CN103217493B

CN103217493B - 一种用hplc法测定卡巴他赛有关物质的方法

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Publication number: CN103217493B
Application number: CN201310108598.1A
Authority: CN
Inventors: 巴晓雨; 郝福; 刘军锋
Original assignee: Shenwei Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Shenwei Pharmaceutical Group Co Ltd
Priority date: 2013-03-30
Filing date: 2013-03-30
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-03-30
Also published as: CN103217493A

Abstract

本发明涉及一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法。该方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点，可用于监测卡巴他赛合成反应工艺，合成品或原料药及制剂的质量。

Description

一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法

技术领域

本发明涉及是一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，尤其是卡巴他赛中间体杂质的测定方法，属于药物分析技术领域。

背景技术

卡巴他赛（cabazitaxel）是一种紫杉烷类微管抑制剂，适用于与泼尼松联用治疗既往用含多烯紫杉醇治疗方案激素难治转移性前列腺癌患者。其化学名称为7,10-双甲基化多西紫杉醇，分子式为C₄₅H₅₇NO₁₄，化学结构如下：

目前，卡巴他赛是以植物红豆杉提取物10-去乙酰基-巴卡丁III（简称10-DAB，分子式C29H36O10）作为起始原料进行制备，例如：CN1179775A（公开日1998-04-22）先保护7,13位上羟基，再对10位羟基进行甲基化，然后脱除7,13位上的三乙基甲硅基脱保护，对7位羟基甲基化后，与侧链酸进行耦合，提纯后去保护得到卡巴他赛；或者，CN102417491A（公开日2012-04-28）先与侧链酸进行偶合，再脱去7,10位上两个保护基（2,2,2-三氯乙氧基羰基），然后通过氢化钠/碘甲烷对7,10位上的羟基进行甲基化，再开环去保护获得卡巴他赛；或者，CN102675256A（公开日2012-09-19）先将7,10位羟基用2,2,2-三氯乙氧基氯甲酸酯保护后，与内酰胺侧链反应，再脱去7,10位上羟基保护基，然后7,10位双甲基化，最后在酸性条件下水解得到卡巴他赛；等等。关于卡巴他赛的制备方法，均以10-DAB作为起始原料，并需将其7、10、13位羟基部分或全部采用不同的保护基团，如乙氧基乙基（EE）、三甲基硅基、三乙基硅基（TES）、叔丁基二甲硅基（TBDS）、叔丁基二苯基硅基、三氯乙氧基羰基（Troc）进行保护，然后脱保护，所得中间体均具有10-DAB的母核结构。

其中，CN102417491A中，在卡巴他赛合成过程中生成如下4个中间体杂质。

在药物制备和贮存过程中,对合成方法可能产生的杂质（包括中间体、副产物等有机杂质）进行监测，对于终产品的质量生产过程以及药品的质量控制非常重要。

本发明首次公开了一种卡巴他赛有关物质的测定方法，采用C18色谱快速准确地测定卡巴他赛及其中间体杂质和起始原料，从而实现了卡巴他赛中间体杂质的控制，保证了卡巴他赛及其制剂的质量可控。

发明内容

本发明的目的是提供一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，可用于卡巴他赛合成过程和终产品及其制剂的质量控制。

本发明提供了一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其选用十八烷基键合硅胶色谱柱，以水相-有机相为流动相进行梯度洗脱，检测波长为220-240nm，其中所述水相选自水，乙酸胺，或浓度为0.01mol/L～0.05mol/L的pH为6.0～7.0的磷酸盐缓冲溶液中的任意一种或其任意混合物，所述有机相选自甲醇、乙醇或乙腈。

在本发明一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液选自磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钾缓冲溶液或磷酸氢二钠缓冲溶液，优选磷酸氢二钠缓冲溶液。在本发明的一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度优选0.01mol/L～0.03mol/L，更优选0.025mol/L。在本发明的一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0。

在本发明的一些实施方案中，所述十八烷基键合硅胶色谱柱填料的颗粒度为3-5μm，优选5μm。

在本发明的一些实施方案中，所述检测波长为230nm。

在本发明的一些实施方案中，所述水相-有机相是水-乙腈。

在本发明的一些实施方案中，所述水-乙腈梯度洗脱的体积比为35%-45%：65%-55%（0min），15%：85%（30min），0%-10%：100%-90%（50min），15%：85%（55min）和35%-45%：65%-55%（60min），优选40%：60%（0min），15%：85%（30min），0%：100%（50min），15%：85%（55min）和40%：60%（60min）。

在本发明的一些实施方案中，所述水相-有机相是磷酸氢二钠缓冲溶液-乙腈，其中磷酸氢二钠缓冲溶液的pH为7.0、浓度为0.025mol/L。

在本发明的一些实施方案中，所述磷酸氢二钠缓冲溶液-乙腈梯度洗脱的体积比为50%：50%（0min），15%：85%（30min），0%：100%（50min），15%：85%（55min）和50%：50%（60min）。

更进一步地，本发明提供了一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其包括以下步骤：

a.取卡巴他赛适量，先用乙腈溶解后再用流动相定容，配制成卡巴他赛浓度为1mg/mL的供试品溶液；

b.取供试品溶液，采用HPLC法测定卡巴他赛有关物质，调节检测灵敏度使供试品溶液中卡巴他赛的峰高约为满量程的20%、单个杂质的峰面积不得大于主峰峰面积的一半、杂质峰面积总和不得大于主峰面积，其中采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，水-乙腈梯度洗脱的体积比为40%：60%（0min）、15%：85%（30min）、0%：100%（50min）、15%：85%（55min）和40%：60%（60min），柱填料的颗粒度为5μm，检测波长为230nm。

值得注意的是，现有卡巴他赛的制备均以10-DAB作为起始原料进行半合成，不同反应路径获得的中间体均具有相同的10-DAB母核结构，并且结构非常类似。因此，本发明亦可适用于除了CN102417491A披露的其他合成路径的10-DAB、中间体和卡巴他赛的检测，并且包括在本发明的保护范围内。

本发明中，术语“卡巴他赛”在没有明确区分的情况下，可以是卡巴他赛的纯品、原料药、合成品等以卡巴他赛作为主成分的产品。本发明的测定方法均适用于上述产品的质量控制，并且这些产品的有关物质的测定方法也保护在本发明的保护范围内。

本发明中，术语“有关物质”是指在药物制备和贮存过程中,对合成方法可能产生的杂质（包括中间体、副产物等有机杂质）。

本发明中，典型的“水相”包括，但不限于，水，缓冲盐溶液例如磷酸盐（磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠）缓冲液，乙酸胺等pH值中性或近中性的溶剂或溶液；典型的“有机相”包括，但不限于，甲醇、乙醇、乙腈等适于色谱分析方法溶剂或溶液。本发明的流动相中水相和有机相的选择取决于所分析的物质的理化性质，尤其是极性。

本发明的方法具有分离度好、简单快速、专属性强、灵敏度高等特点，其适用于卡巴他赛及其中间体杂质和起始原料的检测，可用于10-DAB、卡巴他赛及其中间体的定性和定量分析，或进一步用于监测卡巴他赛合成反应工艺、终产品或原料药及制剂的质量。

附图说明：

图110DAB、卡巴他赛及其中间体杂质的HPLC色谱图（水-乙腈梯度洗脱）

图210DAB、卡巴他赛及其中间体杂质的HPLC色谱图（磷酸氢二钠缓冲溶液-乙腈梯度洗脱）

图3卡巴他赛合成品的HPLC色谱图（水-乙腈梯度洗脱）

具体实施方案

下面用具体实施例来进一步解释和说明本发明，但并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

实验材料与仪器条件

卡巴他赛，购自成都伊诺达博医药科技有限公司，纯度为99.88%；10-DAB，购自江苏红豆杉药业有限公司，纯度为99.8%；卡巴他赛中间体1-4为本公司合成品，纯度为96.7%、74.7%、95.5%、75.5%。

德国戴安U3000，VWD检测器及变色龙工作站，色谱柱：绿百草C18，250mm×4.6mm，5μm，检测波长：230nm，进样量：20μL（仪器自动进样），流速：1mL/min，柱温：35℃，流动相：水（水相）-乙腈（有机相）梯度洗脱，其梯度比如表1。

表1

实验步骤

精密称取卡巴他赛及其中间体1-4，10-DAB各10mg，置于10mL量瓶中，先加入5mL的乙腈溶解再加入流动相定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按照上述方法，分别称取卡巴他赛及其中间体1-4、10-DAB各10mg，作为定性对照溶液。

分别取空白溶液和供试品溶液，按照上述条件进行HPLC分析并记录色谱图，结果见图1。分别取卡巴他赛及其中间体1-4、10-DAB的定性对照溶液，按照上述条件进行HPLC分析并记录色谱图。

图1中，卡巴他赛具有保留时间为11.6min左右的色谱峰，10-DAB具有保留时间为3.4min的色谱峰，卡巴他赛4个中间体分别具有保留时间为15.1min（中间体3）、23.9min（中间体1）、24.6min（中间体4）和40.5min（中间体2）的色谱峰。结果表明，在实施例1的条件下，卡巴他赛及其中间体、10-DAB的色谱峰分离度良好（分离度均大于1.5），样品的检测限度最低可达到100ng/mL，该检测方法可用于卡巴他赛的合成反应监控及其质量控制。

实施例2

采用与实施例1类似的实验材料与仪器条件和实验步骤进行实验，其中流动相替代为水-乙腈梯度洗脱，其梯度比如表2。

表2

在色谱图中，卡巴他赛具有保留时间为10.4min左右的色谱峰，10-DAB具有保留时间为3.0min的色谱峰，卡巴他赛4个中间体分别具有保留时间为14.4min（中间体3）、22.1min（中间体1）、23.5min（中间体4）和39.3min（中间体2）的色谱峰。结果表明，在实施例2的条件下，卡巴他赛及其中间体、10-DAB的色谱峰分离度良好（分离度均大于1.5），该检测方法可用于卡巴他赛的合成反应监控及其质量控制。

实施例3

采用与实施例1类似的实验材料与仪器条件和实验步骤进行实验，其中流动相替代为水-乙腈梯度洗脱，其梯度比如表3。

表3

在色谱图中，卡巴他赛具有保留时间为11.7min左右的色谱峰，10-DAB具有保留时间为4.4min的色谱峰，卡巴他赛4个中间体分别具有保留时间为15.3min（中间体3）、24.1min（中间体1）、25.6min（中间体4）和41.3min（中间体2）的色谱峰。结果表明，在实施例3的条件下，卡巴他赛及其中间体、10-DAB的色谱峰分离度良好（分离度均大于1.5），该检测方法可用于卡巴他赛的合成反应监控及其质量控制。

实施例4

采用与实施例1类似的实验材料与仪器条件和实验步骤进行实验，其中流动相替代为磷酸氢二钠缓冲溶液（pH7.0，0.025mol/L）-乙腈梯度洗脱，其梯度比如表4。其HPLC分析色谱图见图2。

表4

图2中，卡巴他赛具有保留时间为11.7min左右的色谱峰，10-DAB具有保留时间为4.4min的色谱峰，卡巴他赛4个中间体分别具有保留时间为15.3min（中间体3）、24.1min（中间体1）、25.6min（中间体4）和41.3min（中间体2）的色谱峰。结果表明，在实施例4的条件下，卡巴他赛及其中间体、10-DAB的色谱峰分离度良好（分离度均大于1.5），该检测方法可用于卡巴他赛的合成反应监控及其质量控制。

实施例5

按照专利公开号CN102417491A合成卡巴他赛。精密称取卡巴他赛合成品（批号20121211）10mg，置于10mL量瓶中，先加入5mL的乙腈溶解再加入流动相定容至刻度，摇匀，作为供试溶液。取各供试品溶液，按照实施例1中的色谱条件进行HPLC分析，并调节检测灵敏度，使供试品溶液中卡巴他赛的峰高约为满量程的20%、单个杂质的峰面积不得大于主峰峰面积的一半、杂质峰面积总和不得大于主峰面积，记录色谱图，结果见图3。样品中单个最大杂质含量为0.44%，总杂质含量为0.88%。结果表明，卡巴他赛合成品的有关物质符合质量标准要求，可用于卡巴他赛原料及制剂的有关物质检测和控制。

实施例6

采用与实施例5相同的方法和步骤，检测2批卡巴他赛合成品（批号20121213、20121215）的质量。两批样品中单个最大杂质含量分别为0.42%和0.42%，总杂质含量分别为0.86%和0.86%。结果表明，卡巴他赛合成品的有关物质符合质量标准要求，可用于卡巴他赛原料及制剂的有关物质检测和控制。

Claims

1.一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于，选用十八烷基键合硅胶色谱柱，以水相-乙腈为流动相进行梯度洗脱，检测波长为220-240nm，其中所述水相选自水，或浓度为0.01mol/L～0.05mol/L的pH为6.0～7.0的磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸氢二钾缓冲溶液、磷酸氢二钠缓冲溶液中的任意一种或其任意混合物，所述十八烷基键合硅胶色谱柱填料的颗粒度为3-5μm，并且当所述水相-有机相是水-乙腈时，所述水-乙腈梯度洗脱的条件为：0min，35％-45％：65％-55％；30min，15％：85％；50min，0％-10％：100％-90％；55min，15％：85％；和60min，35％-45％：65％-55％；当所述水相-有机相是磷酸盐缓冲溶液-乙腈时，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0、浓度为0.025mol/L，梯度洗脱的条件为：0min，50％：50％；30min，15％：85％；50min，0％：100％；55min，15％：85％；和60min，50％：50％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十八烷基键合硅胶色谱柱填料的颗粒度为5μm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测波长为230nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水-乙腈梯度洗脱的条件为：0min，40％：60％；30min，15％：85％；50min，0％：100％；55min，15％：85％；和60min，40％：60％。

5.一种用HPLC法测定卡巴他赛有关物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

b.取供试品溶液，采用HPLC法测定卡巴他赛有关物质，调节检测灵敏度使供试品溶液中卡巴他赛的峰高约为满量程的20％、单个杂质的峰面积不得大于主峰峰面积的一半、杂质峰面积总和不得大于主峰面积，其中采用十八烷基键合硅胶色谱柱，以水-乙腈为流动相进行梯度洗脱，水-乙腈梯度洗脱的条件为：0min，40％：60％；30min，15％：85％；50min，0％：100％；55min，15％：85％；和60min，40％：60％，柱填料的颗粒度为5μm，检测波长为230nm。