CN112903849B

CN112903849B - 一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法、试剂盒及其应用

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Publication number: CN112903849B
Application number: CN202110083684.6A
Authority: CN
Inventors: 冯振; 景叶松; 弭兆元
Original assignee: Shandong Ying Sheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Ying Sheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2041-01-21
Also published as: CN112903849A

Abstract

本发明提供一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法、试剂盒及其应用，属于医药检测技术领域。本发明采用沉淀蛋白法结合HPLC‑MS/MS检测右佐匹克隆含量在人体血浆中的含量，并从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对右佐匹克隆在人血浆中的测定方法进行了充分的验证，最终应用于口服给药的人体药动学研究，并能够通过非房室模型计算药动学参数，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

失眠已被强调为主要的公共卫生问题。睡眠问题的高发生率和广泛的对精神和身体健康的影响和身体健康，以及功能受损，使得人们越来越意识到获得足够高质量睡眠的重要性。临床常用右佐匹克隆治疗不同类型的睡眠障碍，研究表明，它是由其GABA受体复合物与苯二氮卓受体耦合而成，通过激活GABA受体增加神经抑制，具有明显的镇静作用。右佐匹克隆，化学名为(S)-(+)-6-(5-氯-2-吡啶基)-7-氧代-6，7-二氢-5H-吡咯[3,4-b]吡嗪-5-基-4-甲基-1-哌嗪羧酸盐，是一种非苯二氮卓类催眠剂，属于环吡咯啉类，微溶于水和乙醇，溶于磷酸盐缓冲液(pH 3.2)。已有报道评估佐匹克隆和右佐匹克隆的药代动力学，结果表明R，S-佐匹克隆的清除率是立体选择性的，与活性较低的R-对映体相比，右佐匹克隆的清除率更低，T_1/2更长。在这几十年中，研究发现，受试者在夜间服用3mg的右佐匹克隆，第二天早上他们的精神运动功能不同程度地降低，这可能导致诸如驾驶、记忆和协调等不可察觉的活动的减少。为了更好地了解右佐匹克隆的药代动力学，需要一种灵敏、特异、准确的测定人血浆中右佐匹克隆的方法，以观察右佐匹克隆的量效关系。

关于使用高效液相色谱-紫外色谱法(HPLC-UV)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS/MS)和高效薄层色谱法(HPTLC)对生物液中右佐匹克隆进行定量的论文已经发表。N Sharma等人在2013年采用HPLC-UV方法在13分钟内定量右佐匹克隆，曲线范围为0.02-7.2μg/mL，但分析时间太长，无法实现高通量。Van Bocklaer等人报道了首次采用气相色谱-串联质谱(GC-MS)测定血液和胃内容物中右佐匹克隆的方法，方法检测右佐匹克隆的最低定量限(LLOQ)为2ng/mL，与HPLC-MS/MS相比，该方法的灵敏度较低。Gebauer MG等人报道开发了液-液萃取(LLE)相结合的HPLC-MS/MS方法，该方法仅使用50μL样品体积，右佐匹克隆的LLOQ为0.1ng/mL。Meng等人报道了HPLC-MS/MS法与固相萃取法(SPE)联用测定人血浆中右佐匹克隆的方法，曲线范围为1.00–100ng/mL，使用50μL样品体积是该方法的亮点。在这些技术中，HPLC-MS/MS的灵敏度最高，这是由于其具有较高的选择性。然而，包括LLE和SPE在内的样品预处理过程相对复杂，例如，用温和的氮气流分离离心后的有机层并在40℃下蒸发干燥。这种预处理不仅增加了操作的复杂性，降低了处理量，而且还导致了不良的有机污染，这是临床实验室难以接受的。因此，在药代动力学研究中，右佐匹克隆含量测定中存在的样品制备问题亟待解决。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法、试剂盒及其应用。本发明采用沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS检测右佐匹克隆含量在人体血浆中的含量，并从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对右佐匹克隆在人血浆中的测定方法进行了充分的验证，最终应用于口服给药的人体药动学研究，并能够通过非房室模型计算药动学参数，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法，所述方法包括：以标准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控，以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；

具体的，采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控。

其中，所述右佐匹克隆质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25ng/mL。

所述待测血液样品的配制方法为：将试验样品与内标工作液混合，离心取上清制得。

所述试验样品为受试者全血、血浆或血清，进一步优选为血浆。

所述内标工作液为同位素内标的右佐匹克隆(右佐匹克隆-d8)溶液，具体制备方法包括：将同位素内标的右佐匹克隆原料药使用乙腈溶解配制成内标储备液，然后使用沉淀蛋白溶剂稀释即得。

所述沉淀蛋白溶剂为含甲酸的乙腈与二甲基亚砜的混合溶液，所述乙腈和二甲基亚砜的用量体积比为6～9:2～4，优选为7:3，所述甲酸含量为0.05～0.3％，优选为0.1％。

所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：

液相色谱条件包括：

采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM乙酸铵，0.1％乙酸)，流动相B相：乙腈(10mM乙酸铵，0.1％乙酸)；

色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3～0.5ml/min(优选为0.4ml/min)；柱温为25～40℃(优选为35℃)；进样量1～10μL(优选为5μL)；

具体的，所述色谱柱为CAPCELL PAC-MGⅢC18色谱柱(2.0×150mm，5μm)，经研究发现，其对右佐匹克隆有较好的保留作用。

梯度洗脱方式具体为：0-1.5min，流动相B 55-55％；1.5-1.9min，流动相B 55-70％；1.9-2.0min，流动相B 70-95％；2.0-3.5min，流动相B 95-95％；3.5-3.6min，流动相B95-55％；3.6-4.5min，流动相B 55-55％。

质谱条件包括：

离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi。

本发明的第二个方面，提供检测右佐匹克隆的试剂盒，所述试剂盒包括，右佐匹克隆标准品；

右佐匹克隆-d8内标标准品；

稀释液为乙腈或乙腈/二甲基亚砜/甲酸混合溶液；

其中，所述乙腈/二甲基亚砜/甲酸混合溶液的用量体积比为6～9:2～4:0.05～0.3，优选为3:7:0.1。

进一步的，所述试剂盒还包括空白血浆。

本发明的第三个方面，提供上述检测血液中右佐匹克隆的方法和/或检测试剂盒在药代动力学研究中的应用。

具体的，所述应用包括：基于上述检测方法对口服给药的人体药代动力学进行研究。

与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：

上述技术方案提供了一种沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS测定右佐匹克隆在人体血浆中含量的方法，从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对右佐匹克隆在人血浆中的测定进行了充分的验证，最终应用于口服给药的人体药动学研究。

上述技术方案前处理过程较简单，便于操作，安全且样本用量少，整个实验成本低。液质联用定量测定方法具有准确可靠、灵敏度高、专属性检测限和定量限更低等优点，对血浆中药物成分含量分析具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8的结构式(A：右佐匹克隆，B：右佐匹克隆-d8)；

图2为本发明实施例1中右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8的母离子、子离子质谱图和碎裂方式(A：右佐匹克隆，B：右佐匹克隆-d8)；

图3为人血浆中测定右佐匹克隆含量方法的专属性考察结果；

图4为口服右佐匹克隆后的平均血浆浓度-时间曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，在药代动力学研究中，右佐匹克隆含量测定中存在的样品制备问题亟待解决。

有鉴于此，本发明提供一种沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS测定右佐匹克隆在人体血浆中含量的方法，从特异性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应、回收率和稳定性等方面对右佐匹克隆在人血浆中的测定进行了充分的验证，最终应用于口服给药的人体药动学研究。

(1)对照品溶液制备：右佐匹克隆储备液用乙腈溶解精确称量的标准对照品，右佐匹克隆的最终浓度为1000μg/mL。将精确体积的0.10mL右佐匹克隆标准溶液移入10mL容量瓶中，并用乙腈定容，得到右佐匹克隆10μg/mL的工作液。用乙腈稀释，得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时，将精确重量的10.00mg右佐匹克隆-d8原料药转移到10mL容量瓶中，用一定体积乙腈溶解，制备1000μg/mL的内标储备液。右佐匹克隆-d8的工作液浓度为50ng/mL，稀释溶剂为乙腈(ACN):二甲基亚砜(DMSO)＝7:3(V/V)，含0.1％甲酸。所有药物的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天，无变化。

在0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、20、25、30ng/mL的右佐匹克隆血浆中药物浓度点中制备其校准标准。根据FDA关于选择质量控制点(QCs)的指南，为了进行准确度和精密度研究，QCs在4个浓度水平下制备为6个重复品，包括定量下限(LLOQ)、低(L：定义为LLOQ的三倍)、中(M：定义为中范围)和高(H：定义为高范围)。而对于其他试验(在志愿者样品分析期间)，只使用了3种浓度水平(LQC、MQC和HQC)的样品。对于右佐匹克隆，分别在0.1、0.25、2.5和25ng/mL下制备LLOQ、LQC、MQC和HQC。

将190μL人空白血浆置于2.0mL离心管中，加入精确体积10μL的右佐匹克隆2-600ng/mL工作溶液，以获得右佐匹克隆的0.1-30ng/mL血浆浓度。然后加入含50ng/mL右佐匹克隆-d8的300μL沉淀蛋白溶剂(ACN:DMSO＝7:3，0.1％甲酸，V/V)振荡10min提取右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8，在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到对照品溶液；

(2)测定：将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM乙酸铵，以0.1％乙酸，流动相B相：乙腈(10mM乙酸铵，0.1％乙酸)。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤(1)中将190μL人空白血浆置于2.0mL离心管中，加入精确体积10μL的右佐匹克隆2-600ng/mL工作溶液，以获得右佐匹克隆的0.1-30ng/mL血浆浓度。然后加入含50ng/mL右佐匹克隆-d8的200-400μL沉淀蛋白溶剂(ACN:DMSO＝7:3，0.1％甲酸，V/V)振荡10min提取右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8，在4℃下以13000-15000rpm离心10-20min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到对照品溶液。

本发明为了获得满意的色谱行为和最大限度地提高右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8的电离响应，我们在流动相体系上进行了几次尝试。由于右佐匹克隆具有酸性，故采用乙酸溶液作为流动相，以提高响应速度。考虑到流动相pH范围的稳定性和消除色谱峰的分裂，在流动相中加入了10mM乙酸铵。以不同比例的甲醇-水和乙腈-水对右佐匹克隆进行洗脱实验，发现乙腈比甲醇具有更低的背景噪声和更好的分辨率。结合右佐匹克隆在水和乙醇中微溶、在磷酸盐缓冲液(pH 3.2)中微溶的特点，在PKa＝6.89的条件下，我们设计了一种pH＝4.0的流动相，添加了10mM乙酸铵和0.1％乙酸。根据峰形、保留时间、稳定性和灵敏度，乙腈(10mM乙酸铵，0.1％乙酸)-水(10mM乙酸铵，以0.1％乙酸为流动相。资生堂CAPCELL PAC-MGⅢC18柱对右佐匹克隆有较好的保留作用，10mM乙酸铵对右佐匹克隆的响应显著增强。在优化的高效液相色谱条件下，检测到右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8在保留时间为1.97和1.90分钟。总运行时间是4.5分钟。

本发明利用HPLC-MS/MS分析和MS参数优化正离子模式，提高了MRM测量对ESI源的响应。对于右佐匹克隆(图1)，MRM的碎片化转变为m/z 389.2到245.1(图2)，对于右佐匹克隆-d8(图1)为m/z 397.2到245.1(图2)，每个转变的停留时间为300ms。每个化合物的碰撞能为22ev。分离电位保持在40V。适用于所有分析物的源参数为15psi的幕气、介质的碰撞气体(CAD)、温度为650℃、离子喷射电压为5000V、离子源气体为60psi。

在样品制备的优化方面，与乙酸乙酯液-液萃取法相比，蛋白质沉淀法具有精度高、回收率高、操作简单等优点。样品制备采用蛋白质沉淀法。右佐匹克隆的定量限值可用于人血浆样品中药物动力学的定量分析。

最初，沉淀蛋白的溶剂是乙腈和甲醇，但这造成了右佐匹克隆含量的巨大损失，这可能是由于乙腈和甲醇不能有效地将分析源从蛋白质中解吸出来造成的。影响电荷态分布的因素包括溶剂pH值和药物溶解度。右佐匹克隆在水中的溶解度很低，在纯乙醇和正丙醇中的溶解度最低，这表明右佐匹克隆在醇中的溶解性很低，但在乙酸乙酯中的溶解度较高。因此，一种更易溶解的溶液二甲基亚砜与乙腈和甲酸按3:7:0.1的比例混合，成功地解决了这个问题。二甲基亚砜浓度高于此比值将显著降低仪器灵敏度。

本发明的又一具体实施方式中，上述步骤(2)中色谱柱为CAPCELL PAK C18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。

本发明试验了四个流速(0.3mL/min,0.4mL/min和0.5mL/min)对检测结果的影响。结果表明：流速为0.4mL/min时，分离效果最佳，各色谱峰保留时间适宜，分离度好，基线平稳，峰形对称，因此选择流速为0.4mL/min。

同时，本发明试验了四个不同柱温(如25℃，30℃，35℃和40℃)对质谱色谱检测结果的影响。结果显示柱温为35℃时，色谱峰保留时间适宜，基线平稳，各色谱峰分离度较好，峰形对称，因此选择柱温为35℃。

右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8的质谱参数见表1。

表1右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8的质谱参数

本发明同时对质谱条件进行优化，采用API5500型三重四级杆质谱仪的多反应离子检测模式(MRM)优化右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8的质谱条件，保证每一对离子对高响应的出峰，检测结果如表1所示，右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8均找到特异性的母离子、子离子用于定量分析。

在分析时间的选择上，本发明在选择色谱图谱的洗脱时间时记录了10min的色谱图。结果表明4.5min以后基本没有明显的色谱峰出现，同时为了照顾批次样品的差异性，保证所有批次样品的特征峰都能够被检出，因此选择4.5min作为分析时间。

本发明的又一具体实施方式中，步骤(3)中梯度洗脱方式为：0-1.5min，流动相B55-55％；1.5-1.9min，流动相B 55-70％；1.9-2.0min，流动相B70-95％；2.0-3.5min，流动相B 95-95％；3.5-3.6min，流动相B 95-55％；3.6-4.5min，流动相B 55-55％。

本发明的又一具体实施方式中，上述中质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi；

本发明的又一具体实施方式中，采用右佐匹克隆-d8作为同位素内标化合物。

本发明采用HPLC-MS/MS液质联用分析方法，实验过程中尝试选择离子检测(SIM)模式测定，结果各成分响应较低且基线高，基质影响较大，无法实现定量分析，然而通过多反应检测(MRM)法对母离子和特征碎片的子离子进行扫描时，发现离子峰的响应强度明显高于选择离子检测(SIM)模式，且基线低可实现定量分析。因此实验选用多反应检测(MRM)扫描模式用于定量右佐匹克隆，用常规液相方法检测存在耗时长，分离较难，检测限高等缺点，不利于试验的进行。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS测定右佐匹克隆在人体血浆中含量的方法，包括如下步骤：

第一步：

对照品溶液制备：右佐匹克隆储备液用乙腈溶解精确称量的标准对照品，右佐匹克隆的最终浓度为1000μg/mL。将精确体积的0.10mL右佐匹克隆标准溶液移入10mL容量瓶中，并用乙腈定容，得到右佐匹克隆10μg/mL的工作液。用乙腈稀释，得到2、4、10、20、100、200、400和600ng/mL的工作液。同时，将精确重量的10.00mg右佐匹克隆-d8原料药转移到10mL容量瓶中，用一定体积乙腈溶解，制备1000μg/mL的内标储备液。右佐匹克隆-d8的工作液浓度为50ng/mL，稀释溶剂为乙腈(ACN):二甲基亚砜(DMSO)＝7:3，V/V，含0.1％甲酸。所有药物的储备液在4℃的避光容器中储存至少60天，无变化。

第二步：

测定：将步骤(1)得到的对照品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM乙酸铵，以0.1％乙酸，流动相B相：乙腈(10mM乙酸铵，0.1％乙酸)。

在本实施例中，色谱柱为CAPCELL PAK-MGⅢC18(2.0×150mm，5μm，日本SHISEIDO公司)；流动相流速为0.4ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。各有效成分质谱参数见表1。梯度洗脱方式为：0-1.5min，流动相B 55-55％；1.5-1.9min，流动相B 55-70％；1.9-2.0min，流动相B 70-95％；2.0-3.5min，流动相B 95-95％；3.5-3.6min，流动相B 95-55％；3.6-4.5min，流动相B 55-55％。

质谱条件为：离子源：电喷雾(ESI)；扫描方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650℃；气帘气：15psi；雾化气：45psi；辅助气：55psi；

第三步：

对建立的高效液相串联质谱的方法可行性进行考察的方法包括对专属性、定量限、精密度、准确度、稳定性、基质效应及提取回收率。

专属性：通过比较六个人的空白血浆样品、在最后给药后0.5小时从其中一名受试者获得的临床血浆样品、以30ng/mL的剂量加入右佐匹克隆的血浆样品和以0.1ng/mL的剂量加入右佐匹克隆的血浆样品的色谱图来评估特异性和内源性干扰。通过比较50％乙腈和添加右佐匹克隆的三蒸馏水(0.1ng/mL)的LLOQ和Esopiclone-d8(50ng/mL)的色谱图来评估特异性和外源性干扰。制备并分析所有空白血浆样品，以确保没有干扰峰。空白血浆、以2ng/mL加入右佐匹克隆的空白血浆、以600ng/mL加入右佐匹克隆的空白血浆以及口服右佐匹克隆后获得的临床血浆样本的代表性色谱图如图3所示。在所建立的色谱条件下，血浆中没有内源性干扰，表明该方法的选择性是可以接受的；

定量限：采用1/X²加权线性最小二乘回归模型，以右佐匹克隆/右佐匹克隆-d8与血浆浓度的峰面积比构建校准曲线。LLOQ表示线性范围内分析物的最低浓度，可以用可接受的精度和准确度进行测定。

精密度：在同一天对四种浓度(0.1、0.25、2.5和25ng/mL)的六个重复的LLOQ和QC样品进行分析，以评估日内精密度和准确度。通过连续三天分析LLOQ和QC样本来评估日间精密度和准确度。方法的精密度和准确度分别用相对标准偏差(RSD)和相对误差(RE)表示。RSD和RE均不得超过15％。然而，在LLOQ，RE和RSD<±20％是可以接受的。LLOQ和QC样品中右佐匹克隆的精密度和准确度结果见表2。右佐匹克隆各样品水平的精密度(RSD)均小于9.99％。对右佐匹克隆各样品水平的准确度在1.48％到8.31％之间。测定值均在可接受范围内。

表2人血浆中测定右佐匹克隆含量方法的精密度和准确度

基质效应和提取回收率：提取回收率是通过比较在6个不同批次血浆中制备的三个水平的QC样品中提取的分析物与IS比的绝对峰面积与空白血浆、高溶血性血浆和高脂肪血浆提取后用相同浓度的分析物纯溶液进行强化LQC、MQC、HQC。通过比较六批样品在LQC、MQC、HQC水平下强化的空白血浆提取物与相同浓度水平分析物强化的空白水提取物中分析物绝对峰面积与IS比值的比较，来评估基质效应。在人空白血浆中，右佐匹克隆内标物均匀化的平均基质效应为101.2-106.0％，而高溶血性的平均基质效应为99.9-101.4％。在高脂血浆中，右佐匹克隆的基质效应为95.5-101.1％。如表3所示，所有相对标准偏差值在0.75％到9.17％之间，这表明血浆基质的影响对于分析来说是可以忽略的。右佐匹克隆内标物均匀化后的平均提取回收率为96.7-103.8％，不同浓度下右佐匹克隆的提取回收率结果准确、重现性好。

表3人血浆中测定右佐匹克隆含量方法的提取回收率和基质效应(n＝6)。

稳定性试验：对三种不同浓度的QC样品在不同条件下的稳定性进行了分析：(1)连续三次冻融循环(从-20℃到23℃)；(2)室温(23℃)制备前3h；(3)冰箱温度(4℃)制备后20小时，室温(23℃)制备后6小时；(4)自动进样器10℃制备后24小时；(5)冰箱温度(-20℃)制备前3、8、31天。通过比较储存的QC样品和新制备的样品的平均浓度来评估溶液的稳定性。样品被认为是稳定的，与标称浓度的偏差在±15.0％以内。所有稳定性试验样品在6个重复中进行分析，并根据新制备的样品确定偏差。右佐匹克隆在三次冻融和室温下放置至少3h后，右佐匹克隆的CV％(7.35％)的响应无显著差异(<15％)，表明右佐匹克隆在此条件下是稳定的。血浆样品在至少三个冷冻/解冻循环中的CV值(11.92％)稳定。处理后的样品在自动进样器中稳定达24小时，在室温托盘中稳定达3小时，CV％值分别至少为6.88％和7.35％。血浆样品在-20℃下稳定至少4周，无明显损失(<8.43％)。结果见表4和表5。

表4右佐匹克隆的样品稳定性(n＝6，以Mean±R.E.％表示)

表5右佐匹克隆溶液稳定性(n＝6)

实施例2

一种沉淀蛋白法结合HPLC-MS/MS测定右佐匹克隆在人体血浆中含量的方法及其应用，包括如下步骤：

第一步：

对12名健康男性受试者进行了药代动力学研究。伦理委员会批准了方案，志愿者得到了知情的书面同意。给药前禁食12小时，给药后禁食3小时。口服给药后，在给药前和0时从颈静脉抽取2mL的血样。后分别于0.083，0.167，0.333，0.5，0.75，1，1.25，1.75，2，2.5、3、4、5、6、8、12和24小时取血。实验期间，可以自由饮水。随后在14000×g转速下离心10分钟制备血浆，并在-80℃下立即冷冻。

将200μL人空白血浆置于2.0mL离心管中，加入含50ng/mL右佐匹克隆-d8的300μL沉淀蛋白溶剂(ACN:DMSO＝7:3，0.1％甲酸，V/V)振荡10min提取右佐匹克隆和右佐匹克隆-d8，在4℃下以14000rpm离心15min分离上部有机相和下部水相。将100μL上清液溶解于200μL水相中，并涡旋混合2分钟，得到供试品溶液；

第二步：

测定：将步骤(1)得到的供试品溶液进行HPLC-MS/MS分析，采用梯度洗脱，流动相A相：水(10mM乙酸铵，以0.1％乙酸，流动相B相：乙腈(10mM乙酸铵，0.1％乙酸)。

药代动力学分析采用DAS2非房室模型软件程序(中国数学药理学专业委员会，中国上海)计算AUC、C_max、T_max、T_1/2、Vz/F和CLz/F。数据以Mean±SD表示。

口服右佐匹克隆后的平均血浆浓度-时间曲线如图4所示。药代动力学参数见表6。服用右佐匹克隆(1mg)后，0.92±0.446h(T_max)的最大观察血浆浓度(C_max)为13.27±2.717ng/mL。从时间零点到最后可测浓度(AUC_0-t)的血药浓度-时间曲线下面积(AUC_0-∞)分别为69.31±14.90ng/mL·h和71.84±16.29ng/mL·h。CLz/F为14.595±3.356l h，Vz/F为100.26±13.9l h，T1/2为4.90±0.819h，所得数据表明右佐匹克隆可快速吸收，缓慢消除。

表6口服右佐匹克隆后的非房室药代动力学参数(平均值±标准差，n＝12)

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种检测血液中右佐匹克隆含量的方法，其特征在于，所述方法包括：以右佐匹克隆标准品制作标准曲线定量，同时采用质控品进行质控，以及基于HPLC-MS/MS对待测血液样品进行检测；

所述待测血液样品的配制方法为：将试验样品与内标工作液混合，离心取上清制得；

所述试验样品为受试者血液样品，包括全血、血浆或血清；

所述内标工作液为右佐匹克隆-d8溶液，具体制备方法包括：将同位素内标的右佐匹克隆原料药使用乙腈溶解配制成内标储备液，然后使用沉淀蛋白溶剂稀释即得；

所述沉淀蛋白溶剂为含甲酸的乙腈与二甲基亚砜的混合溶液，所述乙腈和二甲基亚砜的用量体积比为7:3；所述甲酸含量为0.1%。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用定量下限、低、中和高四个水平的质控品进行质控或采用低、中和高三个水平的质控品进行质控。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述右佐匹克隆质控品的定量下限、低、中和高浓度均分别为0.1、0.25、2.5和25 ng/mL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述试验样品为受试者血浆。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：

液相色谱条件包括：

采用梯度洗脱，流动相A相：水，10 mM乙酸铵，0.1 %乙酸；流动相B相：乙腈，10 mM乙酸铵，0.1%乙酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为0.3~0.5ml/min；柱温为25~40℃；进样量1~10 μL。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，流动相流速为0.4 ml/min；柱温35℃；进样量为5 μL。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，梯度洗脱方式具体为：0-1.5 min，流动相B55-55%；1.5-1.9min，流动相B 55-70%；1.9-2.0 min，流动相B 70-95%；2.0-3.5 min，流动相B 95-95%；3.5-3.6 min，流动相B 95-55%；3.6-4.5min，流动相B 55-55%。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件包括：

离子源：电喷雾ESI；扫描方式：多反应监测MRM；离子化方式：正离子；离子源电压：5000V；离子源温度：650 ℃；气帘气：15 psi；雾化气：45 psi；辅助气：55 psi。

10.一种检测右佐匹克隆的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括，右佐匹克隆标准品；右佐匹克隆-d8内标标准品；以及稀释液，所述稀释液为乙腈/二甲基亚砜/甲酸混合溶液；

所述乙腈/二甲基亚砜/甲酸混合溶液的用量体积比为3:7:0.1。

11.如权利要求10所述的检测右佐匹克隆的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括空白血浆。

12.权利要求1-9任一项所述检测血液中右佐匹克隆的方法和/或权利要求10-11任一项所述试剂盒在药代动力学研究中的应用。

13.如权利要求12所述应用，其特征在于，所述应用包括：基于检测血液中右佐匹克隆的方法对口服给药的人体药代动力学进行研究。