CN112946101B - 一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法及其应用,属于医药检测技术领域。本发明采用蛋白沉淀法结合HPLC‑MS/MS测定9种抗癫痫药物在血浆中的含量,并从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对上述9种抗癫痫药物在血浆中的测定方法进行了充分的验证,最终应用于口服给药的动物药动学研究,并通过非房室模型计算药动学参数,有助于给出患者体内治疗癫痫的药物的真实浓度的真实水平,指导医生合理制定给药方案,合理用药减少副作用,对患者实现获得最佳疗效具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于医药检测技术领域,具体涉及一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
癫痫,俗称“羊癫疯”是临床上的一种常见病,其病因复杂多样,是神经元高度同步化放电所致反复痫性发作的慢性疾病,主要为大脑神经元的异常放电导致中枢神经系统的功能失常,常表现为突然发生的肌肉抽搐或意识丧失,且有反复发作的特点。癫痫病可见于各个年龄阶段,儿童发病率较成年人高,进入老年期以后,由于脑血管意外的增加,发病率也逐渐上升。癫痫病严重影响人们的正常生活及工作,故对本病的治疗愈加受到重视。临床针对癫痫初期的患者,多采用单一用药的方式。而对于难治性癫痫,常采用联合用药的方式复合治疗。抗癫痫常用的联合用药包括卡马西平、奥卡西平、托吡酯、左乙拉西坦、丙戊酸、苯巴比妥、苯妥英钠和拉莫三嗪等,10-羟卡马西平作为奥卡西平的活性代谢产物常作为检测项目之一。而其中诸多药物(例如奥卡西平、左乙拉西坦等)存在治疗范围窄、服用过多易产生毒性和不良反应等缺点,因此提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血浆中含量的方法并应用于动物体内药物动力学进而研究抗癫痫药物的剂量-效应关系亟待解决。为了更好地了解抗癫痫药物联合用药后的药物动力学,需要一种灵敏、特异、准确的测定血浆中抗癫痫药物的方法,以观察抗癫痫药物的量效关系。
关于使用高效液相色谱-紫外色谱法、共柱体系二维色谱法和高效液相色谱-质谱联用法对生物液中抗癫痫药物进行定量的论文已经发表。代静等人在2020年采用超高效液相色谱-串联质谱法在9分钟内定量12种抗癫痫药物,药物的线性范围为12.5-2500μg/L,定量限较高无法满足药物动力学研究药物剂量-效应关系的需要,其分析时间太长、测定样品量200μL无法实现高通量,且12种药物不包含奥卡西平重要的活性代谢产物10-羟卡马西平。邹继华等人报道了采用液相色谱法测定人血清中5种抗癫痫药物的方法,抗癫痫药物的定量限较高(10μg/mL),且样品处理方法为耗时的液液萃取法,与高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)相比,该方法的灵敏度较低。卢静宜等人报道开发了共柱体系二维色谱方法测定5种抗癫痫药物在血浆中的含量,该方法分析时间较长且定量限较高,无法满足药物动力学研究的需要。在这些技术中,HPLC-MS/MS的灵敏度最高,这是由于其具有较高的选择性。然而,包括固相萃取和液液萃取在内的样品预处理过程相对复杂,例如,用温和的氮气流分离离心后的有机层并在40℃下蒸发干燥。这种预处理不仅增加了操作的复杂性,降低了处理量,而且还导致了不良的有机污染,这是临床实验室难以接受的。因此,提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血浆中含量的方法并应用于动物体内药物动力学进而研究抗癫痫药物的剂量-效应关系亟待解决。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法及其应用。本发明采用蛋白沉淀法结合HPLC-MS/MS测定9种抗癫痫药物在血浆中的含量,并从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对上述9种抗癫痫药物在血浆中的测定方法进行了充分的验证,最终应用于口服给药的动物药动学研究,并通过非房室模型计算药动学参数,有助于给出患者体内治疗癫痫的药物的真实浓度的真实水平,指导医生合理制定给药方案,合理用药减少副作用,对患者实现获得最佳疗效具有重要意义。
为实现上述技术目的,本发明采用的技术方案如下:
本发明的第一个方面,提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法,所述抗癫痫药物包括卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪,所述方法包括:以标准品制作标准曲线定量,同时采用质控品进行质控,以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测;
具体的,采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控。
其中,上述抗癫痫药物质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25ng/mL。
所述待测血液样品的配制方法为:将试验样品与同位素内标工作液混合,离心取上清制得。
所述试验样品为受试者血液样品,包括全血、血浆或血清,进一步优选为血浆。
所述同位素内标工作液可以为上述9种抗癫痫药物同位素内标工作液中的任意一种或多种的混合;
具体的,所述同位素内标工作液制备方法可以为:将抗癫痫药物的同位素内标原料药使用二甲基亚砜溶解,制成内标储备液,然后采用沉淀蛋白溶剂稀释得同位素内标工作液。
所述沉淀蛋白溶剂为含有甲酸的乙腈与甲醇的混合溶液,所述乙腈和甲醇的用量体积比为2~4:1~3,优选为3:2,所述甲酸含量为0.05~0.3%,优选为0.1%。
所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为:
液相色谱条件包括:
采用梯度洗脱,流动相A相:水(2mM乙酸铵,0.1%乙酸),流动相B相:乙腈(2mM乙酸铵,0.1%乙酸);
色谱柱为C18色谱柱;流动相流速为0.3~0.5ml/min(优选为0.4ml/min);柱温为25~40℃(优选为35℃);进样量1~10μL(优选为5μL);
具体的,所述色谱柱为CAPCELL PAC-MGⅢC18色谱柱,经研究发现,其对上述9种抗癫痫药物均具有较好的保留作用。
梯度洗脱方式具体为:0-1.5min,流动相B 5-5%;1.5-1.9min,流动相B 5-70%;1.9-2.0min,流动相B 70-95%;2.0-3.8min,流动相B 95-95%;3.8-3.9min,流动相B 95-5%;3.9-5.5min,流动相B 5-5%。
质谱条件包括:
离子源:电喷雾(ESI);扫描方式:多反应监测(MRM);离子化方式:正离子;离子源电压:5000V;离子源温度:650℃;气帘气:15psi;雾化气:45psi;辅助气:55psi。
本发明的第二个方面,提供检测多种抗癫痫药物的试剂盒,所述试剂盒包括:卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪中的任意一种或多种标准品;
左乙拉西坦-d3、卡马西平-d10、10-羟卡马西平-d3、拉莫三嗪-c3d3、丙戊酸-d4、苯巴比妥-d5、苯妥英钠-d10、托吡酯-d12中的任意一种或多种内标标准品;
稀释液为乙腈或乙腈/甲醇/甲酸混合溶液;
其中,所述乙腈/甲醇/甲酸混合溶液的用量体积比为2~4:1~3:0.05~0.3,优选为3:2:0.1。
进一步的,所述试剂盒还包括空白血浆。
本发明的第三个方面,提供上述测定抗癫痫药物在血液中含量的方法和/或检测试剂盒在药代动力学研究中的应用。
与现有技术相比,上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果:
上述技术方案提供了一种沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法,从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对9种抗癫痫药物在血浆中的测定进行了充分的验证,最终应用于灌胃给药的大鼠药动学研究,并显示出明显的优越性。
上述技术方案液质联用定量测定方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性检测限和定量限更低等优点,有助于给出患者体内治疗癫痫的药物的真实浓度的真实水平,指导医生合理制定给药方案,合理用药减少副作用,对患者实现获得最佳疗效具有重要意义,因此对血浆中药物成分含量分析具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中9种抗癫痫药物的结构式(A:卡马西平,B:10-羟卡马西平,C:奥卡西平,D:左乙拉西坦,E:托吡酯,F:丙戊酸,G:苯妥英钠,H:苯巴比妥,I:拉莫三嗪);
图2为本发明实施例1中9种抗癫痫药物的质谱色谱图(卡马西平:1.6min,10羟卡马西平:2.2min,奥卡西平:1.5min,左乙拉西坦:2.5min,托吡酯:3.2min,丙戊酸:3.1min,苯妥英钠:3.5min,苯巴比妥:4.2min,拉莫三嗪:4.4min);
图3为本发明实施例2中灌胃9种抗癫痫药物后的平均血浆浓度-时间曲线。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是例示性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述,提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血浆中含量的方法并应用于动物体内药物动力学进而研究抗癫痫药物的剂量-效应关系亟待解决。
有鉴于此,本发明提供一种同时测定多种抗癫痫药物在血浆中含量的方法及其应用,从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对9种抗癫痫药物在血浆中的含量测定进行了充分的验证,最终应用于灌胃给药的大鼠药动学研究,显示出明显的优越性。
本发明的一个具体实施方式中,所述测定方法,其步骤如下:
(1)9种抗癫痫药物的储备液用二甲基亚砜溶解精确称量的标准对照品,9种抗癫痫药物的最终浓度为1000μg/mL。将0.10mL精确体积的9种抗癫痫药物标准溶液移入10mL容量瓶中,并用乙腈定容,得到9种抗癫痫药物10μg/mL的工作液。用乙腈稀释,得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时,将9种抗癫痫药物的同位素内标原料药用一定体积二甲基亚砜溶解,制备1000μg/mL的内标储备液。9种抗癫痫药物的同位素内标的工作液浓度为50ng/mL,稀释溶剂为乙腈:甲醇=3:2,含0.1%甲酸。所有药物的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天,无变化。
在0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、25、30ng/mL的9种抗癫痫药物在血浆中的药物浓度点中制备其标准曲线。根据FDA关于选择质量控制点(QCs)的指南,为了进行准确度和精密度研究,QCs在4个浓度水平下制备为6个重复品,包括定量下限(LLOQ)、低(L:定义为LLOQ的三倍)、中(M:定义为中范围)和高(H:定义为高范围)。而对于其他试验(在样品分析期间),只使用了3种浓度水平(LQC、MQC和HQC)的样品。对于9种抗癫痫药物,分别在0.1、0.25、2.5和25ng/mL下制备LLOQ、LQC、MQC和HQC。
将45μL大鼠空白血浆置于2.0mL离心管中,加入精确体积5μL的9种抗癫痫药物2-600ng/mL工作溶液,以获得9种抗癫痫药物的0.1-30ng/mL血浆浓度。然后加入200μL 9种抗癫痫药物同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈:甲醇=3:2,0.1%甲酸)沉淀蛋白,振荡10min,提取分析物及其内标,在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中,并涡旋混合2分钟,得到对照品溶液;
(2)将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析,采用梯度洗脱,流动相A相:水(2mM乙酸铵,0.1%乙酸),流动相B相:乙腈(2mM乙酸铵,0.1%乙酸)。
本发明的又一具体实施方式中,所述步骤(1)中将40-50μL大鼠空白血浆置于2.0mL离心管中,加入精确体积4-6μL的9种抗癫痫药物2-600ng/mL工作溶液,以获得9种抗癫痫药物的0.1-30ng/mL血浆浓度。然后加入100-300μL 9种抗癫痫药物同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈:甲醇=3:2,0.1%甲酸)沉淀蛋白,振荡10min,提取分析物及其内标,在4℃下以13000-15000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将50-150μL上清液溶解于100-300μL水相中,并涡旋混合2分钟,得到对照品溶液。
本发明为了获得满意的色谱行为和最大限度地提高分析物和内标化合物的电离响应,我们在流动相体系上进行了几次尝试。由于检测模式为正离子模式,故采用乙酸溶液作为流动相,以提高响应速度。考虑到流动相pH范围的稳定性和消除色谱峰的分裂,在流动相中加入了2mM乙酸铵。以不同比例的甲醇-水和乙腈-水对9种抗癫痫药物进行洗脱实验,发现乙腈比甲醇具有更低的背景噪声和更好的分辨率。根据峰形、保留时间、稳定性和灵敏度,乙腈(2mM乙酸铵,0.1%乙酸)-水(2mM乙酸铵,以0.1%乙酸为流动相。资生堂CAPCELLPAC-MGⅢC18柱对9种抗癫痫药物有较好的保留作用,2mM乙酸铵对9种抗癫痫药物的响应显著增强。在优化的高效液相色谱条件下,总运行时间是5.5分钟。
本发明利用HPLC-MS/MS分析和MS参数优化正离子模式,提高了MRM测量对ESI源的响应。对于卡马西平(图1),MRM的碎片化转变为m/z 237.1到194。对于10-羟卡马西平(图1),MRM的碎片化转变为m/z 247.3到204.1。对于奥卡西平(图1),MRM的碎片化转变为m/z253.1到236。对于左乙拉西坦(图1),MRM的碎片化转变为m/z 171.1到126.1。对于拉莫三嗪(图1),MRM的碎片化转变为m/z 256到210.9。对于丙戊酸(图1),MRM的碎片化转变为m/z143.2到143.2。对于苯巴比妥(图1),MRM的碎片化转变为m/z 231.1到188.1。对于苯妥英钠(图1),MRM的碎片化转变为m/z 250.9到102.1。对于托吡酯(图1),MRM的碎片化转变为m/z337.9到78.1。
在样品制备的优化方面,与乙酸乙酯液-液萃取法相比,蛋白质沉淀法具有精度高、回收率高、操作简单等优点。样品制备采用蛋白质沉淀法。9种抗癫痫药物的定量限值可用于血浆样品中药物动力学的定量分析。
最初,沉淀蛋白的溶剂是乙腈和甲醇,但这造成了左乙拉西坦和10-羟卡马西平含量的巨大损失,这可能是由于乙腈和甲醇不能有效地将分析物从蛋白质中解吸出来造成的。影响电荷态分布的因素包括溶剂pH值和药物溶解度。左乙拉西坦和10-羟卡马西平的pKa较低,当pH较高时易降解。因此,一种更易溶解的溶液:乙腈:甲醇:甲酸按3:2:0.1的体积比混合,成功地解决了这个问题。
本发明的又一具体实施方式中,上述步骤(2)中色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm,5μm,日本SHISEIDO公司);流动相流速为0.4ml/min;柱温为35℃;进样量5μL。
本发明试验了四个流速(0.3mL/min,0.4mL/min和0.5mL/min)对检测结果的影响。结果表明:流速为0.4mL/min时,分离效果最佳,各色谱峰保留时间适宜,分离度好,基线平稳,峰形对称,因此选择流速为0.4mL/min。
同时,本发明试验了四个不同柱温(如25℃,30℃,35℃和40℃)对质谱色谱检测结果的影响。结果显示柱温为35℃时,色谱峰保留时间适宜,基线平稳,各色谱峰分离度较好,峰形对称,因此选择柱温为35℃。
9种抗癫痫药物及其内标化合物的质谱参数见表1。
表1 9种抗癫痫药物及其内标化合物的质谱参数
本发明同时对质谱条件进行优化,采用API5500型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化9种抗癫痫药物及其内标化合物的质谱条件,保证每一对离子对高响应的出峰,检测结果如表1所示,9种抗癫痫药物及其内标化合物均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。
在分析时间的选择上,本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了10min的色谱图。结果表明5.5min以后基本没有明显的色谱峰出现,同时为了照顾批次样品的差异性,保证所有批次样品的特征峰都能够被检出,因此选择5.5min作为分析时间。
本发明的又一具体实施方式中,步骤(3)中梯度洗脱方式为:0-1.5min,流动相B5-5%;1.5-1.9min,流动相B 5-70%;1.9-2.0min,流动相B 70-95%;2.0-3.8min,流动相B95-95%;3.8-3.9min,流动相B 95-5%;3.9-5.5min,流动相B 5-5%;
本发明的又一具体实施方式中,上述中质谱条件为:离子源:电喷雾(ESI);扫描方式:多反应监测(MRM);离子化方式:正离子;离子源电压:5000V;离子源温度:650℃;气帘气:15psi;雾化气:45psi;辅助气:55psi;
本发明的又一具体实施方式中,采用左乙拉西坦-d3、卡马西平-d10、10-羟卡马西平-d3、拉莫三嗪-c3d3、丙戊酸-d4、苯巴比妥-d5、苯妥英钠-d10、托吡酯-d12作为同位素内标化合物。
本发明采用HPLC-MS/MS液质联用分析方法,实验过程中尝试选择离子检测(SIM)模式测定,结果各成分响应较低且基线高,基质影响较大,无法实现定量分析,然而通过多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时,发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式,且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量9种抗癫痫药物,用常规液相方法检测存在耗时长,分离较难,检测限高等缺点,不利于试验的进行。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明,但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种同时测定多种抗癫痫药物在血浆中含量的方法,包括如下步骤:
第一步:
对照品溶液制备:9种抗癫痫药物的储备液用二甲基亚砜溶解精确称量的标准对照品,9种抗癫痫药物的最终浓度为1000μg/mL。将0.10mL精确体积的9种抗癫痫药物标准溶液移入10mL容量瓶中,并用乙腈定容,得到9种抗癫痫药物10μg/mL的工作液。用乙腈稀释,得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时,将9种抗癫痫药物的同位素内标原料药用一定体积二甲基亚砜溶解,制备1000μg/mL的内标储备液。9种抗癫痫药物的同位素内标的工作液浓度为50ng/mL,稀释溶剂为乙腈:甲醇=3:2,含0.1%甲酸。所有药物的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天,无变化。
在0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、25、30ng/mL的9种抗癫痫药物在血浆中的药物浓度点中制备其标准曲线。根据FDA关于选择质量控制点(QCs)的指南,为了进行准确度和精密度研究,QCs在4个浓度水平下制备为6个重复品,包括定量下限(LLOQ)、低(L:定义为LLOQ的三倍)、中(M:定义为中范围)和高(H:定义为高范围)。而对于其他试验(在样品分析期间),只使用了3种浓度水平(LQC、MQC和HQC)的样品。对于9种抗癫痫药物,分别在0.1、0.25、2.5和25ng/mL下制备LLOQ、LQC、MQC和HQC。
将45μL大鼠空白血浆置于2.0mL离心管中,加入精确体积5μL的9种抗癫痫药物2-600ng/mL工作溶液,以获得9种抗癫痫药物的0.1-30ng/mL血浆浓度。然后加入200μL 9种抗癫痫药物同位素内标的混合工作液(50ng/mL)(乙腈:甲醇=3:2,0.1%甲酸,V/V)沉淀蛋白,振荡10min,提取分析物及其内标,在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中,并涡旋混合2分钟,得到对照品溶液;
第二步:
测定:将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析,采用梯度洗脱,流动相A相:水(2mM乙酸铵,0.1%乙酸),流动相B相:乙腈(2mM乙酸铵,0.1%乙酸)。
在本实施例中,色谱柱为CAPCELL PAK-MGⅢC18(2.0×150mm,5μm,日本SHISEIDO公司);流动相流速为0.4ml/min;柱温为35℃;进样量5μL。各有效成分质谱参数见表1。梯度洗脱方式为:0-1.5min,流动相B 5-5%;1.5-1.9min,流动相B 5-70%;1.9-2.0min,流动相B 70-95%;2.0-3.8min,流动相B 95-95%;3.8-3.9min,流动相B 95-5%;3.9-5.5min,流动相B 5-5%。
质谱条件为:离子源:电喷雾(ESI);扫描方式:多反应监测(MRM);离子化方式:正离子;离子源电压:5000V;离子源温度:650℃;气帘气:15psi;雾化气:45psi;辅助气:55psi;
第三步:
对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对专属性、定量限、精密度、准确度、稳定性、基质效应及提取回收率。
专属性:通过比较六个人的空白血浆样品、在最后给药后0.5小时从其中一名受试者获得的临床血浆样品、以30ng/mL的浓度加入9种抗癫痫药物的血浆样品和以0.1ng/mL的浓度加入9种抗癫痫药物的血浆样品的色谱图来评估特异性和内源性干扰。通过比较50%乙腈和添加9种抗癫痫药物的三蒸馏水(0.1ng/mL)的最低定量限和9种抗癫痫药物内标(50ng/mL)的色谱图来评估特异性和外源性干扰。制备并分析所有空白血浆样品,以确保没有干扰峰。在所建立的色谱条件下,血浆中没有内源性干扰,表明该方法的选择性是可以接受的;
定量限:采用1/X2加权线性最小二乘回归模型,以9种抗癫痫药物/9种抗癫痫药物内标与血浆浓度的峰面积比构建校准曲线。最低定量限(LLOQ)表示线性范围内分析物的最低浓度,可以用可接受的精度和准确度进行测定。
精密度:在同一天对四种浓度(0.1、0.25、2.5和25ng/mL)的六个重复的LLOQ和QC样品进行分析,以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15%。然而,在LLOQ,RE和RSD<±20%是可以接受的。LLOQ和QC样品中9种抗癫痫药物的精密度和准确度结果见表2。9种抗癫痫药物各样品水平的精密度(RSD)均小于9.99%。对9种抗癫痫药物各样品水平的准确度在1.48%到8.31%之间。测定值均在可接受范围内。
表2血浆中测定9种抗癫痫药物含量方法的精密度和准确度
基质效应和提取回收率:提取回收率是通过比较在6个不同批次血浆中制备的三个水平的QC样品中提取的分析物与IS比的绝对峰面积与空白血浆、高溶血性血浆和高脂肪血浆提取后用相同浓度的分析物纯溶液进行强化LQC、MQC、HQC。通过比较六批样品在LQC、MQC、HQC水平下强化的空白血浆提取物与相同浓度水平分析物强化的空白水提取物中分析物绝对峰面积与IS比值的比较,来评估基质效应。在人空白血浆中,9种抗癫痫药物内标物均匀化的平均基质效应为98.2-108.0%,而高溶血性的平均基质效应为96.5-108.4%。在高脂血浆中,9种抗癫痫药物的基质效应为96.5-107.1%。如表3所示,所有相对标准偏差值在0.75%到9.17%之间,这表明血浆基质的影响对于分析来说是可以忽略的。9种抗癫痫药物内标物均匀化后的平均提取回收率为96.7-103.8%,不同浓度下9种抗癫痫药物的提取回收率结果准确、重现性好。
表3血浆中测定9种抗癫痫药物含量方法的提取回收率和基质效应(n=6)
稳定性试验:对三种不同浓度的QC样品在不同条件下的稳定性进行了分析:(1)室温(23℃)制备前3h;(2)冰箱温度(4℃)制备后20小时,室温(23℃)制备后6小时;(3)自动进样器10℃制备后24小时;(4)冰箱温度(-20℃)制备前3、8、31天。通过比较储存的QC样品和新制备的样品的平均浓度来评估溶液的稳定性。样品被认为是稳定的,与标称浓度的偏差在±15.0%以内。所有稳定性试验样品在6个重复中进行分析,并根据新制备的样品确定偏差。9种抗癫痫药物在室温下放置至少3h后,9种抗癫痫药物的CV%(5.35%)的响应无显著差异(<15%),表明9种抗癫痫药物在此条件下是稳定的。处理后的样品在自动进样器中稳定达24小时,在室温托盘中稳定达3小时,CV%值分别至少为6.57%和6.95%。结果见表4。
表4 9种抗癫痫药物的样品稳定性(n=6,以Mean±R.E.%表示)
实施例2
一种同时测定多种抗癫痫药物在血浆中含量的方法及其应用,包括如下步骤:
对12只健康雄性大鼠进行了药物动力学研究。伦理委员会批准了实验方案。给药前禁食12小时,给药后禁食2小时。灌胃给药后,在给药前和0时从颈静脉抽取2mL的血样。后分别于0.083,0.167,0.5,0.75,1,2,5、8、12和24小时取血。实验期间,可以自由饮水。随后在14000×g转速下离心10分钟制备血浆,并在-80℃下立即冷冻。
将50μL大鼠血浆置于2.0mL离心管中,加入含9种抗癫痫药物内标的200μL沉淀蛋白溶剂振荡10min提取分析物和内标,在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中,并涡旋混合2分钟,得到供试品溶液;
第二步:
测定:将步骤(1)得到的供试品溶液进行HPLC-MS/MS分析,采用梯度洗脱,流动相A相:水(2mM乙酸铵,以0.1%乙酸),流动相B相:乙腈(2mM乙酸铵,0.1%乙酸)。
药物动力学分析采用DAS2非房室模型软件程序(中国数学药理学专业委员会,中国上海)计算AUC、Cmax、Tmax、T1/2、Vz/F和CLz/F。数据以Mean±SD表示。
灌胃8种抗癫痫药物(10-羟卡马西平为奥卡西平的活性代谢物)后的平均血浆浓度-时间曲线如图3所示。药物动力学参数见表5。服用8种抗癫痫药物(1mg)后,1.90±0.384h(Tmax)的卡马西平最大观察血浆浓度(Cmax)为58.6±2.717ng/mL。从时间零点到最后可测浓度的血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)和从时间零点到血药消除的血药浓度-时间曲线下面积预测值(AUC0-∞)分别为69.31±14.90ng/mL·h和71.84±16.29ng/mL·h。1.34±0.784h(Tmax)的奥卡西平Cmax为27.8±3.651ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为45.85±13.24ng/mL·h和51.77±11.32ng/mL·h。2.17±0.367h(Tmax)的10-羟卡马西平Cmax为28.6±3.257ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为29.53±4.85ng/mL·h和32.54±9.54ng/mL·h。1.84±0.671h(Tmax)的托吡酯Cmax为18.2±3.254ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为58.51±8.54ng/mL·h和60.74±13.25ng/mL·h。0.96±0.341h(Tmax)的拉莫三嗪Cmax为83.2±1.587ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为85.61±21.35ng/mL·h和90.88±14.28ng/mL·h。1.12±0.425h(Tmax)的丙戊酸Cmax为54.3±2.235ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为49.52±6.88ng/mL·h和51.44±8.61ng/mL·h。1.32±0.652h(Tmax)的苯巴比妥Cmax为52.6±6.523ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为74.25±10.36ng/mL·h和85.32±8.96ng/mL·h。1.68±0.658h(Tmax)的苯妥英钠Cmax为26.3±1.985ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为52.36±2.15ng/mL·h和61.25±3.27ng/mL·h。2.44±0.547h(Tmax)的左乙拉西坦Cmax为5.3±1.321ng/mL。AUC0-t和AUC0-∞分别为63.21±7.51ng/mL·h和71.96±5.85ng/mL·h。所得数据表明卡马西平、奥卡西平、10-羟卡马西平、托吡酯、左乙拉西坦、丙戊酸、苯巴比妥相较于苯妥英钠和拉莫三嗪可快速吸收,缓慢消除,实验结果可应用于临床治疗难治性癫痫病时联合用药的剂量-效应研究。
表5灌胃8种抗癫痫药物后的非房室药物动力学参数(平均值±标准差,n=12)
应注意的是,以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明,但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法,所述抗癫痫药物包括卡马西平、10-羟卡马西平、奥卡西平、左乙拉西坦、托吡酯、丙戊酸、苯妥英钠、苯巴比妥和拉莫三嗪,其特征在于,所述方法包括:以标准品制作标准曲线定量,同时采用质控品进行质控,以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测;
所述待测血液样品的配制方法为:将试验样品与同位素内标工作液混合,离心取上清制得;
所述试验样品为受试者血液样品,包括全血、血浆或血清;
所述同位素内标工作液为9种抗癫痫药物同位素内标工作液的混合;
所述同位素内标工作液制备方法为:将抗癫痫药物的同位素内标原料药使用二甲基亚砜溶解,然后采用沉淀蛋白溶剂稀释得同位素内标工作液;
所述沉淀蛋白溶剂为含有甲酸的乙腈与甲醇的混合溶液,所述乙腈和甲醇的用量体积比为3:2;所述甲酸含量为0.1%;
所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为:
液相色谱条件包括:
采用梯度洗脱,流动相A相:水,2 mM乙酸铵,0.1 %乙酸,流动相B相:乙腈,2 mM乙酸铵,0.1%乙酸;
色谱柱为C18色谱柱;流动相流速为0.4 ml/min;柱温为35℃;进样量5 μL;
梯度洗脱方式具体为:0-1.5 min,流动相B 5-5%;1.5-1.9min,流动相B 5-70%;1.9-2.0 min,流动相B 70-95%;2.0-3.8 min,流动相B 95-95%;3.8-3.9 min,流动相B 95-5%;3.9-5.5min,流动相B 5-5%;
质谱条件包括:
离子源:电喷雾ESI;扫描方式:多反应监测MRM;离子化方式:正离子;离子源电压:5000V;离子源温度:650 ℃;气帘气:15 psi;雾化气:45 psi;辅助气:55 psi。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述抗癫痫药物质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25 ng/mL。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述试验样品为受试者血浆。
5.权利要求1-4任一项所述同时测定多种抗癫痫药物在血液中含量的方法在药代动力学研究中的应用。
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