CN111007191B - 磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的含量、其有关物质的检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的含量、其有关物质的检测方法和应用。所述检测方法，包括如下步骤：采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；所述高效液相色谱检测的条件包括：检测波长：238～242nm；流动相A：乙腈、水和三乙胺的混合物，调节混合物pH至5.8～6.0；流动相B：乙腈；所述流动相A中，调节pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为(150～160)﹕(839～849)﹕1；采用所述流动相A和流动相B进行梯度洗脱。本发明在保证有关物质与有效成分高效分离的基础上，具有良好的专属性、耐用性、重复性与准确度，能实现对含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其是涉及一种磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的含量、其有关物质的检测方法和应用。
背景技术
口服药物不纯，可能增加不良反应的发生率，如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等。同时，可能影响药物的吸收，从而影响药物疗效。因此，药物纯度的检测方法就显得尤为重要，有关物质(Telated substances)是指在原料药生产中带入的起始物料、试剂、中间体、副产物等物质，也可能是制剂在生产、储藏和运输过程中产生的降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。有关物质的种类与药物的合成路线和生产工艺密切相关，不同的合成路线和生产工艺，药品的杂质谱也会发生变化，因此，需要根据不同的合成路线和生产工艺建立合适的分析方法，达到对药物有关物质准确、有效的检测和监控。
目前，对于药物纯度的检测方法有多种，其中，有关物质检测是控制药品质量的重要指标。
对于磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及其相关制剂，中国药典2015版收载情况为：磺胺甲噁唑原料及片剂、甲氧苄啶及片剂、甲氧苄啶注射液，复方磺胺甲噁唑片、复方磺胺甲噁唑颗粒、磺胺甲噁唑胶囊、磺胺甲噁唑注射液、磺胺甲噁唑口服混悬液、小儿复方磺胺甲噁唑片及小儿复方磺胺甲噁唑颗粒。欧洲药典收载了磺胺甲噁唑原料和甲氧苄啶原料，但无相关制剂研究。收载于美国药典42版的磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的复方制剂主要有复方磺胺甲噁唑注射液(Sulfamethoxazole and Trimethoprim Injection)、复方磺胺甲噁唑口服混悬液(Sulfamethoxazole and Trimethoprim Oral Suspension)及复方磺胺甲噁唑片(Sulfamethoxazole and Trimethoprim Tablets)。然而，对于磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及其相关制剂的有关物质研究，现有标准在重要参数质量控制上均存在显著缺陷：
对于磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及其相关制剂，现行中国药典及其它各国药典，在有关物质控制上：或不予控制，或采用薄层法(TLC)及高效液相法分析检测方法，分别研究单个杂质或其他总杂。
中国药典2015版质量标准，在有关物质控制上：磺胺甲噁唑原料、磺胺甲噁唑片、复方磺胺甲噁唑胶囊，采用薄层法(TLC)控制有关物质；甲氧苄啶片无杂质研究项；甲氧苄啶及甲氧苄啶注射液采用高效液相法，采用等度洗脱，研究单个杂质和其他总杂；其他磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的复方制剂无杂质研究项。
美国药典42版，在有关物质控制上：复方磺胺甲噁唑注射液(Sulfamethoxazoleand Trimethoprim Injection)采用薄层法(TLC)控制杂质；复方磺胺甲噁唑片(Sulfamethoxazole and Trimethoprim Tablets)无有关物质研究项；复方磺胺甲噁唑口服混悬液(Sulfamethoxazole and Trimethoprim Oral Suspension)中采用梯度洗脱，该法检测杂质较少。
在检测体系中，薄层法(TLC)检测有关物质灵敏度低、重现性差、专属性不强，不适合多种杂质的准确定量，现在已经很少使用薄层色谱法，该法主要用于鉴定，对于需要定量的杂质现在主要使用高效液相法(HPLC)；中国药典2015版采用高效液相法检测，只研究单个杂质和其他总杂，没有对特定杂质进行研究，杂质研究种类不完整；现行美国药典42版，规定了液相法对其梯度洗脱的条件，但该方法不利于杂质洗脱，检测杂质较少；欧洲药典(同英国药典)用3种液相方法分别控制不同的杂质，相互独立，操作麻烦，并且使用了离子对试剂，容易损耗色谱柱，同时流动相体系不容易稳定，不便于对磺胺甲噁唑和甲氧苄啶复方制剂的杂质控制。
综上所述，现有技术在针对磺胺甲噁唑原料及其制剂、甲氧苄啶原料及其制剂，以及磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的复方制剂的质量控制方面存在诸多缺陷和不足。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的有关物质的检测方法，该检测方法在保证各有关物质与有效成分高效分离的基础上，使其具有良好的专属性、重复性与准确度，从而更好地实现对磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶及相关制剂的质量控制。
本发明的第二目的在于提供磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的含量的检测方法，能够实现对磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的高效、准确的定量检测。
本发明的第三目的在于提供所述检测方法在含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂的质量控制中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的有关物质的检测方法，包括如下步骤：
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；
所述高效液相色谱检测的条件包括：
检测波长：238～242nm；
流动相A：乙腈、水和三乙胺的混合物，调节混合物pH至5.8～6.0；流动相B：乙腈；
所述流动相A中，调节pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为(150～160)﹕(839～849)﹕1；
采用所述流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的过程包括：0～10min内，流动相A和流动相B的体积比为100﹕0；10～15min内，流动相A和流动相B的体积比从100﹕0变至94﹕6；15～20min内，流动相A和流动相B的体积比从94﹕6变至85﹕15；20～30min内，流动相A和流动相B的体积比从85﹕15变至75﹕25；30～40min内，流动相A和流动相B的体积比从75﹕25变至70﹕30；40～50min内，流动相A和流动相B的体积比为70﹕30；50min～50.1min内，流动相A和流动相B的体积比从70:30变至100﹕0；50.1min～60min内，流动相A和流动相B的体积比为100﹕0。
本发明的检测方法，在同一色谱条件下，可以同时检测出磺胺甲噁唑和甲氧苄啶中的8种杂质，这些杂质之间、杂质与主峰之间的分离度均符合要求，可用于磺胺甲噁唑原料及制剂、甲氧苄啶原料及制剂的有关物质检测。
在本发明一具体实施方式中，所述有关物质包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ，其结构式分别如下：
其中，有关物质Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ均为磺胺甲噁唑的降解杂质，分别为磺胺甲噁唑杂质C、磺胺甲噁唑杂质D和磺胺甲噁唑杂质E，有关物质Ⅳ为磺胺甲噁唑的工艺杂质，也就是磺胺甲噁唑杂质F。有关物质Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ均为甲氧苄啶的工艺杂质，分别为甲氧苄啶杂质B、甲氧苄啶杂质C和二甲氧苄啶。有关物质Ⅷ为磺胺甲噁唑杂质B。
本发明通过对检测条件的调控，能够一次性高效的分离检测出上述8种磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的有关物质。
如在不同实施方式中，所述检测波长可以为238nm、239nm、240nm、241nm、242nm等等，优选为240nm。
在本发明一具体实施方式中，所述流动相A的配制包括：水、三乙胺和乙腈混匀后，采用pH调节剂调节混合体系的pH至5.8～6.0范围内。其中，所述pH调节剂可以为氢氧化钠水溶液(0.1mol/L或1mol/L)或冰醋酸。在一优选实施方式中，采用pH调节剂调节混合体系的pH至5.9。通常先采用冰醋酸调节，当调过后，采用氢氧化钠水溶液回调。
如在不同实施方式中，所述流动相A中，在采用pH调节剂调剂pH前，以1000mL计，对应1mL的三乙胺，水的体积可以为839mL、840mL、841mL、842mL、843mL、844mL、845mL、846mL、847mL、848mL、849mL等等；乙腈的体积可以为160mL、159mL、158mL、157mL、156mL、155mL、154mL、153mL、152mL、151mL、150mL等等。
在本发明一优选实施方式中，所述流动相A中，调节pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为155﹕844﹕1。采用该条件下的流动相A，能够进一步提高各个杂质之间、杂质与主峰之间的分离度，提高检测准确性。
在本发明一优选实施方式中，所述梯度洗脱的流速为0.8～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。
如在不同实施方式中，所述梯度洗脱的流速可以为0.8mL/min、0.85mL/min、0.9mL/min、0.95mL/min、1.0mL/min、1.05mL/min、1.1mL/min、1.15mL/min、1.2mL/min等等。
在本发明一优选实施方式中，所述高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱、苯基柱、C8柱，优选为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。如可以为C18柱，Agilent5HC C18(4.6mm×25cm，5μm)，也可以为Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm)或者是ACEExcel 5super C18(250×4.6mm，5μm)。
在本发明一优选实施方式中，所述色谱柱的柱温为25～35℃，优选为30℃。
如在不同实施方式中，所述色谱柱的柱温可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等等。
在具体实施的方式中，检测时，进样量可以为10～20μL，如可以为10μL、12μL、14μL、16μL、18μL、20μL等等，优选为20μL。
在本发明一优选实施方式中，所述高效液相色谱检测的条件包括：
检测波长：240nm；
流动相A：乙腈、水和三乙胺的混合物，调节混合物pH至5.9；流动相B：乙腈；采用所述流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A中，调节pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为155﹕844﹕1；
所述梯度洗脱的流速为1.0mL/min；
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述色谱柱的柱温为30℃。
在本发明一优选实施方式中，将同体积的供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，根据高效液相色谱检测结果分析有关物质。
在本发明一优选实施方式中，将同体积的供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，采用外标法对供试品溶液中的有关物质进行计算。
在本发明一具体实施方式中，所述对照品溶液中包括有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ以及磺胺甲噁唑和甲氧苄啶。采用流动相A溶解各有关物质对照品以及磺胺甲噁唑和甲氧苄啶对照品，作为混合对照品溶液。其中，所述对照品溶液中，有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ的浓度分别为0.2μg/mL、0.2μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.3μg/mL和10μg/mL，磺胺甲噁唑的浓度为0.1mg/mL，甲氧苄啶的浓度为0.02mg/mL。
在本发明一具体实施方式中，所述供试品选自含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂。如可以为含磺胺甲噁唑的原料、含甲氧苄啶的原料、含磺胺甲噁唑的制剂、含甲氧苄啶的制剂、含磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的原料、含磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的制剂。优选的，所述供试品为复方磺胺甲噁唑制剂，可以为片剂、颗粒剂、注射剂、混悬剂、胶囊剂等等。
在本发明一具体实施方式中，所述供试品溶液的制备方法包括：采用流动相A溶解所述供试品，过滤取续滤液作为供试品溶液。其中，所述供试品溶液中，磺胺甲噁唑的浓度可以为1.0mg/mL，甲氧苄啶的浓度可以为0.2mg/mL。具体操作时，供试品溶液中主成分的浓度不局限于此，只要满足其浓度×进样体积＞各杂质的定量限即可。
本发明还提供了磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的含量的检测方法，包括如下步骤：
将同体积的供试品溶液、磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶对照品溶液分别在高效液相色谱仪上进行检测后，采用外标法对供试品溶液中的磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶进行计算；高效液相色谱的检测条件包括：检测波长：238～242nm；
流动相A：乙腈、水和三乙胺的混合物，调节混合物pH至5.8～6.0；流动相B：乙腈；
所述流动相A中，调节pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为(150～160)﹕(839～849)﹕1；
采用所述流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的过程包括：0～10min内，流动相A和流动相B的体积比为100﹕0；10～15min内，流动相A和流动相B的体积比从100﹕0变至94﹕6；15～20min内，流动相A和流动相B的体积比从94﹕6变至85﹕15；20～30min内，流动相A和流动相B的体积比从85﹕15变至75﹕25；30～40min内，流动相A和流动相B的体积比从75﹕25变至70﹕30；40～50min内，流动相A和流动相B的体积比为70﹕30；50min～50.1min内，流动相A和流动相B的体积比从70:30变至100﹕0；50.1min～60min内，流动相A和流动相B的体积比为100﹕0。
其余色谱条件同上述有关物质的检测方法。
本发明的检测条件，能够将磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的有关物质在同一色谱条件中进行有效的分离及检测，同时还可对磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的含量进行检测。
本发明还提供了上述磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的有关物质的检测方法在含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂的质量控制中的应用。
本发明的检测方法，在保证各有关物质与有效成分高效分离的基础上，使其具有良好的专属性、重复性与准确度，更好地实现对含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂的质量控制。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的检测方法，在保证各有关物质与有效成分高效分离的基础上，使其具有良好的专属性、耐用性、重复性与准确度，从而更好地实现对含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂的质量控制；
(2)本发明通过调控色谱条件等，可实现一次性高效的分离出8种磺酸甲噁唑和甲氧苄啶的有关物质，建立了含磺胺甲噁唑和/或甲氧苄啶的原料或制剂，尤其是复方磺胺甲噁唑中有关物质的研究方法，可以满足一致性评价的对于有关物质的控制要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的混合对照品溶液的色谱图；
图2为本发明实施例1提供的复方磺胺甲噁唑片的供试品溶液的色谱图；
图3为本发明实施例2提供的混合对照品溶液的色谱图；
图4为本发明实施例2提供的复方磺胺甲噁唑片的供试品溶液的色谱图；
图5为本发明实施例3提供的混合对照品溶液的色谱图；
图6为本发明实施例3提供的复方磺胺甲噁唑片的供试品溶液的色谱图；
图7为本发明实施例4提供的混合对照品溶液的色谱图；
图8为本发明实施例4提供的复方磺胺甲噁唑片的供试品溶液的色谱图；
图9为本发明实施例5提供的混合对照品溶液的色谱图；
图10为本发明实施例5提供的复方磺胺甲噁唑片的供试品溶液的色谱图；
图11为本发明实验例2中样品破坏结果；
图12为本发明实验例2中磺胺甲噁唑原料破坏结果；
图13为本发明实验例2中磺胺甲噁唑原料破坏结果(接图12)；
图14为本发明实验例2中甲氧苄啶原料破坏结果；
图15为本发明实验例2中甲氧苄啶原料破坏结果(接图14)；
图16为比较例1中采用EP9.0磺胺甲噁唑方法测试有关物质结果；
图17为比较例1中采用EP9.0甲氧苄啶方法测试有关物质结果；
图18为比较例2中采用ChP2015甲氧苄啶有关物质检测方法的测试结果；
图19为比较例3中检测结果，从上至下分别为磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、甲氧苄啶杂质C、磺胺甲噁唑杂质F、甲氧苄啶杂质B；
图20为比较例3中检测结果，从上至下分别为甲氧苄啶和磺胺甲噁唑；
图21为比较例4中采用本发明实施例1的检测方法的检测结果，从上至下分别为混合杂质、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶；
图22为比较例4中采用比较例4的检测方法的检测结果，从上至下分别为混合杂质、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶；
图23为比较例4中采用本发明实施例1和比较例4的检测方法对磺胺甲噁唑和甲氧苄啶混合氧化破坏溶液进行检测的结果，条件1对应实施例1的检测条件，条件2对应比较例4的检测条件。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
具体实施方式中的对专属性、耐用性、线性、准确度、溶液稳定性、重复性、精密度、中间精密度、定量限、检测限等项目的验证，按照《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》、《化学药物质量标准建立的规范化过程技术指导原则》、《化学药物杂质研究技术指导原则》、《化学药物残留溶剂研究技术指导原则》以及现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。
各实施例和比较例采用的复方磺胺甲噁唑片是由磺胺甲噁唑与甲氧苄啶组成的复方制剂，20180410批样品，厂家：北京振东光明药物研究院有限公司。该复方制剂含磺胺甲噁唑400mg，甲氧苄啶80mg，辅料+主药理论片重为530mg，其余均为辅料，主辅料种类如下。
磺胺甲噁唑，主药，寿光富康制药有限公司；
甲氧苄啶，主药，寿光富康制药有限公司；
预胶化淀粉，填充剂，美国卡乐康；
多库酯钠，润湿剂，东莞市东岳葡萄糖厂有限公司；
苯甲酸钠，润湿剂，武汉有机实业有限公司；
羧甲基淀粉钠，崩解剂，永日化学工业股份有限公司；
硬脂酸镁，润滑剂，安徽山河药用辅料股份有限公司。
实施例1
本实施例提供了磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的有关物质的检测方法，包括如下步骤：
(1)混合对照品溶液和供试品溶液
混合对照品溶液的制备：取有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ(也就是磺胺甲噁唑杂质C、D、E和F)、有关物质Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ(也就是甲氧苄啶杂质B、C和二甲氧苄啶)、甲氧苄啶和磺胺甲噁唑对照品各适量，加流动相A溶解并稀释制成每lmL中约含有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各0.2μg，有关物质Ⅳ0.1μg，有关物质Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ各0.3μg，甲氧苄啶0.02mg，磺胺甲噁唑0.1mg的溶液，作为混合对照品溶液；取有关物质Ⅷ(也就是磺胺甲噁唑杂质B)对照品，加流动相A溶解并稀释制成每1mL中约含有关物质Ⅷ10μg的溶液，作为磺胺甲噁唑杂质B对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取本品(20180410批样品)细粉适量(约相当于磺胺甲噁唑50mg)，置50mL量瓶中，加流动相A适量，超声15min使两主成分溶解，用流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
(2)高效液相色谱检测条件
仪器：waters e2695高效液相色谱仪，2998PDA检测器，检测波长：240nm；
色谱柱：Agilent 5HC C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；
流动相：流动相A和流动相B；
其中，流动相A的配制包括：取水844mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈155mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至5.9；流动相B为乙腈；
流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；按梯度表1进行线性梯度洗脱。
表1梯度洗脱程序表(体积比)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 10 | 100 | 0 |
| 15 | 94 | 6 |
| 20 | 85 | 15 |
| 30 | 75 | 25 |
| 40 | 70 | 30 |
| 50 | 70 | 30 |
| 50.1 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
(3)检测步骤
分别精密量取混合对照品溶液、磺胺甲噁唑杂质B对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按照步骤(2)中的条件进行检测，记录色谱图，见图1和图2。在图1中，各峰依次为有关物质Ⅱ(磺胺甲噁唑杂质D，2.936min)、有关物质Ⅲ(磺胺甲噁唑杂质E，4.440min)、有关物质Ⅰ(磺胺甲噁唑杂质C，4.903min)、有关物质Ⅳ(磺胺甲噁唑杂质F，5.630min)、有关物质Ⅵ(甲氧苄啶杂质C，6.392min)、有关物质Ⅶ(二甲氧苄啶，8.600min)、甲氧苄啶(11.052min)、磺胺甲噁唑(18.665min)、有关物质Ⅴ(甲氧苄啶杂质B，22.708min)、有关物质Ⅷ(磺胺甲噁唑杂质B，26.487min)，各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度良好，具体见表2。
表2各成分之间的分离数据
| 化合物 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.936 | / | 13892 | 1.03 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.440 | 13.63 | 20130 | 1.20 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 4.903 | 3.60 | 20222 | 1.28 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.630 | 5.04 | 22136 | 1.21 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.392 | 4.48 | 18514 | 1.08 |
| 二甲氧苄啶 | 8.600 | 10.43 | 21039 | 1.09 |
| 甲氧苄啶 | 11.052 | 9.14 | 21753 | 1.09 |
| 磺胺甲噁唑 | 18.665 | 24.87 | 51968 | 0.77 |
| 甲氧苄啶杂质B | 22.708 | 16.36 | 258127 | 1.01 |
实施例2
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)中，流动相A的配制包括：取水839mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈160mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至5.9。
分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，检测记录色谱图，见图3和图4。结果表明，更换流动相配比至本实施例，各峰之间的分离度均符合要求，方法耐用性良好。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表3。
表3各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 3.012 | / | 4663 | 1.05 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.573 | 9.06 | 11383 | 1.09 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 5.067 | 2.92 | 14178 | 1.10 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.947 | 4.84 | 14544 | 1.07 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.877 | 4.44 | 14929 | 1.05 |
| 二甲氧苄啶 | 9.376 | 10.00 | 18372 | 1.05 |
| 甲氧苄啶 | 12.160 | 8.96 | 19586 | 1.08 |
| 磺胺甲噁唑 | 19.619 | 21.79 | 50036 | 0.81 |
| 甲氧苄啶杂质B | 23.571 | 14.48 | 206041 | 1.04 |
实施例3
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)中，流动相A的配制包括：取水849mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈150mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至5.9。
分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，检测记录色谱图，见图5和图6。结果表明，更换流动相配比至本实施例，各峰之间的分离度均符合要求，方法耐用性良好。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表4。
表4各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 3.068 | / | 4909 | 1.03 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.733 | 9.70 | 12268 | 1.08 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 5.297 | 3.30 | 14933 | 1.08 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 6.620 | 7.02 | 16644 | 1.11 |
| 甲氧苄啶杂质C | 7.911 | 5.76 | 16574 | 1.05 |
| 二甲氧苄啶 | 11.125 | 11.60 | 20354 | 1.02 |
| 甲氧苄啶 | 14.792 | 10.24 | 21045 | 1.06 |
| 磺胺甲噁唑 | 20.692 | 16.50 | 66852 | 0.81 |
| 甲氧苄啶杂质B | 24.473 | 14.67 | 226419 | 1.02 |
实施例4
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)中，流动相A的配制包括：取水844mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈155mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至5.8。
分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，检测记录色谱图，见图7和图8。结果表明，调整流动相pH至本实施例，各峰之间的分离度均符合要求，方法耐用性良好。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表5。
表5各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 3.017 | / | 6113 | 1.16 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.646 | 9.85 | 10636 | 1.10 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 5.201 | 3.10 | 13253 | 1.12 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 6.675 | 7.29 | 13979 | 1.08 |
| 甲氧苄啶杂质C | 7.355 | 2.91 | 14393 | 1.08 |
| 二甲氧苄啶 | 10.150 | 10.34 | 18299 | 1.06 |
| 甲氧苄啶 | 13.409 | 9.58 | 19416 | 1.13 |
| 磺胺甲噁唑 | 19.056 | 19.29 | 139377 | 0.95 |
| 甲氧苄啶杂质B | 20.645 | 7.84 | 165384 | 1.12 |
实施例5
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)中，流动相A的配制包括：取水844mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈155mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至6.0。
分别精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，检测记录色谱图，见图9和图10。结果表明，调整流动相pH至本实施例，各峰之间的分离度均符合要求，方法耐用性良好。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表6。
表6各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.988 | / | 5952 | 1.16 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.557 | 9.50 | 10317 | 1.11 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 5.070 | 2.85 | 12183 | 1.01 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 6.047 | 5.02 | 13219 | 1.08 |
| 甲氧苄啶杂质C | 7.230 | 5.30 | 14427 | 1.08 |
| 二甲氧苄啶 | 10.067 | 10.62 | 18301 | 1.07 |
| 甲氧苄啶 | 13.220 | 9.46 | 19906 | 1.06 |
| 磺胺甲噁唑 | 19.324 | 16.80 | 43163 | 0.77 |
| 甲氧苄啶杂质B | 23.786 | 16.16 | 228209 | 0.99 |
下述实施例为通过改变流速(±0.2mL/min)、柱温(±5℃)、不同厂家色谱柱(至少3根不同品牌)等条件，考察测定结果不受影响的承受程度。通过各杂质之间的分离度来衡量。
实施例6
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为25℃。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表7。
表7各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.947 | / | 11986 | 1.05 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.611 | 14.01 | 18502 | 1.21 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 5.006 | 2.90 | 22155 | 0.87 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.919 | 5.87 | 20255 | 1.16 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.425 | 2.78 | 17519 | 1.18 |
| 二甲氧苄啶 | 8.757 | 10.57 | 19318 | 1.10 |
| 甲氧苄啶 | 11.201 | 8.69 | 20068 | 1.14 |
| 磺胺甲噁唑 | 20.157 | 29.58 | 71560 | 0.82 |
| 甲氧苄啶杂质B | 23.095 | 12.37 | 230471 | 1.21 |
实施例7
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，柱温为35℃。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表8。
表8各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.913 | / | 13222 | 1.02 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.280 | 12.55 | 19763 | 1.22 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 4.805 | 4.35 | 25787 | 1.29 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.392 | 4.33 | 21535 | 1.12 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.409 | 6.21 | 20103 | 1.11 |
| 二甲氧苄啶 | 8.596 | 10.77 | 22092 | 1.14 |
| 甲氧苄啶 | 11.091 | 9.66 | 23114 | 1.05 |
| 磺胺甲噁唑 | 17.129 | 19.4 | 28841 | 0.74 |
| 甲氧苄啶杂质B | 22.362 | 20.58 | 253190 | 1.04 |
实施例8
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，流速为0.8mL/min。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表9。
表9各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 3.650 | / | 14697 | 0.99 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 5.527 | 6.59 | 20968 | 1.16 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 6.108 | 3.79 | 20620 | 1.18 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 6.997 | 5.05 | 18795 | 1.05 |
| 甲氧苄啶杂质C | 7.943 | 4.63 | 21724 | 1.08 |
| 二甲氧苄啶 | 10.697 | 11.26 | 23730 | 1.07 |
| 甲氧苄啶 | 13.741 | 9.69 | 23925 | 1.09 |
| 磺胺甲噁唑 | 21.630 | 24.44 | 79896 | 0.76 |
| 甲氧苄啶杂质B | 24.851 | 13.55 | 306186 | 1.02 |
实施例9
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，流速为1.2mL/min。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表10。
表10各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.49 | 10.39 | 7399 | 1.21 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 3.79 | 2.95 | 12733 | 1.14 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 4.18 | 4.67 | 15841 | 1.21 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 4.88 | 4.13 | 13595 | 1.12 |
| 甲氧苄啶杂质C | 5.61 | 9.70 | 14676 | 1.11 |
| 二甲氧苄啶 | 7.64 | 8.57 | 17000 | 1.10 |
| 甲氧苄啶 | 9.88 | 22.68 | 18664 | 1.10 |
| 磺胺甲噁唑 | 16.88 | 18.61 | 41848 | 0.74 |
| 甲氧苄啶杂质B | 21.55 | / | 247478 | 1.02 |
实施例10
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，检测波长为238nm。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表11。
表11各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.934 | / | 13144 | 1.02 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.435 | 13.39 | 19382 | 1.22 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 4.901 | 3.62 | 20750 | 1.34 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.623 | 4.99 | 22811 | 1.26 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.390 | 4.52 | 18293 | 1.16 |
| 二甲氧苄啶 | 8.606 | 10.57 | 21767 | 1.07 |
| 甲氧苄啶 | 11.056 | 9.19 | 21860 | 1.09 |
| 磺胺甲噁唑 | 18.631 | 24.85 | 52681 | 0.77 |
| 甲氧苄啶杂质B | 22.707 | 16.53 | 274083 | 1.00 |
实施例11
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，检测波长为242nm。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表12。
表12各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.934 | / | 13363 | 1.11 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.435 | 13.46 | 19475 | 1.21 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 4.902 | 3.65 | 20824 | 1.28 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.626 | 4.98 | 21761 | 1.18 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.390 | 4.48 | 18519 | 1.14 |
| 二甲氧苄啶 | 8.607 | 10.58 | 21146 | 1.07 |
| 甲氧苄啶 | 11.056 | 9.18 | 21854 | 1.09 |
| 磺胺甲噁唑 | 18.631 | 24.85 | 52687 | 0.77 |
| 甲氧苄啶杂质B | 22.707 | 16.55 | 272167 | 0.99 |
实施例12
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，色谱柱为Kromasil 100-5-C18(4.6×250mm，5μm)。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表13。
表13各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.566 | / | 3606 | 1.25 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 4.290 | 9.06 | 6451 | 1.16 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 4.798 | 2.41 | 8128 | 1.15 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 5.796 | 4.22 | 7580 | 1.09 |
| 甲氧苄啶杂质C | 6.409 | 2.15 | 6918 | 1.12 |
| 二甲氧苄啶 | 8.745 | 6.63 | 7622 | 1.10 |
| 甲氧苄啶 | 11.481 | 5.97 | 7730 | 1.25 |
| 磺胺甲噁唑 | 20.608 | 19.44 | 38039 | 1.40 |
| 甲氧苄啶杂质B | 23.337 | 7.80 | 112047 | 1.06 |
实施例13
本实施例参考实施例1的检测方法，区别仅在于：步骤(2)的高效液相色谱检测条件中，色谱柱为ACE Excel 5super C18(250×4.6mm，5μm)。各杂质之间、杂质与主成分之间、磺胺甲噁唑与甲氧苄啶之间分离度见表14。
表14各成分之间的分离数据
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 理论塔板数 | 拖尾因子 |
| 磺胺甲噁唑杂质D | 2.930 | / | 5443 | 1.07 |
| 磺胺甲噁唑杂质E | 5.045 | 12.23 | 11278 | 1.05 |
| 磺胺甲噁唑杂质C | 5.589 | 2.87 | 13610 | 1.03 |
| 磺胺甲噁唑杂质F | 7.345 | 8.51 | 18039 | 0.86 |
| 甲氧苄啶杂质C | 7.613 | 1.13 | 14808 | 1.22 |
| 二甲氧苄啶 | 10.745 | 10.56 | 15592 | 1.06 |
| 甲氧苄啶 | 14.127 | 8.75 | 16847 | 1.1 |
| 磺胺甲噁唑 | 22.929 | 24.84 | 107748 | 0.89 |
| 甲氧苄啶杂质B | 25.040 | 8.50 | 206512 | 1.06 |
实施例14
本实施例提供了磺胺甲噁唑的含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)称取11.56mg磺胺甲噁唑，溶解于10mL流动相A中，得到储备液；其中，流动相A的配制包括：取水844mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈155mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至5.9；
将储备液采用流动相A稀释，分别得到浓度为0.00001mg/mL、0.0006mg/mL、0.0012mg/mL、0.0035mg/mL、0.0058mg/mL、0.0087mg/mL、0.0115mg/mL(定量限浓度～1.0％浓度)的浓度的磺胺甲噁唑的系列浓度溶液；
(2)分别精密量取上述系列浓度溶液各20μL，注入液相色谱仪，按照实施例1中步骤(2)中的条件进行检测，记录色谱图；测试结果见表15，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，得到线性回归方程。
表15磺胺甲噁唑的线性测试结果
实施例15
本实施例提供了甲氧苄啶的含量的检测方法，包括如下步骤：
(1)称取10.02mg甲氧苄啶，溶解于50mL流动相A中，得到储备液；其中，流动相A的配制包括：取水844mL与1mL三乙胺混匀，加入乙腈155mL，采用氢氧化钠水溶液或冰醋酸调节pH至5.9；
将储备液采用流动相A稀释，分别得到浓度为0.000038mg/mL、0.0001mg/mL、0.0002mg/mL、0.0006mg/mL、0.0010mg/mL、0.0015mg/mL、0.0020mg/mL(定量限浓度～1.0％浓度)的浓度的甲氧苄啶的系列浓度溶液；
(2)分别精密量取上述系列浓度溶液各20μL，注入液相色谱仪，按照实施例1中步骤(2)中的条件进行检测，记录色谱图；测试结果见表16，以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，得到线性回归方程。
表16甲氧苄啶的线性测试结果
实验例1
定量限与检测限
分别取磺胺甲噁唑、甲氧苄啶及各杂质对照品储备液逐步稀释，制备定量限和检测限溶液，当信噪比S/N约为10时，作为定量限溶液；当信噪比S/N约为3时，作为检测限溶液；具体检测限溶液稀释过程及检测结果、定量限溶液稀释过程及检测结果分别见表17和18。
表17检测限溶液稀释过程及检测结果
其中，以磺胺甲噁唑杂质D为例对其稀释方法进行说明：0.1mL→100mL，0.3mL→10mL是指，取0.1mL起始浓度为0.3885mg/mL的磺胺甲噁唑杂质D储备液，稀释至100mL；再取稀释后的溶液0.3mL，稀释至10mL，得到检测限溶液。下表18中的定量限溶液稀释过程同理。其中，溶解及稀释采用的溶剂均采用实施例1中的流动相A。
表18定量限溶液稀释过程及检测结果
分别取上述磺胺甲噁唑杂质C、磺胺甲噁唑杂质D、磺胺甲噁唑杂质E、磺胺甲噁唑杂质F、甲氧苄啶杂质B、甲氧苄啶杂质C、二甲氧苄啶、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑的定量限溶液，采用实施例1的色谱条件连续进样6次，测试结果见表19-27。从表中可知，各个杂质及两个主峰的定量限溶液连续进样6次，峰面积RSD均小于15.0％，保留时间RSD均小于1.0％，相对供试品百分浓度均远远小于0.1％，灵敏度符合要求。
表19磺胺甲噁唑杂质C定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1234 | 1226 | 1203 | 1223 | 1235 | 1195 | 1219 | 1.36 |
| 保留时间(min) | 5.123 | 5.124 | 5.125 | 5.124 | 5.126 | 5.124 | 5.124 | 0.02 |
| S/N | 15.41 | 14.56 | 14.89 | 13.60 | 14.05 | 14.76 | 14.55 | 4.40 |
表20磺胺甲噁唑杂质D定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD |
| 峰面积 | 1690 | 1738 | 1730 | 1723 | 1688 | 1614 | 1697 | 2.70 |
| 保留时间(min) | 2.987 | 2.989 | 2.989 | 2.988 | 2.986 | 2.985 | 2.987 | 0.05 |
| S/N | 12.43 | 11.77 | 12.13 | 11.89 | 12.36 | 11.88 | 12.08 | 2.27 |
表21磺胺甲噁唑杂质E定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1047 | 1045 | 1069 | 1066 | 1041 | 1073 | 1057 | 1.33 |
| 保留时间(min) | 4.599 | 4.600 | 4.599 | 4.600 | 4.600 | 4.600 | 4.600 | 0.01 |
| S/N | 13.48 | 13.06 | 13.33 | 12.15 | 12.20 | 13.52 | 12.96 | 4.84 |
表22磺胺甲噁唑杂质F定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1128 | 1096 | 1127 | 1159 | 1156 | 1162 | 1138 | 2.27 |
| 保留时间(min) | 6.294 | 6.295 | 6.294 | 6.294 | 6.294 | 6.294 | 6.294 | 0.01 |
| S/N | 11.80 | 11.26 | 11.73 | 10.93 | 10.92 | 12.05 | 11.45 | 4.19 |
表23甲氧苄啶杂质B定量限定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1299 | 1313 | 1308 | 1365 | 1345 | 1169 | 1300 | 5.29 |
| 保留时间(min) | 23.104 | 23.101 | 23.111 | 23.102 | 23.101 | 23.100 | 23.103 | 0.02 |
| S/N | 10.25 | 11.78 | 10.65 | 13.29 | 14.09 | 11.34 | 11.90 | 12.66 |
表24甲氧苄啶杂质C定量限定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1389 | 1388 | 1372 | 1392 | 1406 | 1385 | 1389 | 0.79 |
| 保留时间(min) | 7.152 | 7.155 | 7.158 | 7.161 | 7.164 | 7.167 | 7.160 | 0.08 |
| S/N | 12.96 | 12.55 | 12.69 | 11.64 | 11.92 | 12.82 | 12.43 | 4.26 |
表25二甲氧苄啶定量限定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1477 | 1420 | 1498 | 1473 | 1479 | 1446 | 1466 | 1.90 |
| 保留时间(min) | 9.841 | 9.846 | 9.853 | 9.856 | 9.864 | 9.869 | 9.855 | 0.11 |
| S/N | 11.20 | 10.69 | 11.17 | 10.13 | 10.37 | 11.02 | 10.76 | 4.12 |
表26甲氧苄啶定量限定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 2578 | 1931 | 1921 | 1814 | 1864 | 1851 | 1993 | 14.54 |
| 保留时间(min) | 12.927 | 12.934 | 12.947 | 12.955 | 12.965 | 12.970 | 12.95 | 0.13 |
| S/N | 15.56 | 11.31 | 11.56 | 10.05 | 10.48 | 11.22 | 11.70 | 16.89 |
表27磺胺甲噁唑定量限溶液6针进样结果
| 项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均 | RSD(％) |
| 峰面积 | 1048 | 1081 | 1039 | 1117 | 1096 | 1015 | 1066 | 3.60 |
| 保留时间(min) | 18.961 | 18.960 | 18.965 | 18.957 | 18.958 | 18.957 | 18.960 | 0.02 |
| S/N | 12.49 | 12.10 | 12.56 | 14.78 | 14.78 | 12.81 | 13.25 | 9.09 |
实验例2
专属性实验数据及图谱
以DAD为检测器，考察20180410批样品(复方磺胺甲噁唑片，厂家：北京振东光明药物研究院有限公司)，各原料(甲氧苄啶原料批号：A-10111412052、磺胺甲噁唑原料批号：SMXB150414，厂家：寿光富康制药有限公司)，辅料(批号：20180305，振东光明药物研究院有限公司)在强制降解条件下杂质降解情况，验证主峰纯度以及主峰与相邻杂质之间的分离度是否符合要求。测试结果分别见图11-14。其中图11为样品破坏结果，图12和13为磺胺甲噁唑原料破坏结果，括号内为杂质最大吸收波长(nm)，图14为甲氧苄啶原料破坏结果，括号内为杂质最大吸收波长(nm)。
其中，图11所示的表中，物料平衡计算公式如下：(磺胺甲噁唑总峰面积统计时包括磺胺甲噁唑峰和其他所有杂质峰)
F1(降解样品)＝降解样品总峰面积/样品称样量*平均片重/规格(磺胺甲噁唑400mg、甲氧苄啶80mg)，磺胺甲噁唑和甲氧苄啶分别计算；
F2(未降解样品)＝未降解样品总峰面积/样品称样量*平均片重/规格(磺胺甲噁唑400mg、甲氧苄啶80mg)，磺胺甲噁唑和甲氧苄啶分别计算；
物料平衡＝F1(降解样品)/F2(未降解样品)*100。
根据上述结果可知，各条件下，空白溶剂和空白辅料均不干扰杂质测定；主峰与相邻杂质及各杂质之间分离度均大于1.5；两主峰纯度角均小于纯度阈值；样品在酸、碱、高温、光照和氧化条件下的降解杂质大部分都来源于磺胺甲噁唑原料和甲氧苄啶原料；在酸、碱、高温、光照条件下，各成分均较为稳定，在氧化条件下，磺胺甲噁唑与未破坏的相比降解了10％左右，说明氧化条件下不稳定；以上各条件物料基本守恒。
重复性
平行配制6份供试品溶液，所有杂质按照面积归一化进行计算：6份样品的总杂为0.07％，RSD为13.45％，杂质检出基本一致。磺胺甲噁唑杂质F外标法进行计算，其他杂质按照自身对照(0.2％自身对照，即供试品溶液稀释500倍)计算：6份样品的磺胺甲噁唑杂质F为0.04％，RSD为0.76％；扣除磺胺甲噁唑杂质F后其他总杂含量为0.05％，RSD为12.17％；总杂含量为0.09％，RSD为6.44％。
准确度
磺胺甲噁唑杂质F的9份样品的回收率均在80.0％～120.0％之间，平均回收率为99.83％，RSD为5.68％。
具体的，分别配制磺胺甲噁唑杂质F为限度浓度(0.001mg/mL)的80％、100％、120％共3个浓度共9份回收率样品溶液，测定杂质F的回收率。
(1)杂质F对照品储备液：将一瓶磺胺甲噁唑杂质F(规格：5mg)用流动相A溶解并逐步转移至5mL量瓶，加流动相A适量，超声5min使溶解，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得高浓度储备液；精密量取高浓度储备液2mL，置20mL量瓶，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。
(2)杂质F对照品溶液(0.001mg/mL)：精密量取杂质F对照品储备液1mL，置100mL量瓶，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
(3)磺胺甲噁唑原料溶液：称取磺胺甲噁唑原料约25mg，置25mL量瓶中，加流动相A适量，超声使溶解，后加流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。平行配制2份。
(4)磺胺甲噁唑杂质F回收率储备液：精密量取杂质F对照品储备液5mL，置50mL量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得(约0.01mg/mL)。
(5)80％回收率样品溶液：称取磺胺甲噁唑原料约25mg，置25mL量瓶中，加杂质F回收率储备液2mL，加流动相A适量溶解，超声使溶解，后加流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。平行配制3份。
(6)100％回收率样品溶液：称取磺胺甲噁唑原料约25mg，置25mL量瓶中，加杂质F回收率储备液2.5mL，加流动相A适量溶解，超声使溶解，后加流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。平行配制3份。
(7)120％回收率样品溶液：称取磺胺甲噁唑原料约25mg，置25mL量瓶中，加杂质F回收率储备液3mL，加流动相A适量溶解，超声使溶解，后加流动相A稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。平行配制3份。
分别取磺胺甲噁唑杂质F对照品溶液、磺胺甲噁唑原料溶液及不同浓度的加样回收率样品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算杂质F的含量及回收率，结果见表28。
表28磺胺甲噁唑杂质F回收率试验结果
中间精密度
分别于不同日期、不同分析人员、采用不同仪器检测的12份样品，按照面积归一化法计算，磺胺甲噁唑杂质F为0.06％，RSD值为9.50％；其他单个最大单杂为0.04％，RSD值为17.07％；总杂为0.09％，RSD值为8.42％；12份样品中杂质检出个数和大小基本一致，说明本法中间精密度良好。
分别于不同日期、不同分析人员、采用不同仪器检测的12份样品，磺胺甲噁唑杂质F按照外标法计算，含量为0.04％，RSD为2.14％；扣除磺胺甲噁唑杂质F后其他总杂含量为0.05％，RSD为6.42％；总杂为0.08％，RSD为3.33％；12份样品中杂质个数无明显变化；说明本发明的检测方法中间精密度良好。
溶液稳定性
供试品溶液室温放置42h，磺胺甲噁唑杂质F的含量均值为0.06％，RSD值小于10％；其他单个最大杂质含量均值为0.04％，RSD小于15％；总杂含量均为0.09％，RSD小于15％；所以本品溶液在室温条件下放置42h稳定性良好。
杂质校正因子
磺胺甲噁唑杂质F校正因子为0.5。
比较例1
采用EP9.0中有关物质方法，对有关物质进行研究：
(1)采用EP9.0磺胺甲噁唑方法，色谱柱：Agilent，Eclipse，XDB-phenyl，25cm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；检测波长：240nm；进样量：20μL；流动相：甲醇﹕磷酸二氢钾溶液(13.6g/L磷酸二氢钾溶液，用20g/L氢氧化钾溶液调pH＝5.3)为35﹕65。分别取浓度约为1.0mg/mL磺胺甲噁唑原料、0.2mg/mL甲氧苄啶原料、混合杂质(磺胺甲噁唑杂质D、E、C、F，甲氧苄啶杂质C、甲氧苄啶杂质B)进行有关物质测定，结果见图16，混合杂质中待检个数为6个，实际检出4个，检出杂质个数与待检杂质数量明显不一致，可知部分杂质重叠，各组分分离度较差；磺胺甲噁唑的杂质与甲氧苄啶主峰重叠。图16中，从上至下分别为混合杂质、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑。
(2)采用EP9.0甲氧苄啶方法，色谱柱：Agilent，Eclipse，XDB-phenyl，25cm×4.6mm，5μm；柱温：30℃；流速：1.3mL/min；检测波长：280nm；进样量：20μL；流动相：甲醇﹕高氯酸钠溶液(1.4g/L高氯酸钠溶液，用磷酸调pH3.6)为30﹕70。分别取浓度约为1.0mg/mL磺胺甲噁唑原料、0.2mg/mL甲氧苄啶原料和混合杂质(磺胺甲噁唑杂质D、E、C、F，甲氧苄啶杂质C、甲氧苄啶杂质B)进行有关物质测定，结果见图17，磺胺甲噁唑主峰峰型较差，混合杂质各组分分离度较差，6个杂质只出4个峰，有杂质重叠。图17中，从上至下分别为混合杂质、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑。
由上可知，经过对EP9.0色谱条件的确认，该方法不适合复方片剂有关物质检测。
比较例2
采用ChP2015甲氧苄啶有关物质检测方法对磺胺甲噁唑和甲氧苄啶进行有关物质研究：
色谱柱：Agilent，Eclipse，XDB-phenyl，25cm*4.6mm，5μm；检测波长：240nm；流速：1.0mL/min；流动相：乙腈-水-三乙胺(200﹕799﹕1)(将水和三乙胺混匀，用氢氧化钠试液或冰醋酸调节pH值至4.0，加乙腈混匀)；进样量：20μL。分别取浓度约为0.5mg/mL磺胺甲噁唑与0.1mg/mL甲氧苄啶原料溶液进样，如图18所示，磺胺甲噁唑的杂质与甲氧苄啶主峰重叠，该条件不利于杂质分离，检测。图18中，从上至下分别为甲氧苄啶和磺胺甲噁唑。
比较例3
分别取浓度约为1.0mg/mL磺胺甲噁唑原料和0.2mg/mL甲氧苄啶原料，磺胺甲噁唑杂质F、甲氧苄啶杂质B、甲氧苄啶杂质C进行杂质定位研究，检测条件参考实施例1步骤(2)中的检测条件，区别在于，梯度洗脱程序如表29。测试结果见图19和图20，图19中从上至下分别为磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、甲氧苄啶杂质C、磺胺甲噁唑杂质F、甲氧苄啶杂质B；图20中从上至下分别为甲氧苄啶和磺胺甲噁唑。从图19中可知，各杂质均可以检出，分离度较好；由图20可知，磺胺甲噁唑的杂质与甲氧苄啶主峰重叠(该杂质百分含量约为0.3％)，所以该方法不适合复方磺胺甲噁唑片有关物质检测。
表29比较例3的梯度洗脱程序(体积比)
| 时间(min) | 流动相A(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 20 | 100 | 0 |
| 30 | 90 | 10 |
| 50 | 90 | 10 |
| 55 | 100 | 0 |
| 60 | 100 | 0 |
比较例4
比较例参考实施例1的检测条件，区别在于：使用Venvsil XBP-C18，4.6mm×25cm，5μm；流动相A为乙腈-磷酸盐缓冲液-三乙胺(体积比为150﹕849﹕1)(用氢氧化钠试液或冰醋酸调节pH值至5.9)；流动相B为乙腈；其中，磷酸盐缓冲液的配制为称取磷酸氢二钾2.28g，加水1L溶解。
分别取磺胺甲噁唑、甲氧苄啶，磺胺甲噁唑和甲氧苄啶混合氧化破坏溶液(80℃、30％双氧水1ml，破坏5min)，磺胺甲噁唑杂质C/D/E/F、甲氧苄啶杂质B/C混合杂质溶液，分别在实施例1和比较例4的条件下进行检测，测试结果见图21-23。
图21为采用实施例1中的检测方法，图21中从上至下分别为混合杂质、磺胺甲噁唑、甲氧苄啶；图22为采用比较例4中的检测方法，图22中从上至下分别为混合杂质、甲氧苄啶、磺胺甲噁唑。从图中可知，磺胺甲噁唑和甲氧苄啶各杂质均能有效分离，杂质无重叠，6个已知杂质之间的分离度良好。
图23为对磺胺甲噁唑和甲氧苄啶混合氧化破坏溶液进行检测的结果，条件1对应实施例1的检测条件，条件2对应比较例4的检测条件。从图23中可知，实施例1的检测条件比实施例4的检测条件检测出的杂质个数多，且各杂质之间的分离度更好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (12)
1.磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的有关物质的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用高效液相色谱对供试品溶液进行检测；
所述高效液相色谱检测的条件包括：
检测波长：238~242nm；
流动相A：乙腈、水和三乙胺的混合物，调节混合物pH至5.8~6.0；流动相B：乙腈；
所述流动相A中，调节混合物pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为（150~160）﹕（839~849）﹕1；
采用所述流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱的过程包括：0～10min内，流动相A和流动相B的体积比为100﹕0；10～15min内，流动相A和流动相B的体积比从100﹕0变至94﹕6；15～20min内，流动相A和流动相B的体积比从94﹕6变至85﹕15；20～30min内，流动相A和流动相B的体积比从85﹕15变至75﹕25；30～40min内，流动相A和流动相B的体积比从75﹕25变至70﹕30；40～50min内，流动相A和流动相B的体积比为70﹕30；50min～50.1min内，流动相A和流动相B的体积比从70:30变至100﹕0；50.1min～60min内，流动相A和流动相B的体积比为100﹕0；
所述高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
所述有关物质包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ，其结构式分别如下：
其中，所述供试品选自含磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的原料；或者；
所述供试品为含磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的复方制剂。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为0.8~1.2mL/min。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的流速为1.0mL/min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为25~35℃。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为30℃。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的进样量为10~20μL。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的进样量为20μL。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测的条件包括：
检测波长：240nm；
流动相A：乙腈、水和三乙胺的混合物，调节混合物pH至5.9；流动相B：乙腈；采用所述流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
所述流动相A中，调节混合物pH前，乙腈、水和三乙胺的体积比为155﹕844﹕1；
所述梯度洗脱的流速为1.0mL/min；
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述色谱柱的柱温为30℃。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，将同体积的供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，根据高效液相色谱检测结果分析有关物质；
和/或，将同体积的供试品溶液和对照品溶液分别采用高效液相色谱进行检测，采用外标法对供试品溶液中的有关物质进行计算。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液中包括有关物质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ以及磺胺甲噁唑和甲氧苄啶。
11.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述复方制剂选自片剂、颗粒剂、注射剂、混悬剂和胶囊剂中任一种。
12.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述复方制剂为片剂。
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