CN110146631B - 一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，属于药物化学成分检测技术领域。一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，是采用配备蒸发光检测器的高校液相色谱法，检测mPEG‑2000在3000‑3400的小分子mPEG‑b‑PDLLA中的残留量。本发明克服共聚物的聚乙二醇单甲醚mPEG与产物聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物mPEG‑b‑PDLLA在高效液相色谱中难以达到分离，同时又没有紫外吸收的技术难题，具有高分辨率，高灵敏度、重现性和选择性好的优点。
Description
技术领域
本发明属于药物化学成分检测技术领域，涉及聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，具体涉及一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法。
背景技术
近年来，随着生物药剂学、物理药剂学、工业药剂学等学科的飞速发展，微粒制剂，也称微粒给药系统备受关注。微粒给药系统系指药物与适宜载体（一般为生物可降解材料），经过一定的分散、包埋技术制得具有一定粒径 (微米或纳米）的微粒组成的固态、液态或气态药物制剂，具有掩盖药物的不良气味与口味、液态药物固态化、减少复方药物的配伍变化，提高不溶性药物的溶解度，或提高药物的生物利用度，或改善药物的稳定性，或降低药物不良反应，或延缓药物释放、提高药物靶向性等作用的一大类型药物制剂。其中最引人注目的是采用可生物降解的两亲性嵌段共聚物为药用载体，形成高分子胶束的微粒给药系统。
两亲性嵌段共聚物是指分子结构中同时具有疏水链段和亲水链段，各链段为不同单元组成的均聚物链段，而后通过共价键相互结合成主链的共聚物，在水中自组装成形成“壳核”结构的纳米胶束，其中亲水嵌段为胶束壳，疏水嵌段为胶束核。两亲性嵌段共聚物具有以下优点：（1）疏水内核可载难溶性药物，大大提高药物的溶解能力，以紫杉醇为例，其固有溶解度为1-3µg.mL-1，而聚合物胶束可以增加到10mg.mL-1；（2）亲水性外壳保护胶束内部的药物分子不被外界吸附和降解，同时能帮助药物逃逸网状内皮系统的摄取，延长药物循环时间；（3）控制药物的释放，减少不良反应，优化药物在体内的分布以达到更好的治疗效果。
两亲性嵌段共聚物的种类很多，但限于生物相容性等的要求，能用于制药的数量有限。目前广泛使用的亲水段为聚乙二醇（PEG），聚乙二醇单甲醚（mPEG）等，疏水性链段为聚乳酸（PLA），其中聚D,L-乳酸（PDLLA）降解吸收较聚L-乳酸（PLLA）快，PDLLA在体内完全吸收需6-18个月，PLLA需8个月-4年，同时PLA类降解产物为二氧化碳和水，对身体无害。
mPEG-2000与PDLLA形成的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸（mPEG-b-PDLLA）小分子量（3000-3400）嵌段共聚物作为药物载体，在微粒给药系统中有其独特性，一方面亲水性链段（PDLLA）比例相对较高，可以提高载体与药物的相容性和分散性，另一方面载水不溶性药物更容易形成小粒径胶束。现有研究表明，在比较30nm、50nm、70nm、100nm纳米粒在胰腺癌中的治疗效果中，粒径为30nm的纳米粒表现出较高的渗透能力，显示了较好的治疗效果。
但作为起始反应物的聚乙二醇单甲醚（mPEG-2000）与产物聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物（mPEG-b-PDLLA）都为非离子型共聚物，两者又都具有相似的嵌段结构，而且mPEG没有紫外吸收，使得采用高效液相色谱法检测mPEG在mPEG-b-PDLLA中的残留量时，两者很难有效分离分离。而mPEG-2000残留会影响mPEG-b-PDLLA对疏水性药物的包裹，从而影响形成药物制剂的安全性和有效性。根据《化学药物杂质研究的技术指导原则》，未反应物为工艺杂质，需在最总产品中检测其残留量，从而达到作为药物载体，药用辅料的要求。因此，设计一种能够准确、快速、定量检测mPEG-2000在小分子（3000-3400）mPEG-b-PDLLA中残留量的方法，是十分必要的。
为了检测mPEG-2000在小分子（3000-3400）mPEG-b-PDLLA中残留量，本发明研发了一种采用高效液相色谱法，使用蒸发光检测器检验聚乙二醇单甲醚-聚乳酸嵌段共聚物药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检查方法。
发明内容
本发明是目的是提供一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，是采用配备蒸发光检测器的高校液相色谱法，检测mPEG-2000在3000-3400的小分子mPEG-b-PDLLA中的残留量。
进一步地，上述药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，步骤为：
1）设定色谱条件：
蒸发光散色检测器，增益：100-200，漂移管温度：90-100℃，物化气压力：35-40.0psi；
高纯硅胶基质为填充剂的液相色谱柱；
流速：0.8-1.0ml/min；
柱温：25-35℃；
进样量：20µL；
流动相A：体积比95:5的0.3mmol/L乙酸铵溶液：乙腈，含0.2%乙酸；
流动相B：体积比5:95的0.3mmol/L 乙酸铵溶液：乙腈，含0.2%乙酸；
2）绘制标准曲线：
将mPEG-2000对照品溶解于流动相A，制成浓度在25µg-100µg/mL之间不同梯度浓度的mPEG-2000标准溶液，0.45微米过滤后进行检测，测定时流动相A和流动相B采用梯度洗脱，步骤为：洗脱开始0-10分钟，流动相A85%，流动相B15%；洗脱开始11-30分钟，流动相A65%，流动相B35%；洗脱开始31-40分钟，流动相A50%，流动相B50%；洗脱开始41-45分钟，流动相A85%，流动相B15%；
以色谱峰面积的对数值为纵坐标，以mPEG-2000标准溶液浓度对数值为横坐标，将高效液相色谱法检测结果绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程式：
Y=KX+b，
式中： Y表示色谱峰面积对数值，X表示mPEG-2000浓度对数值，K和b为常数；
3）准备试样：将mPEG-b-PDLLA，用流动相A配制成浓度约9.9-10.5mg/mL的试样溶液；
4）检测：将试样溶液进样，然后再取mPEG-2000标准溶液进样，将试样色谱图和标准品色谱图进行比较，通过两者的相对保留时间定性样品中mPEG-2000，将试样中mPEG-2000色谱峰面积对数值带入上述标准曲线中，计算样品中mPEG-2000的浓度，而后通过外标法计算即得。
更进一步地，所述的高纯硅胶基质为填充剂的液相色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。
所述的mPEG-2000对照品溶解于流动相A，分别制成浓度为100μg /ml、50μg /ml、25μg /ml的对照品标准溶液。
高效液相色谱法（HPLC）是色谱法的重要分支，是以不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等为流动相，采用高压系统，将流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器（常用检测器为紫外检测器）进行检测，从而实现对样品的分析的一种方法。但是紫外检测器需检测物质有紫外吸收，而蒸发光检测器是一种通用性检测器，适用于所有沸点比流动相高的物质，加之可以进行梯度洗脱，尤其是对无紫外或紫外末端吸收的大分子物质有广泛应用。本发明聚乙二醇单甲醚mPEG-2000与产物聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物mPEG-b-PDLLA都为非离子型共聚物，两者又都具有相似的嵌段结构，而且mPEG没有紫外吸收，使得采用高效液相色谱法检测mPEG在mPEG-b-PDLLA中的残留量时，两者很难有效分离，因此本发明利用采用配备蒸发光检测器的高校液相色谱法，检测聚乙二醇单甲醚mPEG-2000在小分子3000-3400聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物mPEG-b-PDLLA中残留量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
（1）通过优化色谱洗脱条件，克服共聚物的聚乙二醇单甲醚mPEG与产物聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物mPEG-b-PDLLA在高效液相色谱中难以达到分离，同时又没有紫外吸收的技术难题，借助蒸发光检测器对游离的聚乙二醇单甲醚-2000进行专属性检查，最大程度的避免了其他杂质的干扰；
（2）可以从光谱学角度证明样品中聚乙二醇单甲醚-2000残留去除的是否彻底，为聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物作为新型药用辅料，在制备药物胶束形成高分子微粒给药系统时，辅料中合成原料残留量的质量控制起到极好的作用。
（3）具有高分辨率，高灵敏度、重现性和选择性好的优点，且样品预处理简单，可准确、快速的对聚乙二醇单甲醚-2000在聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物的残留量进行定性、定量分析。
附图说明
图1为空白溶剂色谱图；
图2为对照品色谱图；
图3为聚乙二醇单甲醚-2000（mPEG-2000）标准曲线；
图4为聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物(mPEG-b-PDLLA)样品色谱图。
具体实施方式：
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，步骤为：
一、色谱条件：
1、色谱柱：高纯硅胶基质为填充剂的液相色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；
2、检测器：waters2424蒸发光散色检测器，仪器参数：增益：100，漂移管温度：100℃，物化气（空气）压力：40.0psi；
3、流动相：
流动相A：0.3mmol/L乙酸铵溶液-乙腈（体积比95:5，含0.2%乙酸）
流动相B：0.3mmol/L 乙酸铵溶液-乙腈（体积比5:95，含0.2%乙酸）；
按照下表进行梯度洗脱：
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0 | 85 | 15 |
| 10 | 65 | 35 |
| 30 | 50 | 50 |
| 40 | 60 | 40 |
| 45 | 85 | 15 |
4、流速：0.8ml/min；
5、柱温：35℃；
6、进样量：20µL。
二、 绘制标准曲线：
精密称取聚乙二醇单甲醚-2000对照品溶解于流动相A，并利用流动相A配制成浓度为C1=100μg /ml；C2=50μg /ml；C3=25μg /ml的对照品溶液，将流动相A，三种不同浓度的对照品溶液过0.45μm滤膜后，进样；流动相A做为空白溶剂，空白溶剂色谱图见图1；聚乙二醇单甲醚-2000（mPEG-2000）对照品的色谱峰图见2；测定结果见表1。
表1不同浓度对照品测定结果
| 浓度（μg /ml） | 浓度的对数 | 峰面积 | 峰面积的对数 | |
| 对照1 | 100.2 | 2.0009 | 11671564 | 7.0671 |
| 对照2 | 50.1 | 1.6998 | 4974625 | 6.6968 |
| 对照3 | 25.05 | 1.3988 | 1885070 | 6.2753 |
以色谱峰面积的对数值为纵坐标，以mPEG-2000标准溶液浓度对数值为横坐标，将高效液相色谱法检测结果绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程为 Y=1.3151X+4.4444，回归系数R2= 0.9986 ，聚乙二醇单甲醚-2000（mPEG-2000）标准曲线见图3；
三、样品检测：
准确称量聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物（mPEG-b-PDLLA）0.5g，用流动相A稀释溶解于50mL容量瓶中，定容，摇匀；过0.45μm滤膜后，按照上述仪器条件，进样检测；以所得色谱图的峰面积对数值代入上述线性方程，通过外标法计算，得mPEG残留量为0.08%，聚乙二醇单甲醚聚乳酸嵌段共聚物(mPEG-b-PDLLA)样品色谱图见图4。
四、结果分析
1、曲线线性：按照上述方法以测的色谱峰面积的对数值为纵坐标，以mPEG-2000标准溶液浓度对数值为横坐标，将高效液相色谱法检测结果绘制成标准曲线，然后进行拟合，标准曲线方程为 Y= 1.3151X+4.4444，回归系数R2= 0.9986 ，说明聚乙二醇单甲醚-2000标准溶液在25μg /ml-100μg /ml的浓度范围内线性良好。
2、精密度：取浓度为50µg/mL的聚乙二醇单甲醚-2000标准溶液，每次进样20µL，连续进样6次，按照上述色谱条件进行测定，记录峰面积，计算精密度。精密度实验的6次进样的峰面积分别为4984625，4976305，4965280，4975876，4964958，4975628，根据峰面积计算出其相对偏差值为0.15%，表明该方法精密度良好。
3、重现性：取按照上述方法处理后的样品溶液，浓度约为20mg/mL，每次进样20µL，连续进样6次，按照上述色谱条件进行测定，记录峰面积，比较重现性，重现性实验的6次进样的峰面积分别为543699，534580，523416，534610，534582，528706，根据峰面积计算其相对偏差值为1.3%，表明该方法具有良好的重现性。
4、稳定性：取浓度为50µg/mL的聚乙二醇单甲醚-2000标准溶液，在室温下放置，分别在0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，每次进样20µL，按照上述色谱条件进行检测，比较测定结果的稳定性。稳定性试验的6次进样的峰面积分别为4978623，4988315，4975480，4968654，4987521，4979156，根据峰面积计算出其相对标准偏差为0.15%，表明聚乙二醇单甲醚溶液在室温下放置24h比较稳定。
Claims (3)
1.一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，其特征在于，是采用配备蒸发光检测器的高效液相色谱法，检测mPEG-2000在3000-3400的小分子mPEG-b-PDLLA中的残留量，步骤为：
1）设定色谱条件：
蒸发光散色检测器，增益：100-200，漂移管温度：90-100℃，雾化气压力：35-40.0psi；
高纯硅胶基质为填充剂的液相色谱柱；
流速：0.8-1.0ml/min；
柱温：25-35℃；
进样量：20µL；
流动相A：体积比95:5的0.3mmol/L乙酸铵溶液：乙腈，含0.2%乙酸；
流动相B：体积比5:95的0.3mmol/L 乙酸铵溶液：乙腈，含0.2%乙酸；
2）绘制标准曲线：
将mPEG-2000对照品溶解于流动相A，制成浓度在25µg-100µg/mL之间不同梯度浓度的mPEG-2000标准溶液，0.45微米过滤后进行检测，测定时流动相A和流动相B采用梯度洗脱，步骤为：洗脱开始0-10分钟，流动相A85%，流动相B15%；洗脱开始11-30分钟，流动相A65%，流动相B35%；洗脱开始31-40分钟，流动相A50%，流动相B50%；洗脱开始41-45分钟，流动相A85%，流动相B15%；
以色谱峰面积的对数值为纵坐标，以mPEG-2000标准溶液浓度对数值为横坐标，将高效液相色谱法检测结果绘制成标准曲线，然后进行拟合，得到标准曲线方程式：
Y=KX+b，
式中： Y表示色谱峰面积对数值，X表示mPEG-2000浓度对数值，K和b为常数；
3）准备试样：将mPEG-b-PDLLA，用流动相A配制成浓度9.9-10.5mg/mL的试样溶液；
4）检测：将试样溶液进样，然后再取mPEG-2000标准溶液进样，将试样色谱图和标准品色谱图进行比较，通过两者的相对保留时间定性样品中mPEG-2000，将试样中mPEG-2000色谱峰面积对数值带入上述标准曲线中，计算样品中mPEG-2000的浓度，而后通过外标法计算即得。
2.根据权利要求1所述的一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，其特征在于，所述的高纯硅胶基质为填充剂的液相色谱柱规格为4.6mm×250mm，5μm。
3.根据权利要求1或2所述的一种药用材料中聚乙二醇单甲醚残留量的检测方法，其特征在于，所述的mPEG-2000对照品溶解于流动相A，分别制成浓度为100μg /ml、50μg /ml、25μg /ml的对照品标准溶液。
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