CN117214342B - 一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法。该注射液胶束溶液含有作为增溶剂的聚乙二醇‑12‑羟基硬脂酸酯，其包括以下步骤：(1)制备进样液，其中进样液包括游离供试品溶液；(2)使进样液进入高效液相色谱‑蒸发光检测器联用系统并进行进样检测；(3)根据检测结果进行计算，得到形成胶束的各成分浓度。本发明方法具有简便、高效和准确度高等优点，可反映溶液中聚乙二醇‑12‑羟基硬脂酸酯形成胶束的主要成分及对应的形成胶束部分的百分含量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体地涉及一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法。
背景技术
HS15(简称HS15)在美国药典中的收载名称为“Polyoxyl15Hydroxystearate”(聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯/15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯)，其具有低溶血活性，良好的生理耐受性等多个优点，是一种有效的新型增溶剂，其已分别被德国药典(DAB)、美国药典(USP)和欧洲药典(Ph.Eur.)收录。
药学研发中，HS15常被作为增溶剂，增加难溶性药物的溶解，开发为注射用溶液。临床使用时，用葡萄糖或氯化钠注射液将其按照说明书中规定的比例稀释后，进行静脉滴注。稀释后溶液中，难溶性药物被包裹在HS15形成的胶束体系里，该胶束体系对药物质量及临床应用有着至关重要的影响。
HS15形成的胶束体系是此类型注射液药品质量研究中重要项目之一，与药品的质量、安全性及疗效密切相关。HS15的主要组成为游离聚乙二醇(PEG)以及聚乙二醇与12-羟硬脂酸形成的单酯或双酯。在参与胶束体系的成分贡献率以及参与形成胶束的成分百分比含量高低会影响药物的疗效。因此，目前亟需建立一种适当的检测分析方法来反映药物中的胶束浓度水平，确保药品质量。
发明内容
针对现有技术中存在的至少部分问题，发明人提供一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法。本发明方法具有简便、高效和准确度高等优点，可反映溶液中HS-15形成胶束的主要成分及对应的形成胶束部分的百分含量。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的一个方面，提供了一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，所述注射液胶束溶液含有作为增溶剂的聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯，所述方法包括以下步骤：
(1)制备进样液，其中所述进样液包括总量供试品溶液和游离供试品溶液；
(2)使所述进样液进入高效液相色谱-蒸发光检测器联用系统，根据以下色谱条件进行进样检测：C18色谱柱、流动相为水-乙腈、洗脱程序为梯度洗脱；
(3)根据检测结果进行计算，得到形成胶束的各成分浓度。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，色谱条件包括：
色谱柱：Agilent Poroshell 120SB-C18，3.0mm×150mm，2.7μm；
检测器：Agilent 1260蒸发光检测器；
流速：0.3-0.7ml/min；
稀释级别：40-60℃；
蒸发光雾化温度：40-80℃；
蒸发光蒸发温度：40-80℃；
气体流速：0.1-2.5slm；
流动相A：水；
流动相B：乙腈。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，梯度洗脱程序如下：总洗脱时间等分为N步依次进行梯度洗脱，前N-1步梯度中流动相A的比例由60％依次降至10％，流动相B的比例由40％逐渐升至90％，第N步时流动相A比例为60％，流动相B为40％，且3≤N≤9。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，进样液进一步包括空白溶液、标准曲线溶液、不同稀释级别的总量供试品溶液、游离PEG供试品溶液和游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中形成胶束的PEG的百分含量＝(总量供试品溶液中PEG的测定浓度*稀释倍数-游离PEG供试品溶液中的测定浓度*稀释倍数)/(总量供试品溶液中PEG的测定浓度*稀释倍数)。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中形成胶束的硬脂酸聚乙二醇酯的百分含量＝(总量供试品溶液中硬脂酸聚乙二醇酯测定浓度*稀释倍数-游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液中的测定浓度*稀释倍数)/(总量供试品溶液中硬脂酸聚乙二醇酯测定浓度*稀释倍数)。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，通过超滤离心制备得到所述游离供试品溶液。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，分别取含有难溶性药物注射液的不同稀释级别的供试品溶液置于合适截留分子量的超滤离心管内管中，每离心固定时间间隔后移出超滤离心管内管与外管中所有溶液，重新加入各稀释级别的供试品溶液继续离心，重复操作，取滤液，作为游离供试品溶液。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，空白溶液为葡萄糖注射液和乙腈的混合溶液。
在某些实施方案中，根据本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，所述方法进一步包括确定所述方法的精密度、回收率或检测限的步骤。
本发明方法具有简便、高效和准确度高等优点，可反映溶液中HS-15形成胶束的主要成分及对应的形成胶束部分的百分含量，对药物质量及临床应用具有重要意义。
附图说明
图1为优化前洗脱体系及洗脱程序得到各组分的色谱图。
图2示出了蒸发光雾化温度为40℃，蒸发光蒸发温度为40℃色谱条件典型图谱。
图3示出了蒸发光雾化温度为60℃，蒸发光蒸发温度为60℃色谱条件典型图谱。
图4为专属性试验的各溶液的对比色谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明所使用的设备和试剂均可以从市场产品购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。本发明所提供的分析方法中用到的试剂均符合中国药典2020年版的分析试剂要求。
测定方法
本发明提供一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其中，所述注射液胶束溶液含有作为增溶剂的聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯，其包括以下步骤：(1)制备进样液，其中所述进样液包括总量供试品溶液和游离供试品溶液；(2)使所述进样液进入高效液相色谱-蒸发光检测器联用系统，根据以下色谱条件进行进样检测：C18色谱柱、流动相为水-乙腈、洗脱程序为梯度洗脱；(3)根据检测结果进行计算，得到形成胶束的各成分浓度。下面进行详细说明。
步骤(1)
本发明的步骤(1)为制备进样液的步骤，进样液是指进入高效液相色谱-蒸发光检测器联用系统的待测样品，其至少包括总量供试品溶液和游离供试品溶液。在一个优选的实施方案中，进样液进一步包括空白溶液、标准曲线溶液、不同稀释级别的总量供试品溶液、游离PEG供试品溶液和游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液。
本发明中，所述注射液胶束溶液含有难溶性药物，难溶性药物的具体类型不特别限定，在一个具体实施方案中，该难溶性药物为多西他赛。用于形成胶束体系的聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯优选为HS15。
本发明中，通过超滤离心制备得到所述游离供试品溶液。利用超滤离心法，选取适用的截留分子量的超滤离心管，对胶束溶液进行离心，形成胶束的部分被截留在内管中，未形成胶束的游离部分离心后在外管中。通过测定外管中游离的各成分的量，从而计算参与形成胶束的物质的百分含量。
在一个优选的实施方案中，分别取含有难溶性药物注射液的不同稀释级别的供试品溶液置于合适截留分子量的超滤离心管内管中，每离心固定时间间隔后移出超滤离心管内管与外管中所有溶液，重新加入各稀释级别的供试品溶液继续离心，重复操作，取滤液，作为游离供试品溶液。超滤离心管的截留分子量不宜过大或过小，否则会影响检测的准确性。优选地，超滤离心管的截留分子量为25-35kD，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35kD等。离心的参数设置为2000-8000g，优选为3000-8000g，例如3000、4000、5000、6000、7000、8000g等。离心的时间间隔不特别限定，可以根据需要进行调整，但优选为5-20分钟，还优选为5-15分钟，例如5、10、15分钟等。取滤液前进行的重复操作的次数不特别限定，优选为4-8次。
本发明中，空白溶液为葡萄糖注射液和乙腈的混合溶液，特别是浓度为5％葡萄糖注射液和50％乙腈的混合溶液。该混合溶液中，葡萄糖注射液和乙腈的体积比为1:20-100，还优选为1:40-80，进一步优选为1:40-60，例如1:40、1:45、1:50、1:55、1:60等。
本发明中，标准曲线溶液是指HS15的乙腈溶液。在一个优选的实施方案中，HS15浓度为60-1200μg/ml的线性溶液。
本发明中，不同稀释级别的供试品溶液是指供试品溶液的稀释比例为1:10-80，优选为1:20-50，例如1:20、1:30、1:40、1:50等，其通过难溶药物注射液与葡萄糖注射液混合得到，葡萄糖注射液的浓度不特别限定，一般为5％。以稀释比例为1:50作为示例，取难溶药物注射液10g，加入5％葡萄糖注射液500ml，振摇即得。
本发明中，总量供试品溶液通过以下步骤进行制备：取相应的不同稀释级别的供试品溶液置于量瓶中，加入50％的乙腈溶液混合即得。
本发明中，游离PEG供试品溶液通过以下步骤进行制备：取相应的游离供试品溶液置于量瓶中，加入50％的乙腈溶液混合即得。
步骤(2)
本发明的步骤(2)为检测步骤，具体地，使进样液进入高效液相色谱-蒸发光检测器联用系统，高效液相色谱-蒸发光检测器联用系统可以采用本领域已知的检测系统，或组合本领域已知的高效液相色谱仪和蒸发光检测器。
在一个优选的实施方案中，色谱条件包括：
色谱柱：Agilent Poroshell 120SB-C18，3.0mm×150mm，2.7μm；
检测器：Agilent 1260蒸发光检测器；
流速：0.3-0.7ml/min，优选为0.4-0.6ml/min，还优选为0.45-0.55ml/min，例如0.5ml/min；
柱温：40-60℃，优选为45-55℃，还优选为45-50℃，例如50℃。
蒸发光雾化温度为40-80℃，本发明人通过研究发现，蒸发光雾化温度不宜过高或过低，过高或过低蒸发光雾化温度均会影响检测的准确性，特别是各成分检测的精密度。优选地，蒸发光雾化温度为50-70℃，还优选为55-65℃，例如55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65℃等。
蒸发光蒸发温度为40-80℃，本发明人通过研究还发现，蒸发光蒸发温度也不宜过高或过低，过高或过低蒸发光蒸发温度均会影响检测的准确性，特别是各成分检测的精密度。优选地，蒸发光蒸发温度为50-70℃，还优选为55-65℃，例如55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65℃等。
气体流速为0.1-2.5slm，优选为0.6-2.0slm，还优选为1.0-1.7slm，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7slm等。
流动相A：水，流动相B：乙腈。
本发明中，梯度洗脱程序如下：总洗脱时间等分为N步依次进行梯度洗脱，前N-1步梯度中流动相A的比例由60％依次降至10％，流动相B的比例由40％渐次升至90％，第N步时流动相A比例为60％，流动相B为40％，且3≤N≤9。需要说明的是，上述洗脱体系和洗脱程序是经过优化后适于注射液胶束溶液中胶束浓度测定方法的合适的洗脱体系和洗脱程序。在上述洗脱体系和洗脱程序的范围内，含有难溶性药物的注射液胶束溶液中的组分分离效果优异，无拖尾或峰形异常的问题，并且经验证其精密度和准确度高。
在一个优选的实施方案中，在开始洗脱后的7分钟内，洗脱液由60体积份流动相A和40体积份流动相B的混合液组成；在开始洗脱后7分钟至15分钟内，洗脱液由60体积份流动相A和40体积份流动相B的混合液逐渐变为由10体积份流动相A和90体积份流动相B组成的混合液；在开始洗脱后15分钟至30分钟内，洗脱液由10体积份流动相A和90体积份流动相B组成；在开始洗脱后30至31钟内，洗脱液由10体积份流动相A和90体积份流动相B的混合液逐渐变为由60体积份流动相A和40体积份流动相B组成的混合液；由60体积份流动相A和40体积份流动相B组成的洗脱液进一步洗脱7分钟。
步骤(3)
本发明的步骤(3)为检测结果进行计算，得到形成胶束的各成分浓度的步骤。在一个具体的实施方案中，聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中形成胶束的PEG的百分含量＝(总量供试品溶液中PEG的测定浓度*稀释倍数-游离PEG供试品溶液中的测定浓度*稀释倍数)/(总量供试品溶液中PEG的测定浓度*稀释倍数)。聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中形成胶束的硬脂酸聚乙二醇酯的百分含量＝(总量供试品溶液中硬脂酸聚乙二醇酯测定浓度*稀释倍数-游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液中的测定浓度*稀释倍数)/(总量供试品溶液中硬脂酸聚乙二醇酯测定浓度*稀释倍数)。
本发明的方法进一步还包括根据例如液相色谱的峰面积确定所述方法的精密度、回收率或检测限的步骤。本发明通过实验分别验证了本发明的注射液胶束溶液中胶束浓度测定方法的专属性，本发明的方法在测定目标物质时，不受其他物质干扰。
本发明的方法具有显著提高的精密度，特别是合适的蒸发光雾化温度联合蒸发光蒸发温度能够协同提高检测的精密度。
实施例
一、试剂和仪器
使用的设备包括：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦有限公司)-蒸发光检测器，BSA124S电子天平(德国赛多利斯公司)，高速离心机(广州吉迪股份有限公司)。5％葡萄糖注射液来自广东大冢制药有限公司；15-羟基硬脂酸聚乙醇酯来自巴斯夫(中国)有限公司；难溶药物注射液；乙腈为色谱级试剂；水为纯化水。
二、溶液的配制
1、空白溶液：5％葡萄糖注射液-50％乙腈(1:49)。
2、标准曲线溶液的配制
取HS15适量，精密称定，加50％乙腈溶液逐级稀释至HS15浓度在60-1200μg/ml之间的线性溶液。以溶液中色谱峰的峰面积对数值LgA作为横坐标(X轴)，溶液的浓度对数值LgC作为横坐标(Y轴)，进行线性回归。
3、供试品溶液(不同稀释级别)的配制
A.(1:20)稀释级别供试品溶液：取难溶药物注射液1支(约10g)，加入5％葡萄糖注射液200ml(对应1:20稀释级)，振摇1分钟，即得。
B.(1:50)稀释级别供试品溶液：取难溶药物注射液1支(约10g)，加入5％葡萄糖注射液500ml(对应1:50稀释级)，振摇1分钟，即得。
4、总量供试品溶液
取上述各稀释级别的供试品溶液1.0ml，分别置于50ml量瓶(对应1:20稀释级)、25ml量瓶(对应1:50稀释级)，加50％乙腈溶液稀释至刻度，即得。
5、游离PEG供试品溶液
(1)分别取游离供试品溶液1ml置于50ml量瓶(对应1:20稀释级)，加50％乙腈溶液稀释至刻度，即得。
(2)分别取游离供试品溶液1ml置于25ml量瓶(对应1:50稀释级)，加50％乙腈溶液稀释至刻度，即得。
6、游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液的制备
取游离供试品溶液适量，直接进样。
7、游离供试品溶液的制备
分别取含有难溶性药物注射液的不同稀释级别的供试品溶液置于截留分子量25-35kD的超滤离心管内管中，以2000-8000g转速离心，每离心5-20分钟弃掉超滤离心管内管与外管中所有溶液，重新加入各稀释级别的供试品溶液继续离心，重复操作，取滤液，作为游离供试品溶液。
三、分析方法
采用高效液相色谱-蒸发光检测器联用技术，使用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以水-乙腈为流动相，在一定条件下进行梯度洗脱，测定胶束溶液中PEG与硬脂酸聚乙二醇酯。
色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Poroshell 120SB-C18，3.0mm×150mm，2.7μm；检测器：Agilent 1260蒸发光检测器；流速：0.5ml/min；柱温：50℃；蒸发光雾化温度：60℃；蒸发光蒸发温度：60℃；气体流速为1.60slm；流动相A：水，流动相B：乙腈。
1、梯度洗脱程序的优化
为了改善PEG与葡萄糖的分离度，本发明对梯度洗脱进行了优化，优化前体系及洗脱程序如下表所示。结果发现当乙腈的比例为30％时，虽然PEG色谱峰与葡萄糖能良好分离，但PEG峰高明显降低变为鼓包峰(如图1所示)。
表1优化前体系及洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 7.0 | 70 | 30 |
| 15.0 | 10 | 90 |
| 30.0 | 10 | 90 |
| 31.0 | 70 | 30 |
| 38.0 | 70 | 30 |
为了克服峰形异常的问题，优化后的流动相A和流动相B的比例依据表2进行设置。
表2流动相A与B的梯度洗脱程序
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 60 | 40 |
| 7.0 | 60 | 40 |
| 15.0 | 10 | 90 |
| 30.0 | 10 | 90 |
| 31.0 | 60 | 40 |
| 38.0 | 60 | 40 |
2、蒸发光检测器雾化温度和蒸发温度的考察试验
除设定蒸发光雾化温度为40℃，蒸发光蒸发温度为40℃，其他条件同上述色谱条件。
试验步骤：
空白溶液：5％葡萄糖注射液-50％乙腈(1:49)；
HS15供试品溶液：称取HS15约0.4g，置于20ml量瓶，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取0.5ml，加50％乙腈溶液稀释至50ml，摇匀，即得。
分别取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图，考察不同蒸发光雾化温度和蒸发温度下各成分的进样精密度，检测结果如表3所示。
表3不同蒸发光雾化温度和蒸发温度下各成份的进样精密度
蒸发光雾化温度为40℃，蒸发光蒸发温度为40℃色谱条件典型图谱如图2所示，蒸发光雾化温度为60℃，蒸发光蒸发温度为60℃色谱条件典型图谱如图3所示，结果表明，提高雾化温度与蒸发温度均为60℃后，PEG与硬脂酸聚乙二醇酯的响应明显提高，并且连续进样后，RSD％显著变小，响应更稳定。
3、专属性试验
空白溶液：5％葡萄糖注射液-50％乙腈(1:49)；PEG定位溶液：称取聚乙二醇约10mg，置于10ml量瓶，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
多西他赛定位溶液：称取API约10mg，置于10ml量瓶，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，取2.0ml，置于10ml量瓶，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，0.2mg/ml即得；
HS15定位溶液：称取HS15约10mg，置于10ml量瓶，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
供试品溶液：取难溶药物注射液一支，加5％葡萄糖注射液200ml，混匀1分钟，取1.0ml置于50ml量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，混匀，即得。
分别取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪，采用上述色谱条件进样检测，记录色谱图，考察方法专属性。具体结果如图4所示，结果表明本发明的方法在测定目标物质时，不受其他物质干扰。
4、回收率试验
试验步骤：
空白溶液：5％葡萄糖注射液-50％乙腈(1:49)；
标准曲线溶液的配制：取HS15适量，精密称定，加5％葡萄糖注射液，配制成每1ml中含有HS15约20mg的溶液，作为HS15线性贮备液。分别取贮备液适量，加50％乙腈溶液逐级稀释至HS15浓度在60-1200μg/ml之间的线性溶液。以每个浓度级别溶液中色谱峰的峰面积对数值LgA作为横坐标(X轴)，溶液的浓度对数值LgC作为横坐标(Y轴)，进行线性回归。
回收率母液：取HS15约4g，置于200ml量瓶中，加50％乙腈使溶解并定容至刻度，作回收率母液。
PEG回收率溶液：精密量取回收率母液5.0ml，置于250ml量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作PEG回收率溶液(未离心)。取PEG回收率溶液约4ml，置于截留分子量30kD的再生纤维素超滤离心管内管中，以4500g转速离心，每离心10分钟弃掉超滤离心管中所有溶液，重新加入供试品溶液约4ml继续离心，重复操作6次(共离心60分钟)，取60分钟滤液，作为PEG回收率溶液，平行操作六份，测定PEG的回收率。
硬脂酸聚乙二醇酯回收率溶液：取回收率母液6.0ml，置于200ml量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，作硬脂酸聚乙二醇酯回收率(未离心)溶液。取硬脂酸聚乙二醇酯回收率(未离心)溶液约4ml，置于截留分子量30kD再生纤维素的超滤离心管内管中，以4500g转速离心，每离心10分钟弃掉超滤离心管中所有溶液，重新加入供试品溶液约4ml继续离心，重复操作6次(共离心60分钟)，取60分钟滤液，作为硬脂酸聚乙二醇酯回收率溶液，平行操作六份，测定硬脂酸聚乙二醇酯的回收率。
分别精密量取空白溶液，标准曲线溶液，PEG回收率溶液，硬脂酸聚乙二醇酯回收率溶液各10μl，采用本实施例所述色谱条件进样检测，记录色谱图。按标准曲线法计算6份回收率溶液中PEG和硬脂酸聚乙二醇酯的浓度，以离心后溶液中的浓度与未离心溶液中的浓度的比值为回收率，检测结果如表4和表5所示。
表4PEG回收率试验检测结果
表5硬脂酸聚乙二醇酯回收率试验检测结果
5、精密度试验
试验步骤：
空白溶液：5％葡萄糖注射液-50％乙腈(1:49)；
标准曲线溶液的配制：取HS15适量，精密称定，加5％葡萄糖注射液，配制成每1ml中含有HS15约20mg的溶液，作为HS15线性贮备液。分别取贮备液适量，加50％乙腈溶液逐级稀释至HS15浓度在60-1200μg/ml之间的线性溶液。以每个浓度级别溶液中色谱峰的峰面积对数值LgA作为横坐标(X轴)，溶液的浓度对数值LgC作为横坐标(Y轴)，进行线性回归。
供试品溶液：取难溶药物注射液1支，精密称定，加入5％葡萄糖注射液200ml，混匀1分钟，即得。平行配制6份。
总量供试品溶液：取供试品溶液1.0ml，置于50ml量瓶，加50％乙腈溶液稀释至刻度，即得。
游离供试品溶液：分别取上述供试品溶液约4ml，置于截留分子量30kD再生纤维素的超滤离心管内管中，以4500g转速离心，每离心10分钟弃掉超滤离心管中所有溶液，重新加入供试品溶液约4ml继续离心，重复操作6次(共离心60分钟)，取60分钟滤液，作为游离供试品溶液。
游离PEG供试品溶液：取游离供试品溶液1.0ml，置于50ml量瓶，加50％乙腈溶液稀释至刻度，即得。
游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液的制备：取游离供试品溶液适量，即得。
分别精密量取空白溶液、标准曲线溶液、总量供试品溶液、游离PEG供试品溶液、游离硬脂酸聚乙二醇酯溶液各10μl，采用本实施例所述色谱条件进样检测，记录色谱图。按标准曲线法计算6份重复性溶液中胶束中PEG和硬脂酸聚乙二醇酯的含量，计算6份供试品溶液中胶束中PEG含量与均值的差值；硬脂酸聚乙二醇酯含量的相对标准偏差值(RSD)。检测结果如表6和表7所示。
表6PEG精密度试验检测结果
表7硬脂酸聚乙二醇酯精密度试验检测结果
6、定量限试验
试验步骤：
空白溶液：5％葡萄糖注射液-50％乙腈(1:49)；
定量限溶液：取HS15适量，精密称定，加5％葡萄糖注射液，配制成每1ml中含有HS15约20mg的溶液，作为HS15贮备液。取HS15贮备液适量，逐级稀释至信噪比约为10作为定量限。
分别精密量取空白溶液、定量限溶液各10μl，采用本实施例所述色谱条件进样检测，记录色谱图。计算定量限溶液中PEG和硬脂酸聚乙二醇酯的含量，连续进样六针，计算PEG和硬脂酸聚乙二醇酯峰面积的相对标准偏差值(RSD)。检测结果如表8所示。
表8 PEG和硬脂酸聚乙二醇酯定量限试验检测结果
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (8)
1.一种注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，所述注射液胶束溶液含有作为增溶剂的聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯，包括以下步骤：
(1) 制备进样液，其中所述进样液包括总量供试品溶液和游离供试品溶液；
(2) 使所述进样液进入高效液相色谱-蒸发光检测器联用系统，根据以下色谱条件进行进样检测：C18色谱柱、流动相为水-乙腈、洗脱程序为梯度洗脱；
(3) 根据检测结果进行计算，得到形成胶束的各成分浓度，
其中，所述色谱条件包括：
色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18，3.0mm×150mm，2.7μm；
检测器：Agilent 1260蒸发光检测器；
流速：0.5ml/min；
柱温：50℃；
蒸发光雾化温度：60℃；
蒸发光蒸发温度：60℃；
气体流速为1.60slm；
流动相A：水；
流动相B：乙腈，
梯度洗脱程序如下：
。
2.根据权利要求1所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，所述进样液进一步包括空白溶液、标准曲线溶液、不同稀释级别的总量供试品溶液、游离PEG供试品溶液和游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，所述聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中形成胶束的PEG的百分含量=(总量供试品溶液中PEG的测定浓度*稀释倍数-游离PEG供试品溶液中的测定浓度*稀释倍数)/(总量供试品溶液中PEG的测定浓度*稀释倍数)。
4.根据权利要求3所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，所述聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯中形成胶束的硬脂酸聚乙二醇酯的百分含量=(总量供试品溶液中硬脂酸聚乙二醇酯测定浓度*稀释倍数-游离硬脂酸聚乙二醇酯供试品溶液中的测定浓度*稀释倍数)/(总量供试品溶液中硬脂酸聚乙二醇酯测定浓度*稀释倍数)。
5.根据权利要求1所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，通过超滤离心制备得到所述游离供试品溶液。
6.根据权利要求5所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，分别取含有难溶性药物注射液的不同稀释级别的供试品溶液置于合适截留分子量的超滤离心管内管中，每离心固定时间间隔后移出超滤离心管内管与外管中所有溶液，重新加入各稀释级别的供试品溶液继续离心，重复操作，取滤液，作为游离供试品溶液。
7.根据权利要求2所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，所述空白溶液为葡萄糖注射液和乙腈的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的注射液胶束溶液中胶束浓度的测定方法，其特征在于，进一步包括确定所述方法的精密度、回收率或检测限的步骤。
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