplazamiento, una bomba neumática y/o cualquier combinación de las al menos una de las anteriores.
Como se muestra en la FIG. 2B, la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación está interconectada con la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 corriente abajo de la bomba 200. El flujo direccional de la segunda fase móvil a través de la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación corriente abajo de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 se muestra por la flecha 230. La columna SFC 240 puede comprender una fase estacionaria en fase normal. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales cianopropilo. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales aminopropilo. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales etilpiridina. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales de ácido sulfónico y/o fenilo. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales 1,2-dihidroxipropilpropiléter. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es un polímero, tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno), modificado con un grupo funcional (por ejemplo, un grupo funcional cianopropilo, aminopropilo, etilpiridina, ácido sulfónico, fenilo o 1,2-dihidroxipropilpropiléter). Otros ejemplos de materiales adecuados para su uso en la fase estacionaria para SFC incluyen sílice, etilpiridina, ciano, Epic diol, piridilamida, nitro y similares.
En algunos modos de realización, la temperatura de la columna SFC 240 se puede mantener a una temperatura seleccionada. En algunos modos de realización, la temperatura de la columna SFC 240 se puede mantener en un intervalo de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 45 °C. En algunos modos de realización, la temperatura de la columna s Fc 240 se puede mantener a aproximadamente 40 °C.
En referencia a la FIG. 2B, una columna concentradora 260 está localizada corriente arriba de la columna SFC 240. La columna concentradora 260 comprende una fase estacionaria. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono. En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 18 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C18). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 8 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C8). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 4 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de carbono (tal como una cadena C-18, C-8 o C-4) unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno). En general, la columna concentradora coincidirá con la fase inversa usada en la dimensión primaria y/o la columna de atrapamiento usada en la interfaz.
En algunos modos de realización, la temperatura de la columna concentradora 260 se puede mantener a una temperatura seleccionada. En algunos modos de realización, la columna concentradora se puede mantener a la misma temperatura que la columna SFC. En algunos modos de realización, la temperatura de la columna concentradora 260 se puede mantener a de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 45 °C. En algunos modos de realización, la temperatura de la columna concentradora 260 se puede mantener a aproximadamente 40 °C.
Localizado corriente abajo de la columna SFC 240 hay un segundo detector 250 (FIG. 2B). El detector mide la presencia y cantidades de analitos eluidos de la columna SFC 240. En algunos modos de realización, el segundo detector 250 es un detector óptico. En algunos modos de realización, el segundo detector 250 es un detector espectrofotométrico. En algunos modos de realización, el segundo detector 250 se selecciona de uno o más de los siguientes: refractómetro diferencial, espectrofotómetro ultravioleta, detector espectrofotómetro ultravioleta-visible, detector de fluorescencia y espectrofotómetro infrarrojo. En algunos modos de realización, el segundo detector 250 es un espectrómetro de masas. En algunos modos de realización, el espectrómetro de masas se puede seleccionar de uno o más de los siguientes: un instrumento de sector, un instrumento de filtro de masa de cuadrupolo, un instrumento analizador del tiempo de vuelo, un instrumento con trampa iónica, un instrumento con trampa iónica de cuadrupolo, un instrumento con trampa iónica de cuadrupolo lineal, un instrumento Orbitrap, un instrumento con resonancia ciclotrónica para iones por transformada de Fourier y cualquier combinación o híbrido de los tipos de instrumentos enumerados. Como es bien conocido en la técnica, la muestra se introduce en el espectrómetro de masas por medio de técnicas de ionización, tales como, pero sin limitarse a, bombardeo con átomos rápidos, ionización química, ionización química a presión atmosférica, ionización por electronebulización e ionización por nanoelectronebulización. En algunos modos de realización, la muestra se introduce en el espectrómetro de masas por medio de ionización química a presión atmosférica o ionización por electronebulización.
En algunos modos de realización, la parte corriente abajo de la segunda unidad de separación 40B puede comprender además un colector de fracciones en lugar de, después de o en paralelo con el segundo detector.
Opcionalmente, en algunos modos de realización, un dispositivo de control 80 está conectado de forma funcional a al menos uno de los siguientes: una bomba 100 y/o 200, un inyector de muestra 130, un primer detector 160, la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 y un segundo detector 250.
La interfaz entre las dos dimensiones en un sistema de cromatografía 2D controla el enrutamiento de analitos separados y eluidos de la primera dimensión a la segunda dimensión para otra separación y determina el modo de funcionamiento. El sistema de cromatografía 2D de la presente invención está configurado para separar en primer lugar la muestra en la primera unidad de separación por RPLC y posteriormente introducir al menos una parte de la muestra eluida de la columna RPLC en la segunda unidad de separación para otra separación por SFC.
La primera unidad de enrutamiento fluídico comprende una pluralidad de circuitos de muestra, dicha primera unidad de enrutamiento fluídico está conectada a la primera unidad de separación y la segunda unidad de separación, en la que al menos uno de la pluralidad de circuitos de muestra comprende una columna de atrapamiento, comprendiendo dicha columna de atrapamiento una fase estacionaria. El material de la fase estacionaria en las columnas de atrapamiento puede ser el mismo que el material de la fase estacionaria usado en la columna RPLC o diferente del material de la fase estacionaria usado en la columna RPLC. En algunos modos de realización, la fase estacionaria usada en la columna de atrapamiento puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono. En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 18 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C18). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 8 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C8). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 4 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de carbono (tal como una cadena C-18, C-8 o C-4) unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno).
La primera unidad de enrutamiento fluídico en algunos modos de realización incluye un mecanismo de enrutamiento (tal como una válvula de conmutación) que comprende una pluralidad de puertos, canales que permiten que el líquido fluya entre los puertos y circuitos de muestra conectados a los puertos. En algunos modos de realización, el mecanismo de enrutamiento es una válvula de conmutación de 2 posiciones/8 puertos. En algunos modos de realización, el mecanismo de enrutamiento es una válvula de conmutación de 2 posiciones/10 puertos. En algunos modos de realización, el mecanismo de enrutamiento es una válvula dúo de 2 posiciones/4 puertos. En algunos modos de realización, el mecanismo de enrutamiento es una válvula de conmutación de 2 posiciones, 8 puertos o 10 puertos.
En algunos modos de realización, la primera unidad de enrutamiento fluídico del sistema RPLC x SFC 2D comprende dos circuitos de muestra; en la que uno de los dos circuitos de muestra está en comunicación fluídica con la primera unidad de separación y el otro de los dos circuitos de muestra está en comunicación fluídica con la segunda unidad de separación. En algunos modos de realización, uno de los dos circuitos de muestra comprende una columna de atrapamiento que comprende una fase estacionaria. En algunos modos de realización, ambos circuitos de muestra comprenden cada uno una columna de atrapamiento que comprende una fase estacionaria.
La FIG. 3A representa un esquema de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 interconectada con la primera unidad de separación 20 y la segunda unidad de separación 40A y 40B. En este caso, la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz incluye un mecanismo de enrutamiento 300, que en una variación es una válvula de conmutación de 2 posiciones/8 puertos, que comprende una pluralidad de puertos 305A-305H, una pluralidad de canales 310A-310D y dos circuitos de muestra, 315 y 320. Como se muestra en la FIG. 3A, la pluralidad de canales 310A-310D se muestran en la primera de dos configuraciones posibles.
Como se ejemplifica en la FIG. 3A, la primera unidad de separación 20 está conectada al mecanismo de enrutamiento 300 en el puerto 305A. La primera fase móvil se impulsa a través de la primera unidad de separación 20 en el sentido indicado por la flecha 325 y el mecanismo de enrutamiento 300 dirige la primera fase móvil a un circuito de muestra 315 por medio del canal 310A. El circuito de muestra 315 está conectado al mecanismo de enrutamiento 300 en el puerto 305B y el puerto 305F. El circuito de muestra 315 comprende una columna de atrapamiento 330, dicha columna de atrapamiento comprende una fase estacionaria.
El mecanismo de enrutamiento 300 dirige la primera fase móvil a un receptáculo corriente abajo 340, en el sentido indicado por la flecha 345, por medio de un canal 310C. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 340 es un receptáculo de residuos. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 340 es un colector de fracciones.
Como se representa en la FIG. 3A, la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación está conectada al mecanismo de enrutamiento 300 en el puerto 305G. La segunda fase móvil se impulsa a través de la segunda unidad de separación 40A en el sentido indicado por la flecha 350 y el mecanismo de enrutamiento 300 dirige la segunda fase móvil a un circuito de muestra 320 por medio de un canal 310D. El circuito de muestra 320 está
conectado al mecanismo de enrutamiento 300 en el puerto 305H y el puerto 305D, en el que la primera fase móvil se desplaza en el sentido indicado por la flecha 355. El mecanismo de enrutamiento 300 está conectado a la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación por medio del puerto 305C. El mecanismo de enrutamiento 300 dirige la segunda fase móvil a través de la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación en el sentido indicado por la flecha 360.
El esquema ilustrado en la FIG. 3B representa la misma configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico como se muestra en la FIG. 3A, excepto que la pluralidad de canales 310A-310D del mecanismo de enrutamiento 300 en la FIG. 3A están ahora en una segunda de dos posibles posiciones, a saber, los canales 310E-310H, como se muestra en la FIG. 3B. El mecanismo de enrutamiento en la FIG. 3B dirige la primera fase móvil desde la primera unidad de separación 20, en el sentido indicado por la flecha 325, a través del canal 310H hasta el circuito de muestra 320. El circuito de muestra 320 está conectado al mecanismo de enrutamiento 300 en el puerto 305H y el puerto 305D en el que la primera fase móvil se dirige al receptáculo corriente abajo 340, en el sentido indicado por la flecha 345, por medio del canal 310F.
Como se representa en la FIG. 3B, la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación está conectada al mecanismo de enrutamiento 300 en el puerto 305G. La segunda fase móvil se impulsa a través de la segunda unidad de separación 40A en el sentido indicado por la flecha 350 y el mecanismo de enrutamiento 300 dirige ahora la segunda fase móvil al circuito de muestra 315 por medio de un canal 310G. El circuito de muestra 315 está conectado al mecanismo de enrutamiento en el puerto 305B y el puerto 305F. El mecanismo de enrutamiento 300 dirige el flujo de la segunda fase móvil a través de la columna de atrapamiento 330 en el sentido indicado por la flecha 365. En comparación con la FIG. 3A, el mecanismo de enrutamiento 300 como se muestra en la FIG. 3B dirige el flujo de la segunda fase móvil a través del circuito de muestra 315 en un sentido que es opuesto al flujo de la primera fase móvil a través del mismo circuito de muestra 315 mostrado en la FIG. 3A. Esta configuración ejemplificada del mecanismo de enrutamiento 300 dirige el flujo de las fases móviles a través del circuito de muestra 315 en lo que se conoce en la técnica como forma de “contracorriente”.
Los esquemas ejemplares ilustrados en la FIG. 3C y FIG. 3D representan una configuración similar de la primera unidad de enrutamiento fluídico mostrada en la FIG. 3A y FIG. 3B, excepto que, como se muestra en la FIG. 3C y FIG. 3D, la columna de atrapamiento 370 está localizada en el circuito de muestra 320. El mecanismo de enrutamiento 300 dirige el flujo de la primera fase móvil a través del circuito de muestra 320 que comprende la columna de atrapamiento 370 en el sentido indicado por la flecha 355 (FIG. 3C). En la FIG. 3D, la pluralidad de canales 310A-310D del mecanismo de enrutamiento 300 están en la segunda de dos posiciones posibles. El mecanismo de enrutamiento 300 dirige la segunda fase móvil desde la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación a través del circuito de muestra 320 que comprende la columna de atrapamiento 370 y a través de la parte corriente abajo de la segunda unidad de separación 40B en el sentido indicado por las flechas 355 y 360. Como se ejemplifica en la FIG. 3C y FIG. 3D el flujo de la primera fase móvil y la segunda fase móvil se desplazan a través de la columna de atrapamiento 370 en el mismo sentido, conocido en la técnica como forma de “equicorriente”.
En el caso de un sistema que usa una válvula de conmutación de 2 posiciones/8 puertos (300) en la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz, las configuraciones equicorriente/contracorriente se pueden controlar por la colocación de la columna de atrapamiento (370) en el circuito de muestra 315 o 320. De forma alternativa, las configuraciones equicorriente/contracorriente se pueden cambiar conmutando el puerto de conexión para la subunidad corriente arriba 40A y la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación a la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz.
La FIG. 4A representa un esquema de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 interconectada con la primera unidad de separación 20 y la segunda unidad de separación 40A y 40B. En este caso, la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz incluye un mecanismo de enrutamiento 400, que en una variación es una válvula de conmutación de 2 posiciones/10 puertos, que comprende una pluralidad de puertos 405A-405J, una pluralidad de canales 410A-410E y dos circuitos de muestra, 415 y 420. Como se muestra en la FIG. 4A, la pluralidad de canales 410A-410E se muestran en la primera de dos configuraciones posibles.
Como se ejemplifica en la FIG. 4A, la primera unidad de separación 20 está conectada al mecanismo de enrutamiento 400 en el puerto 405A. El mecanismo de enrutamiento 400 dirige la primera fase móvil a uno de la pluralidad de circuitos de muestra 415 por medio del canal 410A en el sentido indicado por la flecha 425. El circuito de muestra 415 está conectado al mecanismo de enrutamiento 400 en el puerto 405B y el puerto 405E. El circuito de muestra 415 comprende una columna de atrapamiento 430, dicha columna de atrapamiento comprende una fase estacionaria.
El mecanismo de enrutamiento 400 dirige la primera fase móvil a un receptáculo corriente abajo 440 por medio de un canal 410C. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 440 es un receptáculo de residuos. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 440 es un colector de fracciones.
Como se representa en la FIG. 4A, la segunda unidad de separación 40 está conectada al mecanismo de enrutamiento 400 en el puerto 405C. El mecanismo de enrutamiento 400 dirige la segunda fase móvil a un circuito de muestra 420 por medio de dos canales conectados 410D y 410E. El circuito de muestra 420 está conectado al mecanismo de
enrutamiento 400 en el puerto 405J y el puerto 405G. El mecanismo de enrutamiento 400 está conectado a la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación por medio del puerto 405H. El mecanismo de enrutamiento 400 dirige la segunda fase móvil a través de la parte corriente abajo de la segunda unidad de enrutamiento fluídico 40B en el sentido indicado por la flecha 435.
El esquema ilustrado en la FIG. 4B representa la misma configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico como se muestra en la FIG. 4A, excepto que la pluralidad de canales 410A-410E del mecanismo de enrutamiento 400 en la FIG. 4A están ahora en una segunda de dos posibles posiciones, a saber, los canales 410F-410J, como se muestra en la FIG. 4B. Como se representa en la FIG. 4A y FIG. 4B, el mecanismo de enrutamiento 400 de la primera unidad de separación 30 se puede configurar de modo que el sentido del flujo de la primera fase móvil a través de un circuito de muestra 415 (FIG. 4A) está en el mismo sentido, indicado por la flecha 425, que el flujo de la segunda fase móvil a través del mismo circuito de muestra 415 (FIG. 4B). Esta configuración ejemplificada del mecanismo de enrutamiento 400 dirige el flujo de las fases móviles a través del circuito de muestra 415 en forma de equicorriente.
En el caso de un sistema que usa una válvula de conmutación de 2 posiciones/10 puertos (400) en la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz, ambos circuitos de muestra están configurados en forma de equicorriente como se representa en la FIG. 4A y FIG. 4B. Sin embargo, ambos circuitos de muestra se pueden configurar en forma de contracorriente conmutando el puerto de conexión para la subunidad corriente arriba 40A y la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación a la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz.
La FIG. 5A representa un esquema de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 interconectada con la primera unidad de separación 20 y la segunda unidad de separación 40A y 40B. En este caso, la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz incluye un mecanismo de enrutamiento 500, que en una variación es una válvula dúo de 2 posiciones/4 puertos, que comprende una pluralidad de puertos 505A-505H, una pluralidad de canales 510A-510D y dos circuitos de muestra, 515 y 520. Como se muestra en la FIG. 5A, la pluralidad de canales 510A-510D se muestran en la primera de dos configuraciones posibles.
Como se ejemplifica en la FIG. 5A, la primera unidad de separación 20 está conectada al mecanismo de enrutamiento 500 en el puerto 505G. La primera fase móvil se impulsa a través de la primera unidad de separación 20 en el sentido indicado por la flecha 525 y el mecanismo de enrutamiento 500 dirige la primera fase móvil a través de un circuito de muestra 520 por medio de un canal 510A. El circuito de muestra 520 está conectado al mecanismo de enrutamiento 500 en el puerto 505H y el puerto 505B. El mecanismo de enrutamiento 500 dirige la primera fase móvil a través del circuito de muestra 520 en el sentido indicado por la flecha 535. El circuito de muestra 520 comprende una columna de atrapamiento 530, dicha columna de atrapamiento comprende una fase estacionaria.
El mecanismo de enrutamiento 500 dirige la primera fase móvil a un receptáculo corriente abajo 540, en el sentido indicado por la flecha 545, por medio de un canal 510B. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 540 es un receptáculo de residuos. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 540 es un colector de fracciones.
Como se representa en la FIG. 5A, la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación está conectada al mecanismo de enrutamiento 500 en el puerto 505E. La segunda fase móvil se impulsa a través de la segunda unidad de separación 40A en el sentido indicado por la flecha 550 y el mecanismo de enrutamiento 500 dirige la segunda fase móvil a un circuito de muestra 515 por medio de un canal 510C. El circuito de muestra 515 está conectado al mecanismo de enrutamiento 500 en el puerto 505F y el puerto 505C, en el que la primera fase móvil se desplaza en el sentido indicado por la flecha 555. El circuito de muestra 515 comprende una columna de atrapamiento 560, dicha columna de atrapamiento comprende una fase estacionaria. El mecanismo de enrutamiento 500 está conectado a la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación por medio del puerto 505D. El mecanismo de enrutamiento 500 dirige la segunda fase móvil a través de la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación en el sentido indicado por la flecha 565.
En algunos modos de realización, las columnas de atrapamiento 530 y 560 comprenden la misma fase estacionaria. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, las columnas de atrapamiento 530 y 560 comprenden la fase estacionaria diferente.
El esquema ilustrado en la FIG. 5B representa la misma configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico como se muestra en la FIG. 5A, excepto que la pluralidad de canales 510A-510D del mecanismo de enrutamiento 500 en la FIG. 5A están ahora en una segunda de dos posibles posiciones, a saber, los canales 510E-510G, como se muestra en la FIG. 5B. El mecanismo de enrutamiento 500 en la FIG. 5B dirige ahora la primera fase móvil desde la primera unidad de separación 20, en el sentido indicado por la flecha 525, a través del canal 510E hasta el circuito de muestra 515. El circuito de muestra 515 está conectado al mecanismo de enrutamiento 500 en el puerto 505C y el puerto 505F en el que la primera fase móvil se dirige al receptáculo corriente abajo 540, en el sentido indicado por la flecha 545, por medio del canal 510F. En la FIG. 5B, el mecanismo de enrutamiento 500 dirige el flujo de la primera fase móvil a través del circuito de muestra 515 en sentido opuesto al de la segunda fase móvil a través del mismo circuito de muestra 515 en la FIG. 5A.
Como se representa en la FIG. 5B, la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación está conectada al mecanismo de enrutamiento 500 en el puerto 505E. La segunda fase móvil se impulsa a través de la segunda unidad de separación 40A en el sentido indicado por la flecha 550 y el mecanismo de enrutamiento 500 dirige ahora la segunda fase móvil al circuito de muestra 520 por medio de un canal 510G. El circuito de muestra 520 está conectado al mecanismo de enrutamiento en el puerto 505B y el puerto 505H. El mecanismo de enrutamiento 500 dirige el flujo de la segunda fase móvil a través de la columna de atrapamiento 530 en el sentido indicado por la flecha 575. En la FIG. 5B, el mecanismo de enrutamiento 500 dirige el flujo de la segunda fase móvil a través del circuito de muestra 520 en sentido opuesto a la de la primera fase móvil a través del mismo circuito de muestra 520 en la FIG. 5A.
En el caso de un sistema que usa una válvula dúo de 2 posiciones/4 puertos (500) en la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz, ambos circuitos de muestra están configurados en forma de contracorriente como se representa en la FIG. 5A y FIG. 5B. Sin embargo, si es deseable, ambos circuitos de muestra se pueden configurar en forma de equicorriente conmutando el puerto de conexión para la subunidad corriente arriba 40A y la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación a la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz.
En algunos modos de realización, la primera unidad de enrutamiento fluídico del sistema RPLC x SFC 2D comprende al menos tres circuitos de muestra, y en la que al menos uno de los circuitos de muestra está en aislamiento fluídico de la primera unidad de separación y la segunda unidad de separación. En un sistema de este tipo, un circuito de muestra está en comunicación fluídica con la primera unidad de separación, un circuito de muestra está en comunicación fluídica con la segunda unidad de separación y uno o más circuitos de muestra están en aislamiento fluídico de la primera unidad de separación y la segunda unidad de separación. En algunos modos de realización, al menos uno de los circuitos de muestra comprende una columna de atrapamiento, dicha columna de atrapamiento comprende una fase estacionaria. En algunos modos de realización, al menos un circuito de muestra que comprende una columna de atrapamiento, dicha columna de atrapamiento comprende una fase estacionaria, está en aislamiento fluídico de la primera unidad de separación y la segunda unidad de separación. En algunos modos de realización, la primera unidad de enrutamiento fluídico comprende una pluralidad de columnas de atrapamiento, cada una situada en un circuito de muestra. En algunos modos de realización, cada una de las columnas de atrapamiento se carga con el mismo material de fase estacionaria. En otros modos de realización, el material de la fase estacionaria se puede adaptar para que se retengan los analitos particulares, por tanto se pueden usar diferentes materiales de fase estacionaria para diferentes fracciones eluidas de la primera unidad de separación. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono. En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 18 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C18 o gel de sílice con C18). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 8 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C8 o gel de sílice con C8). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 4 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C4 o gel de sílice con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de carbono (tal como una cadena de carbono C-18, C-8 o C-4) unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno).
Un sistema que comprende una unidad de enrutamiento fluídico de interfaz donde uno o más circuitos de muestra se pueden colocar en aislamiento fluídico de la primera unidad de separación y la segunda unidad de separación proporciona un rasgo característico de “detención de pico”. Cuando es necesario que múltiples fracciones separadas y eluidas de la cromatografía de primera dimensión se separen además en la segunda dimensión, el intervalo de tiempo entre fracciones eluidas de la primera unidad de separación puede ser insuficiente para que la primera fracción se procese a través de la segunda unidad de separación. Mientras que la segunda unidad de separación está en uso para analizar una fracción anterior, las fracciones (o cortes) posteriores se pueden recoger en una columna de atrapamiento en circuitos adicionales y retenerse en aislamiento fluídico (“detenidas”) hasta que la segunda unidad de separación esté lista para el análisis de la siguiente fracción.
En referencia a los dibujos, la FIG. 6A representa un esquema de una primera unidad de enrutamiento fluídico ejemplar 30 interconectada con la primera unidad de separación 20 y la segunda unidad de separación 40A y 40B. En este caso, la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz incluye un primer mecanismo de enrutamiento 600, que en una variación es una válvula dúo de 2 posiciones/4 puertos, que comprende una pluralidad de puertos 605A-605H, una pluralidad de canales 610A-610D, un circuito de muestra 615, y un segundo mecanismo de enrutamiento 620 que comprende una pluralidad de puertos, por ejemplo 625A-625E, una pluralidad de circuitos de muestra, por ejemplo, 630A-630C, una pluralidad de columnas de atrapamiento, 635A-635E y una pluralidad de canales 675A y 675B. El circuito de muestra 630B proporciona un circuito de derivación sin una columna de atrapamiento. Como se muestra en la FIG. 6A, la pluralidad de canales 610A-610D del primer mecanismo de enrutamiento 600 se muestran en la primera de dos configuraciones posibles.
Como se ejemplifica en la FIG. 6A, la primera unidad de separación 20 está conectada al mecanismo de enrutamiento 600 en el puerto 605G. La primera fase móvil se impulsa a través de la primera unidad de separación 20 en el sentido indicado por la flecha 640 y el mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a través de un circuito de
muestra 615 por medio de un canal 610A. El circuito de muestra 615 está conectado al primer mecanismo de enrutamiento 600 en el puerto 605H y el puerto 605B. El primer mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a través del circuito de muestra 615 en el sentido indicado por la flecha 645. Como se muestra en la FIG.
6A, el mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a un receptáculo corriente abajo 650, en el sentido indicado por la flecha 655, por medio de un canal 610B. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 650 es un receptáculo de residuos. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 650 es un colector de fracciones.
Como se representa en la FIG. 6A, la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación está conectada al mecanismo de enrutamiento 600 en el puerto 605E. La segunda fase móvil se impulsa a través de la subunidad corriente arriba 40A de la segunda unidad de separación en el sentido indicado por la flecha 660. El mecanismo de enrutamiento 600 dirige la segunda fase móvil, en el sentido indicado por la flecha 665, a un segundo mecanismo de enrutamiento 620 a través del canal 610C. El primer mecanismo de enrutamiento 600 y el segundo mecanismo de enrutamiento 620 están conectados por medio del puerto 605F y el puerto 625A.
En la FIG. 6A, el segundo mecanismo de enrutamiento 620 está configurado para dirigir la segunda fase móvil a través de un circuito de muestra 630B en el sentido indicado por la flecha 670 por medio del canal 675A. El circuito de muestra 630B está conectado al segundo mecanismo de enrutamiento 620 por medio del puerto 625B y el puerto 625E, que está conectado al puerto 625D por medio del canal 675B. El segundo mecanismo de enrutamiento 620 y el primer mecanismo de enrutamiento 600 están conectados por medio del puerto 625F y el puerto 605C. El segundo mecanismo de enrutamiento 620 dirige el flujo de la segunda fase móvil de vuelta al primer mecanismo de enrutamiento 600 en el sentido indicado por la flecha 680. El primer mecanismo de enrutamiento 600 dirige el flujo de la segunda fase móvil a través de la subunidad corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación por medio del canal 610D en el sentido indicado por la flecha 690.
La FIG. 6A representa una configuración donde ninguna columna de atrapamiento está en comunicación fluídica con la primera unidad de separación o bien la segunda unidad de separación. Por ejemplo, el sistema se puede establecer en esta configuración cuando no salga ningún pico de interés de la columna de primera dimensión o se esté analizando en la columna de segunda dimensión. El sistema también se puede establecer en esta configuración cuando las columnas en ambas unidades de separación están en estado inactivo o las columnas están experimentando regeneración/equilibrio. Cada una de las columnas de atrapamiento 635A-635E está en aislamiento fluídico de la primera y segunda unidad de separación.
El esquema ilustrado en la FIG. 6B representa la misma configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico que se muestra en la FIG. 6A, excepto que la pluralidad de canales 610A-610D del primer mecanismo de enrutamiento 600 en la FIG. 6A están ahora en la segunda de dos posibles posiciones 610E-610H como se muestra en la FIG. 6B. El mecanismo de enrutamiento 600 en la FIG. 6B dirige ahora la primera fase móvil desde la primera unidad de separación 20, en el sentido indicado por la flecha 640, a través del canal 610E hasta el segundo mecanismo de enrutamiento 620. El primer mecanismo de enrutamiento 600 y el segundo mecanismo de enrutamiento 620 están conectados en el puerto 605C y el puerto 625F. Además, en la FIG. 6B, el segundo mecanismo de enrutamiento 620 está configurado ahora para dirigir el flujo de la primera fase móvil a través del circuito de muestra 630A en el sentido indicado por la flecha 705. El circuito de muestra 630A comprende una columna de atrapamiento 635A. El circuito de muestra 630A está conectado al segundo mecanismo de enrutamiento 620 por medio del puerto 625F y el puerto 625C. Como se representa en la FIG. 6B, el segundo mecanismo de enrutamiento 620 y el primer mecanismo de enrutamiento 600 están conectados por medio del puerto 625A y el puerto 605F. El segundo mecanismo de enrutamiento 620 dirige el flujo de la primera fase móvil de vuelta al primer mecanismo de enrutamiento 600 en el sentido indicado por la flecha 710. El primer mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a un receptáculo corriente abajo 650, en el sentido indicado por la flecha 655, por medio de un canal 610F. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 650 es un receptáculo de residuos. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 650 es un colector de fracciones. En algunos modos de realización, se puede usar un Flexcube (Agilent) como parte del segundo mecanismo de enrutamiento.
En algunos modos de realización, la configuración de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 mostrada en la FIG. 6B, se puede usar para dirigir una parte de la muestra que se eluye de la primera unidad de separación para que se retenga selectivamente en una columna de atrapamiento, por ejemplo, 635A. En algunos modos de realización, la columna de atrapamiento puede comprender una fase estacionaria. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono (por ejemplo, gel de sílice con C18, gel de sílice con C8 y gel de sílice con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de carbono (tal como una cadena de carbono C-18, C-8 o C-4) unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno).
Después de que se haya retenido un pico en una columna de atrapamiento, por ejemplo, 635A, los mecanismos de enrutamiento 600 y 620 se pueden conmutar o establecer en posiciones para permitir la elución y análisis adicional del pico retenido, por ejemplo, como se muestra en la FIG. 6C; o los mecanismos de enrutamiento 600 y 620 se pueden conmutar o establecer en posiciones para permitir la detención del pico retenido en la columna de
atrapamiento 635A y la recogida de otro pico en una columna de atrapamiento diferente, por ejemplo, 635B, como se demuestra en la FIG. 6D.
El esquema ilustrado en la FIG. 6C representa una configuración ejemplar de la primera unidad de enrutamiento fluídico 30 en la que el primer mecanismo de enrutamiento 600 está configurado para dirigir el flujo de la primera fase móvil al receptáculo corriente abajo 650, como se muestra en la FIG. 6A. Como se ilustra en la FIG. 6C, la primera fase móvil se impulsa a través de la primera unidad de separación 20 en el sentido indicado por la flecha 640 y el mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a través de un circuito de muestra 615 por medio de un canal 610A. El circuito de muestra 615 está conectado al primer mecanismo de enrutamiento 600 en el puerto 605H y el puerto 605B. El primer mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a través del circuito de muestra 615 en el sentido indicado por la flecha 645. Como se muestra en la FIG. 6A, el mecanismo de enrutamiento 600 dirige la primera fase móvil a un receptáculo corriente abajo 650, en el sentido indicado por la flecha 655, por medio de un canal 610B. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 650 es un receptáculo de residuos. En algunos modos de realización, el receptáculo corriente abajo 650 es un colector de fracciones.
En la FIG. 6C, el primer mecanismo de enrutamiento 600 dirige el flujo de la segunda fase móvil al segundo mecanismo de enrutamiento fluídico 620 en el sentido indicado por la flecha 665. El segundo mecanismo de enrutamiento 620 está configurado para dirigir la segunda fase móvil al circuito de muestra 635 por medio del canal 675D en el sentido indicado por la flecha 715. El circuito de muestra 635A está conectado al segundo mecanismo de enrutamiento fluídico por medio del puerto 625C y el puerto 625F. El segundo mecanismo de enrutamiento fluídico 620 está configurado para dirigir el flujo de la segunda fase móvil al primer mecanismo de enrutamiento fluídico 600 por medio del canal 675C en el sentido indicado por la flecha 680. El segundo mecanismo de enrutamiento fluídico y el primer mecanismo de enrutamiento fluídico están conectados por medio del puerto 625D y 605C y la segunda fase móvil se dirige a la parte corriente abajo 40B de la segunda unidad de separación por medio del canal 610D en el sentido indicado por la flecha 690.
El esquema ilustrado en la FIG. 6D representa la misma configuración del primer mecanismo de enrutamiento fluídico 600 y el segundo mecanismo de enrutamiento fluídico 620 como se muestra en la FIG. 6B, excepto que en la FIG.
6D, el segundo mecanismo de enrutamiento fluídico dirige ahora el flujo de la primera fase móvil al circuito de muestra 630C en el sentido indicado por la flecha 720. El circuito de muestra 630C está conectado al segundo mecanismo de enrutamiento fluídico por medio del puerto 625G y el puerto 625H. El canal 675F conecta el puerto 625A y el puerto 625G. El canal 675E conecta el puerto 625D y el puerto 625H. Como se representa en la FIG. 6B, el circuito de muestra 630C comprende una columna de atrapamiento 635B, que puede comprender una fase estacionaria, tal como una fase estacionaria como se describe en el presente documento.
Como se ejemplifica en la FIG. 6D, la parte de la muestra eluida de la primera unidad de separación y retenida selectivamente en la columna de atrapamiento 635A está ahora en aislamiento tanto de la primera unidad de separación 20 como de la segunda unidad de separación 40A y 40B.
En algunos modos de realización, la pluralidad de columnas de atrapamiento 635A-635E, tal como se muestra en la FIG. 6A-FIG. 6D, pueden comprender la misma fase estacionaria. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, al menos una de la pluralidad de columnas de atrapamiento 635A-635E, tal como se muestra en la FIG. 6A-FIG. 6D, puede comprender la misma fase estacionaria que el material de fase estacionaria usado en la columna RPLC de primera dimensión. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono. En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 18 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C18). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 8 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C8). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 4 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de hidrocarburo (por ejemplo, una cadena C-18, C-8 o C-4) unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno).
La cromatografía 2D se puede realizar en modos fraccionado, pseudocompleto o completo. El fraccionamiento proporciona la caracterización de una región seleccionada del cromatograma, mientras que el modo completo proporciona la caracterización de todo el cromatograma. El modo pseudocompleto proporciona una separación completa de regiones seleccionadas del cromatograma. Véase Venkatramani, C.J. et al., J. Sep. Sci. 2014, 22, en imprenta. La interfaz en el sistema RPLC x SFC 2D, es decir, la primera unidad de enrutamiento fluídico, se puede adaptar para realizarse en uno cualquiera o más de los modos fraccionado, pseudocompleto o completo. Por ejemplo, un sistema RPLC x SFC 2D que tiene cualquiera de la unidad de enrutamiento fluídico de interfaz como se representa en las figuras 3-6 en el presente documento se puede usar en el modo fraccionado. Un sistema que tiene una unidad de enrutamiento fluídico de interfaz que comprende dos circuitos de muestra (teniendo cada uno una columna de atrapamiento) como se representa en las figuras 5A y 5B se puede usar en modo pseudocompleto si una columna RPLC larga acoplada con un caudal lento de la fase móvil en la primera dimensión permitiría una serie completa de
una fracción en la separación de segunda dimensión, mientras que otra fracción se recoge en el segundo circuito de muestra. Un sistema que tiene una unidad de enrutamiento fluídico de interfaz con el rasgo característico de detención de muestra como se representa en las figuras 6A - 6D se puede usar en modo completo o en modo pseudocompleto ya que múltiples fracciones de la separación de primera dimensión se pueden recoger y retenerse para análisis posterior en la segunda dimensión cuando la segunda unidad de separación está disponible.
Los criterios de separación en la segunda dimensión pueden depender de la naturaleza de los analitos que se van a separar. Se pueden requerir diferentes materiales de fase estacionaria para la columna SFC para proporcionar una separación óptima para los diversos analitos eluidos de la columna RPLC de primera dimensión. Por tanto, se proporciona un sistema de cromatografía RPLC x SFC 2D descrito en el presente documento, en el que la segunda unidad de separación comprende una agrupación de columnas SFC, en el que las columnas SFC en la agrupación están dispuestas en una configuración paralela; y una segunda unidad de enrutamiento fluídico para dirigir el flujo de la segunda fase móvil a una columna SFC deseada (o identificada previamente) en la agrupación. En algunos modos de realización, la segunda unidad de separación comprende además una columna concentradora localizada corriente arriba de cada columna SFC en la agrupación de columnas SFC. En algunos modos de realización, la columna concentradora comprende una fase estacionaria. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase inversa. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender un gel de sílice unido a cadena de carbono. En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 18 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C18). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 8 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C8). En algunos modos de realización, el gel de sílice unido a cadena de carbono puede comprender una cadena de carbono que tiene 4 carbonos de longitud (es decir, gel de sílice en fase inversa con C4). En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase inversa puede comprender una cadena de hidrocarburo (por ejemplo, una cadena C-18, C-8 o C-4) unida a un núcleo de polímero tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno).
En referencia a los dibujos, la FIG. 7A y FIG. 7B son esquemas de una subunidad corriente abajo ejemplar 40B de la segunda unidad de separación que comprende una segunda unidad de enrutamiento fluídico 800 y una agrupación de columnas SFC. La primera unidad de enrutamiento fluídico 30 está conectada a la segunda unidad de enrutamiento fluídico 800 en el puerto 805A. La primera unidad de enrutamiento fluídico 30 dirige la segunda fase móvil a la segunda unidad de enrutamiento fluídico 800 en el sentido indicado por la flecha 810. La segunda unidad de enrutamiento 800 comprende una pluralidad de puertos, tales como el puerto 805A y el puerto 805B, y una pluralidad de canales, tales como el canal 810A. Como se representa en la FIG. 7A, la segunda unidad de enrutamiento fluídico 800, dirige la segunda fase móvil a una columna SFC deseada (o identificada previamente) 815A en el sentido indicado por la flecha 825. Una columna concentradora 820A está localizada corriente arriba de la columna SFC 815A.
En algunos modos de realización, un mecanismo de enrutamiento 830 está localizado opcionalmente corriente abajo de la columna SFC. Como se representa en la FIG. 7A, el mecanismo de enrutamiento 830 dirige la segunda fase móvil a un detector 250 por medio del canal 810B en el sentido indicado por la flecha 835.
La FIG. 7B representa la misma agrupación de columnas SFC como se ilustra en la FIG. 7A, pero en la FIG. 7B, la segunda unidad de enrutamiento fluídico 800 está configurada para dirigir la segunda fase móvil desde la primera unidad de enrutamiento fluídico a una segunda columna de cromatografía SFC deseada 815B. Como se representa en la FIG. 7B, la segunda columna de cromatografía SFC deseada está conectada a la segunda unidad de enrutamiento fluídico 800 y al mecanismo de enrutamiento 830 por medio del puerto 805E y el puerto 805F. La segunda unidad de enrutamiento fluídico 800 dirige la segunda fase móvil en el sentido indicado por la flecha 840. Opcionalmente, una columna concentradora 820B está localizada corriente arriba de la columna s Fc 815B.
En algunos modos de realización, la agrupación de columnas SFC comprende una pluralidad de columnas SFC en las que una columna SFC individual, tal como 815A, puede comprender la misma fase estacionaria que al menos otra columna SFC individual en la agrupación, tal como 815B. En algunos modos de realización, la agrupación de columnas SFC comprende una pluralidad de columnas SFC en las que una columna SFC individual, tal como 815A, puede comprender una fase estacionaria diferente de las otras columnas SFC individuales de la agrupación, tal como 815B. En algunos modos de realización, la fase estacionaria puede comprender una fase estacionaria en fase normal. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales propilciano. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales aminopropilo. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales etilpiridina. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales de ácido sulfónico y/o fenilo. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es sílice modificada con grupos funcionales 1,2-dihidroxipropilpropiléter. En algunos modos de realización, la fase estacionaria en fase normal es un polímero, tal como un polímero orgánico (por ejemplo, poliestireno), modificado con un grupo funcional (por ejemplo, un grupo funcional cianopropilo, aminopropilo, etilpiridina, ácido sulfónico, fenilo o 1,2-dihidroxipropilpropiléter).
En algunos modos de realización, la agrupación de columnas SFC comprende una pluralidad de columnas
concentradoras en las que una columna concentradora individual, tal como 820A, puede comprender la misma fase estacionaria que al menos otra columna concentradora individual en la agrupación, tal como 820B. En algunos modos de realización, la agrupación de columnas SFC comprende una pluralidad de columnas concentradoras en las que una columna concentradora individual, tal como 820A, puede comprender una fase estacionaria diferente de las otras columnas concentradoras individuales en la agrupación, tal como 820B.
La FIG. 8A y FIG. 8B representan esquemas de un sistema LC-SFC 2D ejemplar con una interfaz que implica una válvula dúo de 2 posiciones/4 puertos V1 controlada electrónicamente y una columna de atrapamiento Atrap 1. La fase móvil de la bomba 1 fluye a través del inyector a la columna primaria en fase inversa. El eluyente posdetección D1 fluye hacia la válvula de muestreo V1. En la posición de inicio/análisis, el eluyente de columna primaria fluye a través del circuito de muestreo Circuito 1 saliendo al residuo. La fase móvil de la bomba SFC fluye a través de la columna de atrapamiento Atrap 1 a la columna SFC (FIG. 8A). Esto condiciona la columna de atrapamiento Atrap 1 y la columna SFC. Hay un flujo ininterrumpido de fase móvil a través de columnas primarias y secundarias. Cuando los componentes de interés se eluyen de la columna primaria, la válvula V1 se conmuta (posición de atrapamiento) transfiriendo el eluyente de columna primaria a la columna de atrapamiento Atrap 1 (FIG. 8b ). Al conmutar la válvula V1 de vuelta a la posición de inicio/análisis, descarga los componentes de muestra de la columna de atrapamiento T1 a la columna SFC. La separación en columna SFC se sigue usando un detector UV D2 y/o un espectrómetro de masas. El intercambio de posiciones de la bomba SFC y la columna en la válvula V1 dará como resultado un flujo en contracorriente durante la conmutación de la válvula.
En la cromatografía 2D que implica gradientes repetitivos en la dimensión secundaria, la frecuencia de transferencia (muestreo) del eluyente de columna primaria a la columna secundaria depende de la velocidad de resolución de la columna secundaria incluyendo el tiempo de reequilibrio. En LC-SFC 2D, la separación de dimensión secundaria dura aproximadamente 2-3 minutos, lo que limita la frecuencia de transferencia del eluyente de columna primaria a la columna secundaria. Si múltiples fracciones de analito (por ejemplo, pares diastereómeros en una muestra que contiene una mezcla de estereoisómeros) se eluyen de la columna primaria en 2-3 minutos, la interfaz de LC-SFC 2D con una única columna de atrapamiento mostrada en la FIG. 8A y FIG. 8B puede no ser práctica. Una opción es reducir el caudal y el gradiente de columna primaria para reponer las necesidades de muestreo de la velocidad de columna secundaria. Sin embargo, esto dará como resultado una forma de pico deficiente y por lo tanto impedirá el análisis aquiral/quiral simultáneo. Esto requerirá una interfaz con múltiples columnas de atrapamiento para cumplir con las necesidades de muestreo de la columna secundaria.
La FIG. 9 muestra esquemas de un sistema de LC-SFC 2D ejemplar con una interfaz que usa una agrupación de columnas de atrapamiento y columnas SFC secundarias. Esta configuración se usa para analizar múltiples secciones del cromatograma. En la posición de inicio/análisis mostrada en la FIG. 9 , el eluyente de la columna primaria posdetección fluye a través de una válvula dúo 2 posiciones/4 puertos V1 totalmente automatizada que sale al residuo. La fase móvil SFC fluye como sigue: bomba SFC a través de la válvula V1, a la válvula de disco de detención V2, de vuelta a la válvula V1 y a continuación a la(s) columna(s) SFC. En la válvula V2, la fase móvil de SFC fluye a través de una tubería de derivación o bien una agrupación de columnas de atrapamiento. Esto condiciona la(s) columna(s) de atrapamiento y SFC. Hay un flujo ininterrumpido de fase móvil a través de columnas primarias y secundarias. Cuando los componentes de interés se eluyen de la columna primaria, la válvula V1 se conmuta (de inicio a transferencia) transfiriendo el eluyente de columna primaria a la válvula de disco de detención V2 (salida). Al conmutar la válvula de disco de detención V2 hacia adelante y hacia atrás entre el modo de derivación y la posición de atrapamiento, los componentes se transfieren a diferentes columnas de atrapamiento. Después de la transferencia del eluyente de columna primaria, la válvula V1 se conmuta a la posición de inicio, desviando el eluyente de columna primaria al residuo. Esto invierte el flujo de la fase móvil que entra en la válvula V2 (V2-salida a V2-entrada). El sentido del flujo de la SFC en la válvula de disco de detención V2 se invierte. Los componentes retenidos en las columnas de atrapamiento se vuelven a descargar posteriormente en una columna SFC o una agrupación de columnas SFC para otra separación dependiendo de la aplicación. Una agrupación de columnas SFC proporciona flexibilidad adicional al sistema, ya que podría no ser práctico resolver diferentes componentes en una sola fase estacionaria quiral. La separación de columna secundaria se sigue usando un detector UV o EM. La interfaz automatizada es el componente clave del sistema LC-SFC 2D que permite el análisis aquiral, quiral simultáneo de la muestra en una sola serie cromatográfica.
Se pretende y se entiende que, en el sistema cromatográfico 2D, todas y cada una de las variaciones de la primera unidad de separación descrita en el presente documento se pueden combinar con todas y cada una de las variaciones de la segunda unidad de separación descrita en el presente documento, y/o todas y cada una de las combinaciones de la primera unidad de enrutamiento fluídico descrita en el presente documento, como si todas y cada una de las combinaciones se describieran individualmente.
El sistema RPLC x SFC 2D de la presente invención aborda el problema asociado con la incompatibilidad de disolventes usados en la RPLC de primera dimensión y la SFC de segunda dimensión usando una columna de atrapamiento. La fase estacionaria en la columna de atrapamiento retiene los analitos mientras permite que fluyan los disolventes de la RPLC. Esto permite que los analitos se concentren en un pequeño volumen para inyectarlos en la SFC para otra separación. Un mayor contenido de agua en la dimensión SFC da lugar a una menor resolución/sensibilidad. Como se demuestra en el ejemplo 2, usando un sistema sin una columna de atrapamiento,
solo una pequeña fracción se puede transferir a la columna SFC sin que afecte adversamente a la resolución y sensibilidad del análisis SFC (FIG. 11). Un volumen de transferencia de 12 pl dio lugar a un leve ensanchamiento del segundo pico. Cuando se transfirió una fracción de 24 pl, se observa un ensanchamiento significativo del segundo pico, lo que se traduce en una pérdida significativa de sensibilidad. Por el contrario, como se muestra en el ejemplo 3, cuando se usó un sistema como se representa en las figuras 8A y 8B, que tiene una columna de atrapamiento que contiene un material de fase estacionaria con C-18 (por ejemplo, sílice con C-18), se transfirió un margen de 160 pl y se obtuvo una excelente resolución y sensibilidad (FIG. 12). Este sistema permite la inyección de picos desde la RPLC de primera dimensión a la SFC de segunda dimensión con un impacto mínimo en la resolución y sensibilidad del análisis SFC. Por ejemplo, el ejemplo 5 compara la separación de una sustancia farmacéutica quiral con su enantiómero usando un sistema SFC convencional y un sistema LC-SFC 2D de la presente invención. Los resultados demostraron que tanto la resolución como la sensibilidad se conservaron en la LC-SFC 2D en comparación con la SFC convencional. Se puede usar el enfoque ortogonal, las condiciones en fase normal y fase inversa en las dos dimensiones, para incrementar el nivel de confianza de la evaluación de pureza de pico de HpLC debido a la capacidad de pico multiplicativa del sistema multidimensional.
Procedimientos de uso
Otro factor a considerar cuando se desarrollan sistemas 2D es la capacidad para funcionar en modo en línea. Algunas ventajas de este enfoque incluyen la facilidad de automatización, reproducibilidad del análisis y la transferencia exacta de las fracciones de la primera a la segunda dimensión sin ninguna pérdida de rendimiento o contaminación.
Una aplicación que no se tiene en cuenta de los sistemas 2D es el uso en análisis de alto rendimiento. En la industria farmacéutica, por ejemplo, los principios activos (API) se deben caracterizar completamente según las directrices del ICH. Véase International Conference on Harmonisation (2006), Q3A(R2): Impurities in New Drug Substances. Para el análisis de pureza, se desarrollan dos procedimientos analíticos independientes. Un procedimiento de RPLC evalúa normalmente la pureza aquiral (procedimiento de impurezas y sustancias relacionadas) y un procedimiento quiral que evaluaría la pureza quiral (cantidad de enantiómero no deseado). Un sistema 2D que pueda generar resultados quirales y aquirales simultáneos tendría un gran impacto durante el desarrollo del procedimiento de API. La preparación de muestras, los tiempos de análisis cromatográfico y el análisis de datos se reducirían para permitir un análisis de mayor rendimiento.
Se ha informado previamente del uso de análisis RPLC x RPLC 2D para análisis aquiral-quiral simultáneo (J. Sep. Sci. 2012, 35:1748). Sin embargo, en el mundo de los API, la mayoría de los procedimientos quirales son procedimientos NPLC y, por tanto, un sistema RPLC x NPLC 2D tendría una importancia significativa para lograr un análisis aquiral-quiral simultáneo. Como se indica anteriormente, la incompatibilidad de las fases móviles de la fase inversa y la fase normal haría que este enfoque fuera muy complicado. La cromatografía de fluidos supercríticos, una técnica en fase normal, también se ha usado para el análisis quiral de API a escala analítica así como preparativa. Además de ser una técnica “reciente”, SFC es superior a NPLC debido a su versatilidad, mayor eficacia, mayor rendimiento y tiempos de análisis más rápidos. Los fluidos supercríticos tienen viscosidad baja y difusividad alta (similar a los gases) para permitir caudales mayores y tiempos de reequilibrio más rápidos y tienen una alta densidad (similar a los líquidos) para proporcionar un poder de solvatación alto. Se informó del primer LC x SFC 2D en línea por Cortes et al. en 1992 (J. Microcol. Sep. 1992, 4:239-244). La interfaz que Cortes et al. desarrollaron es bastante complicada e implica múltiples etapas: eliminación del disolvente de primera dimensión por el paso de gas nitrógeno, uso de CO2 presurizado para transferir los analitos en una interfaz de impactador, y a continuación elución de los analitos desde la interfaz de impactador a la columna capilar SFC por programación de presión de la fase móvil de CO2. La adopción de esta interfaz para separaciones por RPLC x s Fc 2D convencionales estaría limitada debido a la etapa de eliminación de disolvente. Cortes et al. usaron THF (punto de ebullición relativamente bajo, 66 °C) como fase móvil de LC, mientras que la mayoría de las separaciones por RPLC convencionales son de base acuosa.
La presente invención demuestra una nueva interfaz automatizada para acoplar RPLC y SFC. Por tanto se proporcionan procedimientos de uso de los sistemas de cromatografía RPLC x SFC 2D descritos en el presente documento para la separación y análisis de muestras, por ejemplo mezclas de muestras complejas de las que puede ser difícil lograr un análisis completo por cromatografía 1D u otra cromatografía 2D.
En algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para analizar una muestra (tal como una muestra compleja) usando un sistema de cromatografía descrito en el presente documento que comprende: separar en primer lugar la muestra compleja en fracciones por cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC); y separar además las fracciones de la dimensión RPLC por cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) en la segunda dimensión. La separación en la primera dimensión (por ejemplo, RPLC en una fase estacionaria con C-18) se basa en diferencias de determinados caracteres o propiedades de los componentes en la muestra compleja (por ejemplo, hidrofobia); mientras que la separación en la segunda dimensión (por ejemplo, SFC en una fase estacionaria de gel de sílice en fase normal) se basa en diferencias de otros caracteres o propiedades de los componentes (por ejemplo, quiralidad), proporcionando por tanto un mejor análisis completo que el uso de cromatografía unidimensional.
El desarrollo de procedimientos cromatográficos quirales para compuestos con múltiples centros quirales puede ser complicado ya que el número de estereoisómeros potenciales se incrementa significativamente con el incremento en
el número de centros quirales (número de estereoisómeros = 2N, donde N es el número de centros quirales en un compuesto). El desarrollo del procedimiento quiral es principalmente un procedimiento de prueba y error donde se realiza una selección de columnas y fases móviles exhaustiva para identificar aciertos potenciales. Sin embargo, el desarrollo de procedimientos cromatográficos quirales para compuestos con 3 o más centros quirales puede ser muy complicado debido al incremento significativo en el número de estereoisómeros. Para los compuestos farmacéuticos con múltiples centros quirales, una práctica común es controlar la pureza enantiómera de los materiales de partida entrantes y demostrar el control del procedimiento (posibilidad de epimerización). Esto limitaría el número de estereoisómeros potenciales en el API final.
Sin embargo, esta estrategia de control se podría cuestionar por algunos organismos competentes que autorizan el desarrollo de un procedimiento quiral API.
El RPLC x SFC 2D en línea de la presente invención permite el análisis aquiral y quiral simultáneo (análisis por una única inyección de muestra o en la misma serie analítica) de muestras farmacéuticas. El pico de API, en una mezcla de contenido acuoso y orgánico, se retendría en una columna de atrapamiento C-18 de volumen pequeño y a continuación se volvería a descargar sobre la columna SFC de segunda dimensión. Por tanto, en algunos modos de realización, se proporciona un procedimiento para análisis aquiral-quiral de una muestra que comprende una mezcla de componentes estereoisómeros usando un sistema de cromatografía descrito en el presente documento que comprende: resolver los componentes diastereómeros en la muestra por RPLC en la primera dimensión, lo que proporciona pureza aquiral de la muestra; y resolver los pares enantiómeros por SFC en la segunda dimensión en la misma serie analítica, lo que proporciona además pureza quiral (% de exceso enantiómero) de los componentes en la muestra. La pureza aquiral de la muestra se puede determinar en base a un cromatograma de la separación por RPLC, por ejemplo, por el área de pico relativa de los picos en un cromatograma obtenido en un detector UV de la primera unidad de separación. La pureza quiral o el exceso enantiómero de cada par enantiómero se puede determinar en base a un cromatograma de la separación por SFC, por ejemplo, por el área de pico relativa de los picos en un cromatograma obtenido en un detector UV de la segunda unidad de separación, o el cromatograma iónico total obtenido en un espectrómetro EM conectado a la segunda unidad de separación.
Se pretende y se entiende que todos y cada uno de los modos de realización del sistema cromatográfico 2D se pueden usar en los procedimientos para analizar una muestra compleja o los procedimientos para el análisis aquiral-quiral simultáneo como si todas y cada una de las combinaciones se describieran individualmente.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar pero no para limitar la invención.
Productos químicos y reactivos
El dióxido de carbono (CO2) se obtuvo de Praxair (Danbury, CT, EE. UU.). El acetonitrilo (ACN) se adquirió a Avantor's J.T. Baker (Center Valley, PA, EE. UU.). Metanol (MeOH), alcohol isopropílico (IPA), alcohol etílico (EtOH), ácido fórmico al 98,0 % - 100,0 % e hidróxido de amonio al 28,0 % - 30,0 % (NH4OH) se adquirieron a e Md chemicals (Gibbstown, NJ, EE. UU.). El formiato de amonio se adquirió a Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El agua Millipore de calidad HPLC se obtuvo del dispensador de agua Purelab ultra Millipore. El óxido de frans-estilbeno (TSO) se adquirió a TCI (Tokio, Japón). La sustancia farmacéutica A usada en este estudio se sintetizó por el departamento de química de procesos de Genentech, CA, EE. UU.
Ejemplo 1: instrumentación
El instrumento analítico es un sistema 12602D-LC-SFC bidimensional personalizado con espectrómetro de masas de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.). La unidad RPLC consiste en una bomba cuaternaria Agilent 1260 (G1311B), un muestreador automático 1260 HiP ALS (G1367E) y un detector UV de longitud de onda múltiple Agilent 1260 (G1365C). Se usan accesorios y tubos de acero inoxidable en todo el sistema debido a consideraciones de alta presión. La unidad SFC consiste en una bomba binaria de SFC 1260 (G4302A) con una válvula de control de disolvente de tres posiciones, un desgasificador 1260 HiP (G4225A), un compartimento de columna termostatizado 1290 (G1316C), una impulsión por válvula Agilent 1290 Infinity de ocho posiciones (G1170A), un Agilent 1260 DAD (G1315C) equipado con una celda de flujo de alta presión y un módulo de control de SFC Agilent 1260 Infinity (G4301A). Parte del flujo de SFC se dirigió hacia un EM cuadrupolo Agilent 6120. Se usó una bomba Agilent 1260 iso (G1310B) para generar un flujo de reposición de 0,15 ml/min para compensar la pérdida de scCO2. Se instaló un Flexcube Agilent 1290 (G4227A) para permitir la detención de múltiples picos en diferentes columnas de atrapamiento usando una válvula de conmutación de 12 puertos personalizada. El control del instrumento y la recogida de datos se realizaron con el programa informático Agilent Chemstation (Santa Clara, CA, EE. UU.).
La FIG. 10 es una imagen fotográfica de una válvula de disco de detención ejemplar (por ejemplo, la válvula V2 presentada en la FIG. 9). Como se muestra en la FIG. 10, hay cuatro columnas de atrapamiento que se pueden usar para detención de pico. Adicionalmente, como se representa, hay un circuito de derivación que permite que la fase móvil que se origina en la primera unidad de separación o bien la fase móvil que se origina en la segunda unidad de
separación se dirijan corriente abajo sin pasar a través de una columna de atrapamiento.
Ejemplo 2
El objetivo principal del presente estudio fue evaluar el efecto del volumen de la fase móvil transferida de la primera dimensión a la segunda dimensión sobre la resolución de la separación en la segunda dimensión (SFC). Aquí, se usó un sistema de cromatografía multidimensional para separar los enantiómeros del óxido de frans-estilbeno (TSO). La primera dimensión (RPLC) se interconectó con la segunda dimensión (SFC) usando una válvula con un circuito de muestra que carece de una columna de atrapamiento. El circuito de muestra se usó para almacenar un volumen seleccionado de la primera fase móvil que contenía una parte de la muestra eluida de la primera dimensión. Posteriormente, el volumen de la primera fase móvil almacenada en el circuito de muestra se transfirió a la segunda dimensión para otra separación. Se usaron circuitos de muestra que permitían el almacenamiento y la posterior transferencia de 6 pl, 12 pl y 24 pl de fase móvil.
Para la primera dimensión de RPLC, se utilizó una columna ACQUITY UPLC HSS T3 1,8 pm 2,1 x 50 mm en una condición isocrática con 90/10 ACN/agua a un caudal de 0,2 ml/min. La detección UV se realizó a 225 nm.
Para la segunda dimensión de SFC, se utilizó una columna Chiralcel OD3 3,0 pm 4,6 mm x 50 mm a 40 °C con un flujo isocrático de 95:5 scCO2 (MPA)/IPA con NH4OH al 0,1 % (MPB). El caudal fue de 4,0 ml/min con una presión de salida de 13 MPa (130 bar) y una temperatura de la boquilla de 60 °C.
El circuito de atrapamiento para este experimento fue un capilar flexible (0,5 mm x 150 mm con un volumen interno de aproximadamente 29 pl). Los tres tiempos de conmutación fueron 0,03 min, 0,06 min y 0,12 min correspondientes a volúmenes de transferencia de 6 pl, 12 pl y 24 pl, respectivamente (basado en un caudal de 0,2 ml/min).
La FIG. 11 es un cromatógrafo de compilación de las mediciones de absorbancia UV (mUA) con el tiempo (minutos) para la separación multidimensional de TSO usando un sistema con tres configuraciones de circuito de muestra (6 pl, 12 pl, 24 pl). Como se ilustra en la FIG. 11, incrementar el volumen de transferencia de la primera fase móvil a la segunda dimensión reduce la resolución y la sensibilidad en la segunda dimensión.
Ejemplo 3
En este ejemplo, se evaluó la eficacia de transferir una muestra de una primera dimensión (RPLC) a una segunda dimensión (SFC) usando una interfaz que contiene una columna de atrapamiento.
Se analizaron soluciones estándar de TSO que variaban de 0,005 mg/ml a 0,25 mg/ml usando el sistema LC-SFC 2D ilustrado en la FIG. 8A y FIG. 8B. El segundo detector fue un detector UV. En base a los resultados del ejemplo 2, se evaluó una columna de atrapamiento en fase inversa con C18 de volumen interno bajo.
El cromatógrafo en fase inversa utilizado en la primera dimensión fue una columna Acquity UPLC HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 pm) de Waters Corporation (Milford, MA, EE. UU.). La separación en la primera dimensión se realizó en condiciones isocráticas con 50:50 (ácido fórmico al 0,05 % en agua):(ácido fórmico al 0,05 % en ACN) a un caudal de 0,2 ml/min. La columna RPLC se colocó en el compartimento de la columna térmica SFC a 40 °C. La detección UV se realizó a 225 nm. El volumen de inyección de primera dimensión fue de 5 pl.
El cromatógrafo de fluidos supercríticos usado en la segunda dimensión fue una columna Chiralcel OD3 (50 x 4,6 mm, 3,0 pm) de Chiral Technologies (West Chester, PA, EE. UU.). La separación en la segunda dimensión se realizó en un flujo isocrático de 95:5 (scCO2):(alcohol isopropílico con hidróxido de amonio al 0,1 %). La temperatura de la columna usada fue de 40 °C y el caudal se estableció en 4,0 ml/min con una presión de salida de 13 MPa (130 bar) y una temperatura de boquilla de 60 °C. El uso de la columna concentradora en la parte superior de la columna SFC es opcional.
Como se analiza anteriormente, se usó una columna de atrapamiento de volumen bajo en la interfaz de las dos dimensiones. Específicamente, la columna de atrapamiento usada fue una columna SunShell C18 (5,0 x 1,0 mm, 5 pm) de ChromaNik Technologies (Osaka, Japón).
Se prepararon soluciones estándar de TSO (0,25, 0,1, 0,05, 0,025, 0,01, 0,005 mg/ml) en 50:50 ACN/agua. Se transfirió un margen de 0,8 min (~160 pl) a través del ápice del pico de TSO a la columna de atrapamiento que se acondicionó con condiciones de SFC iniciales (scCO2 al 100 %). Se mantuvo una retención inicial al 0 % (IPA con NH4OH al 0,1 %) durante los primeros 0,2 min después de la conmutación y a continuación se incrementó al 5 % (IPA con NH4OH al 0,1 %) en 0,1 min con una retención de 2,35 min. La columna se reequilibró con 0 % (IPA con NH4OH al 0,1 %) durante 0,2 min. Las muestras se procesaron por triplicado. La detección en la segunda dimensión se realizó por detección UV a 225 nm.
La FIG. 12 es un cromatógrafo de compilación de las mediciones de absorbancia UV (mUA) con el tiempo (minutos) para la separación multidimensional de concentraciones variables de TSO. El cromatograma superior se midió
después de la separación en la primera dimensión. Se observa que los enantiómeros del estándar de TSO se eluyen conjuntamente en la columna primaria en fase inversa. El pico que se eluye de la columna primaria posdetección se desvió a la columna de atrapamiento y se volvió a descargar en la columna secundaria para otra separación. Como se muestra en la FIG. 12, el cromatógrafo inferior se midió después de la separación en la segunda dimensión. Aquí, se observa que los enantiómeros del estándar de TSO se resuelven al valor de referencia en la columna quiral secundaria.
Además, como se ilustra en la FIG. 12, las curvas de superposición demostraron la linealidad de la respuesta del detector en el intervalo de concentración evaluado con un coeficiente de correlación mayor que 0,99 (datos no mostrados). En un estudio diferente, se transfirieron volúmenes que variaban de 10 a 100 pl (por la válvula afinada V1) a la columna SFC secundaria. Los resultados de este estudio mostraron una respuesta lineal en el intervalo evaluado (resultados no mostrados).
Ejemplo 4
En este ejemplo, el sistema LC-SFC 2D descrito en el ejemplo 3 se sometió a prueba además para demostrar la capacidad del análisis aquiral-quiral simultáneo de una muestra de la sustancia farmacéutica A.
El cromatograma en fase inversa utilizado en la primera dimensión fue una columna SunFire C18 (150 x 3,0 mm, 3,5 pm) de Waters Corporation (Milford, MA, EE. UU.) a una temperatura de 40 °C. La MPA fue formiato de amonio 5 mM, pH3,3 y la MPB fue ácido fórmico al 0,05 % en ACN. El programa de MP para la columna RPLC fue del 5 % B al 25 % B en 5 min, al 29 % B en 25 min, al 90 % B en 30 min, y a continuación reequilibrio al 5 % B durante 5 min. El caudal se fijó en 1,0 ml/min. La detección UV de primera dimensión se realizó a 340 nm. El volumen de inyección de primera dimensión fue de 5 pl.
El cromatograma de fluidos supercríticos usado en la segunda dimensión fue una columna Chiralpak IC3 (50 x 4,6 mm, 3 pm) de Chiral Technologies (West Chester, PA, EE. UU.) a 40 °C con un flujo de MP inicial de 65:35 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB). El caudal fue de 4,0 ml/min con una presión de salida de 13 MPa (130 bar) y una temperatura de boquilla de 60 °C. Se usaron cuatro columnas Zorbax Eclipse XDB-C18 (5,0 x 2,1 mm, 1,8 pm) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.) como columna de atrapamiento.
Se preparó una muestra de la sustancia farmacéutica A a 0,5 mg/ml en 25:75 ACN/agua con FA al 0,05 %. Se transfirió un margen de 0,1 min (100 pl) a través del ápice a la columna de atrapamiento preacondicionada. La columna SFC se mantuvo en una retención isocrática (35 % MPB) durante 0,5 min, a continuación a 55 % B en 2 min con una retención de 3 min. La columna se reequilibró al 35 % B durante 0,2 min. La detección en la segunda dimensión se realizó por detección SIM-EM a 565 m/z.
Como se representa en la FIG. 13, los resultados de pureza aquiral y quiral fueron de un 99,0 % y 100 % de exceso enantiómero (% ee), respectivamente. Una curva de superposición de una muestra no enriquecida sin enantiómero detectado (abajo), una muestra enriquecida con un 0,1 % del enantiómero no deseado (centro) y una muestra enriquecida con un 0,5 % del enantiómero no deseado (arriba) demostró la capacidad de este sistema para detectar el enantiómero no deseado a niveles de un 0,1 %.
Ejemplo 5
El presente estudio se realizó para demostrar la comparabilidad tanto de la sensibilidad como de la resolución entre la SFC de segunda dimensión en un sistema LC-SFC 2D y la SFC convencional (1D).
El sistema LC-SFC 2D fue el mismo que el sistema usado en el ejemplo 4. Se modificaron el programa de fase móvil y el tiempo de conmutación. En la primera dimensión, el programa de fase móvil fue del 25 % B durante 5 min, del 25 % al 90 % B a los 15 min, y a continuación se reequilibró al 25 % B durante 5 min. Se transfirió un margen de 0,1 min (100 pl) en el ápice del pico a la columna de atrapamiento. Las condiciones para la SFC convencional fueron las mismas que las usadas en la segunda dimensión de LC-SFC 2D (descritas en el ejemplo 4).
Se analizaron soluciones estándar de una muestra de la sustancia farmacéutica A que contenía niveles variables del enantiómero no deseado (intervalo de un 0,1 a un 2,0 %) usando ambas técnicas (LC-SFC 2D y SFC). Se muestra una superposición de los cromatogramas estándar de las técnicas SFC y LC-SFC 2D en la FIG. 14A y FIG. 14B, respectivamente. Los resultados ilustraron separaciones comparables obtenidas con ambas técnicas. Tanto la resolución como la sensibilidad se conservaron en LC-SFC 2D en comparación con la SFC convencional.
Como se demuestra en el ejemplo 2, la introducción de la fase móvil en fase inversa en la dimensión SFC afecta negativamente a la resolución y sensibilidad de la separación por SFC. Aunque la fase móvil en fase inversa todavía se introduce en la dimensión de SFC con el sistema LC-SFC 2D descrito aquí, el uso de una columna de atrapamiento permite una interfaz de LC-SFC que no compromete la separación por SFC corriente abajo.
Ejemplo 6
En este ejemplo, se demuestra una separación cromatográfica quiral compleja de sensibilidad y selectividad deseadas en un solo análisis.
La sustancia farmacéutica A tiene tres centros quirales y por lo tanto tiene cuatro pares diastereómeros (ocho estereoisómeros potenciales). Se preparó una mezcla de los 4 pares diastereómeros en 30/70 ACN/agua a 0,05 mg/ml. La proporción de los dos enantiómeros en cada par (RRS/SRR, SRS/RSR, SSS/RRR; RRS/SSR) fue de aproximadamente 2:1.
La separación de cada estereoisómero se logró usando el sistema LC-SFC 2D mostrado en la FIG. 9. Las condiciones experimentales en la columna primaria fueron las mismas que las descritas en la sección ejemplo 4. Se usaron cuatro columnas de atrapamiento con Flexcube (Agilent) en la dimensión secundaria para atrapar los 4 pares diastereómeros. Después de la inyección de muestra, las columnas de atrapamiento se acondicionaron con 60:40 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB) durante un minuto con la excepción de la columna de atrapamiento 2 que se acondicionó con 65:35 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB). El eluyente de columna primaria correspondiente a un margen de 0,1 min (100 pl) en el ápice de los picos diastereómeros a 10,55 min, 10,95 min, 11,80 min y 13,30 min se transfirieron secuencialmente a cuatro columnas de atrapamiento. Los componentes atrapados se cromatografiaron secuencialmente comenzando en 14,0 min, 18,0 min, 23,5 min y 27,5 min respectivamente en la dimensión secundaria. Se mantuvo una retención inicial a 60:40 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB) durante los primeros 0,5 min después de la conmutación y a continuación se incrementó a 40:60 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB) en 2,5 min con una retención de 0,3 min con la excepción del componente atrapado 2. Para el componente 2, se mantuvo la retención inicial a 65:35 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB) durante el primer 1 min después de la conmutación y a continuación se incrementó a 55:45 scCO2 (MPA)/metanol con hidróxido de amonio al 0,1 % (MPB) en 3,0 min con una retención de 0,3 min. La detección en la segunda dimensión se realizó por detección SIM-EM a 565 m/z.
Como se ilustra en la FIG. 15, la columna RPLC aquiral primaria resuelve los cuatro pares diastereómeros (RSS/SRR, SRS/RSR, RRR/SSS, SSR/RRS) y otras impurezas relacionadas con el procedimiento del API, proporcionando pureza aquiral. Cada uno de estos pares diastereómeros se transfiere a continuación secuencialmente desde la columna RPLC primaria (posdetección) a cuatro columnas de atrapamiento diferentes en la válvula 2 (V2; FIG. 9). Las fracciones diastereómeras atrapadas se vuelven a descargar secuencialmente a continuación y se analizan en la columna quiral SFC secundaria proporcionando pureza quiral. Al presentar una mezcla de muestra más simple en la columna quiral secundaria, los estereoisómeros potenciales se resuelven más eficazmente. Como se muestra en la FIG. 15, ocho estereoisómeros, correspondientes a los cuatro pares diastereómeros, se resolvieron con éxito en la dimensión de SFC secundaria usando detección de EM. Usando la válvula de disco de detención, la aplicación de LC-SFC 2D se extiende al análisis de compuestos con múltiples centros quirales que son difíciles de resolver por cromatografía quiral convencional.
Ejemplo 7
El presente estudio se realizó para someter a prueba un sistema LC-SFC 2D en el que se coloca una columna concentradora en la parte superior de la columna SFC.
Las condiciones de LC-SFC 2D fueron las mismas que las descritas en el ejemplo 3. Además, las muestras de TSO se prepararon de la misma forma como se describe en el ejemplo 3. En resumen, se prepararon soluciones estándar de TSO (0,25, 0,1,0,05, 0,025, 0,01,0,005 mg/ml) en 50:50 ACN/agua. El volumen de inyección de primera dimensión fue de 5 pl. Además, para los análisis completos con una columna concentradora, se colocó una columna concentradora en la parte superior de la columna SFC. La columna concentradora usada fue Pursuit XRs C18 (20 x 2,0 mm, 5 um) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA, EE. UU.).
La separación por LC-SFC 2D de una serie de concentraciones de un estándar de TSO con y sin columna concentradora se muestra en la FIG. 16. Los enantiómeros de TSO se resuelven al valor de referencia en ambas condiciones. Sin embargo, el uso de una columna concentradora dio como resultado el incremento en la pendiente de la altura del pico frente a la curva del área del pico, mejorando la proporción señal/ruido (S/N) en la segunda dimensión (pico 1). Se observaron resultados similares para el pico 2 (datos no mostrados).
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de claridad de comprensión, es evidente para los expertos en la técnica que se podrán practicar determinados cambios y modificaciones menores. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención.
Claims (28)
1. Un sistema de cromatografía (10) para separar una muestra que comprende:
una primera unidad de separación (20) que comprende:
a) un primer conjunto de bomba (100) para impulsar una primera fase móvil a través de la primera unidad de separación,
b) un inyector de muestra (130) para introducir una muestra en la primera unidad de separación; y
c) una columna de cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) (150);
una segunda unidad de separación (40A, 40B) que comprende:
a) un segundo conjunto de bomba (200) para impulsar una segunda fase móvil a través de la segunda unidad de separación,
b) una columna de cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) (240), y
c) una columna concentradora (260) localizada corriente arriba de la columna SFC (240);
y
una primera unidad de enrutamiento fluídico (30) que comprende una pluralidad de circuitos de muestra (315, 320, 415, 420, 515, 520, 615, 630A-C), estando conectada dicha primera unidad de enrutamiento fluídico (30) a la primera unidad de separación (20) y la segunda unidad de separación (40A, 40B),
en el que al menos uno de la pluralidad de circuitos de muestra comprende una columna de atrapamiento (330, 370, 430, 530, 560, 635A-E), comprendiendo dicha columna de atrapamiento una fase estacionaria;
y
en el que el sistema de cromatografía está configurado para separar en primer lugar la muestra en la primera unidad de separación y posteriormente introducir al menos una parte de la muestra eluida de la columna RPLC de la primera unidad de separación en la segunda unidad de separación.
2. El sistema de cromatografía de la reivindicación 1, en el que la columna concentradora comprende un material en fase inversa.
3. El sistema de cromatografía de la reivindicación 1 o 2, en el que la segunda unidad de separación comprende: a) una agrupación de columnas SFC (815A, 815B), en la que las columnas SFC en la agrupación están dispuestas en una configuración paralela; y
b) una segunda unidad de enrutamiento fluídico (800) para dirigir el flujo de la segunda fase móvil a una columna SFC identificada previamente en la agrupación.
4. El sistema de cromatografía de la reivindicación 3, en el que la segunda unidad de separación comprende además una columna concentradora (820A, 820B) localizada corriente arriba de cada columna SFC en la agrupación de columnas SFC.
5. Un procedimiento para separar una muestra usando el sistema de cromatografía de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:
(i) capturar al menos una parte de una muestra en dicha columna de atrapamiento, habiéndose obtenido dicha parte separando la muestra por cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC), comprendiendo dicha columna de atrapamiento una fase estacionaria;
someter la parte de la muestra capturada en la columna de atrapamiento a otra separación por cromatografía de fluidos supercríticos (SFC); y volver a capturar al menos una parte de la muestra separada por elución de la columna de atrapamiento en dicha columna concentradora antes de otra separación por SFC.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende además separar la muestra por cromatografía de líquidos en fase inversa que comprende:
(i) introducir la muestra en una primera fase móvil;
(ii) impulsar la primera fase móvil que contiene la muestra a través de una columna RPLC;
y
(iii) separar la muestra en la columna RPLC.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, que comprende además detectar la presencia de un componente de la muestra en la primera fase móvil después de pasar a través de la columna RPLC.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende además separar por elución la parte de la muestra capturada en la columna de atrapamiento de la columna de atrapamiento.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, que comprende además detectar un componente de la muestra después de otra separación por SFC.
10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende además situar la columna de atrapamiento en una vía de flujo de la primera fase móvil corriente abajo de la columna RPLC para capturar al menos una parte de la muestra separada por la columna RPLC.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende además conmutar la columna de atrapamiento que lleva la parte capturada a una vía de flujo de una segunda fase móvil para separar por elución la parte capturada de la columna de atrapamiento.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la etapa de situar la columna de atrapamiento en la vía de flujo de la primera fase móvil o la etapa de conmutar la columna de atrapamiento a la vía de flujo de la segunda fase móvil se realiza en una unidad de enrutamiento fluídico que interconecta una vía fluídica de la RPLC y una vía fluídica de la SFC.
13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que la primera fase móvil fluye a través de la columna de atrapamiento en un primer sentido, y la parte de la muestra capturada en la columna de atrapamiento se separa por elución de la columna de atrapamiento haciendo fluir la segunda fase móvil a través de la columna de atrapamiento en sentido opuesto al primer sentido.
14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en el que la primera fase móvil fluye a través de la columna de atrapamiento en un primer sentido, y la parte de la muestra capturada en la columna de atrapamiento se separa por elución de la columna de atrapamiento haciendo fluir la segunda fase móvil a través de la columna de atrapamiento en el mismo sentido que el primer sentido.
15. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende las etapas de:
(i) introducir una muestra en una primera fase móvil;
(ii) impulsar la primera fase móvil que contiene la muestra a través de una columna RPLC;
(iii) separar la muestra en la columna RPLC;
(iv) detectar la presencia de un componente de la muestra en la primera fase móvil después de pasar a través de la columna RPLC;
(v) capturar en una primera columna de atrapamiento al menos una primera parte de la muestra separada en la columna RPLC, comprendiendo dicha primera columna de atrapamiento una fase estacionaria;
(vi) separar por elución la primera parte de la muestra capturada en la primera columna de atrapamiento de la primera columna de atrapamiento;
(vii) someter la primera parte de la muestra capturada en la primera columna de atrapamiento a otra separación por SFC; y
(viii) detectar un componente de la muestra después de otra separación por SFC.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, que comprende además las etapas de:
(ix) capturar en una segunda columna de atrapamiento al menos una segunda parte de la muestra separada en la columna RPLC, comprendiendo dicha segunda columna de atrapamiento una fase estacionaria;
(x) separar por elución la segunda parte de la muestra capturada en la segunda columna de atrapamiento de la segunda columna de atrapamiento;
(xi) someter la segunda parte de la muestra capturada en la segunda columna de atrapamiento a otra separación por SFC.
17. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en el que la columna RPLC comprende una fase estacionaria en fase inversa.
18. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, en el que la fase estacionaria en la columna de atrapamiento comprende un material en fase inversa.
19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 18, en el que se realiza otra separación por SFC en una columna SFC que comprende una fase estacionaria en fase normal.
20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 19, en el que se realiza otra separación por SFC en un sistema SFC que comprende una agrupación de columnas SFC.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que cada una de las columnas SFC comprende independientemente una fase estacionaria en fase normal.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, que comprende además enrutar la parte de la muestra capturada en la columna de atrapamiento a una columna SFC para otra separación, dicha columna SFC comprende una fase estacionaria adaptada para separar los componentes en la muestra.
23. Un procedimiento para analizar una muestra usando un sistema de cromatografía de la reivindicación 1 que comprende:
separar la muestra compleja en un primer conjunto de fracciones por cromatografía de líquidos en fase inversa (RPLC) en la primera unidad de separación; y
separar además una o más de las fracciones por cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) en la segunda unidad de separación,
en el que la muestra compleja comprende una mezcla de componentes estereoisómeros y en el que los componentes diastereómeros se separan en una o más fracciones por RPLC en la primera unidad de separación, comprendiendo cada una de dichas fracciones un par enantiómero.
24. El procedimiento de la reivindicación 23, en el que la separación por RPLC en la primera unidad de separación se basa en parte en la hidrofobia de la muestra compleja.
25. El procedimiento de la reivindicación 23 o 24, en el que el par enantiómero se separa además en enantiómeros individuales por SFC en la segunda unidad de separación.
26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que la separación por SFC en la segunda unidad de separación se basa en parte en la quiralidad de la muestra compleja.
27. Un procedimiento para el análisis aquiral-quiral de una muestra que comprende una mezcla de componentes estereoisómeros usando un sistema de cromatografía de la reivindicación 1 que comprende:
separar uno o más componentes diastereómeros de interés en la muestra por RPLC en la primera unidad de separación; y
separar el/los par(es) enantiómero(s) de interés por SFC en la segunda unidad de separación en la misma serie analítica.
28. El procedimiento de la reivindicación 27, que comprende además determinar una pureza aquiral en base a un cromatograma de la separación por RPLC y determinar una pureza quiral en base a un cromatograma de la separación por SFC.
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