CN111983113A - 一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测依折麦布辛伐他汀片中6‑氧代辛伐他汀含量的方法，采用高效液相色谱法进行检测。本发明不仅可以定量测定依折麦布辛伐他汀片中存在的6‑氧代辛伐他汀的含量，而且能够完全分离6‑氧代辛伐他汀和各杂质，峰型较好，符合中国药典的规定，并且具备较低的检出限，有效控制依折麦布辛伐他汀片原料药的质量，专属性强、分离度高，灵敏度高，准确度良好。

Description

一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法

技术领域

本发明属于化学物质检测技术领域，涉及药品中降解杂质的检测，尤其是涉及一种依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的检测。

背景技术

依折麦布辛伐他汀片是由依折麦布和辛伐他汀组成的复方制剂，依折麦布是选择性胆固醇吸收抑制剂，能抑制外源性胆固醇的吸收。辛伐他汀能竞争性抑制HMG-CoA还原酶的活性，减少细胞内游离胆固醇的合成。其复方制剂适用于原发性高胆固醇血症或混合性高脂血症患者的治疗。

6-氧代辛伐他汀为依折麦布辛伐他汀片的降解杂质，是依折麦布和辛伐他汀在合成复方制剂的工艺中生成出来的杂质，在生产过程中可能传递到成品中。因此，为了更好地控制依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀杂质的含量，需要选取简便、准确、重复性好、灵敏度高、检出限低的方法进行检测，在保证产品的安全性和可靠性的前提下，有效的对依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀的质量进行控制。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种检测依折麦布辛伐他汀片中6- 氧代辛伐他汀含量的方法，可以定量测定依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀的含量，并具有较低的检出限，较高的灵敏度。

为了完成上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，采用高效液相色谱法进行检测。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述高效液相色谱法的检测条件如下：

固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

检测波长为290nm；

流动相A：浓度为0.025mol/L的磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液采用10％磷酸溶液调节pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20的溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述洗脱梯度的程序为：

0min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

27.00min，流动相A的体积分数为46％，流动相B的体积分数为54％；

27.01min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

37.00min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

流速为1.5ml/min；

进样量为100μl；

柱温为30℃。

本发明技术方案的进一步改进在于，包括以下步骤：

A：供试品溶液的配制：称取依折麦布辛伐他汀片作为供试品称样量W_供研磨成粉末后置于n_稀ml的量瓶中，加溶剂常温超声处理后再加溶剂定容至刻度配制成供试品溶液，待用；

B：对照品溶液的配制：称取BHA(丁基羟基茴香醚)先用乙腈溶解后再用溶剂稀释配制成浓度为C_对照的对照品溶液，待用；

C：测定：分别量取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，得到所述供试品溶液中依折麦布的色谱峰面积和6-氧代辛伐他汀的色谱峰面积A_降解产物，以及对照品溶液中BHA(丁基羟基茴香醚)的色谱峰面积 A_对照；

D：计算：按照式(1)即得到所述供试品溶液中6-氧代辛伐他汀的含量；

式中，A_降解产物为6-氧代辛伐他汀的峰面积；A_对照为对照品溶液中BHA(丁基羟基茴香醚)的主峰面积；C_对照为对照品溶液中BHA(丁基羟基茴香醚) 的浓度；W_供为供试品称样量；W_平均为平均片重；n_稀为供试品溶液的稀释倍数； 2.64为6-氧代辛伐他汀相对响应因子；标示量为供试品溶液中辛伐他汀的规格。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述步骤A与所述步骤B中，所述溶剂为0.025mol/L的枸橼酸溶液，采用50％氢氧化钠溶液将枸橼酸溶液调节 pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20的溶液。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述步骤A中，所述供试品溶液中含辛伐他汀的浓度为1.5～2.5mg/ml。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述步骤B中，所述对照品溶液中含BHA(丁基羟基茴香醚)的浓度为4.0～4.4μg/ml。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述供试品溶液中含辛伐他汀的浓度为2mg/ml。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述对照品溶液中含BHA(丁基羟基茴香醚)的浓度为4.2μg/ml。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述步骤A中，常温超声处理 30min。

本发明技术方案的进一步改进在于，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，规格为150mm×4.6mm，3μm。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的检测方法专属性强，灵敏度高，6-氧代辛伐他汀和样品中其他成分能达到很好的分离，在0.02μg/ml～8μg/ml范围内与其峰面积成良好的线性关系(r＝0.99998，n＝6)，检测限为0.87ng，定量限为2.17ng；6- 氧代辛伐他汀各浓度的回收率在80％～115％之间，平均回收率为98.27％，RSD 为4％，回收率良好；该方法简便，准确，重复性好，可用于依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀的质量控制。

附图说明

图1是本发明实施例中系统适用性溶液的色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：

一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，采用高效液相色谱法进行检测，采用的色谱柱为Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，规格为150mm×4.6mm，3μm。检测条件如下：

固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

检测波长为290nm；

流动相A：浓度为0.025mol/L的磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液采用10％磷酸溶液调节pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20的溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述洗脱梯度的程序为：

0min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

27.00min，流动相A的体积分数为46％，流动相B的体积分数为54％；

27.01min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

37.00min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

流速为1.5ml/min；

进样量为100μl；

柱温为30℃。

包括以下步骤：

A：供试品溶液的配制：称取依折麦布辛伐他汀片作为供试品称样量W_供研磨成粉末后置于n_稀ml的量瓶中，加溶剂常温超声处理30min后再加溶剂定容至刻度配制成含辛伐他汀的浓度为1.5～2.5mg/ml的供试品溶液，优选的为2mg/ml，待用；其中，溶剂为0.025mol/L的枸橼酸溶液，采用50％氢氧化钠溶液将枸橼酸溶液调节pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20 的溶液；

B：对照品溶液的配制：称取BHA(丁基羟基茴香醚)先用乙腈溶解后再用溶剂配制成含BHA(丁基羟基茴香醚)的浓度为4.0～4.4μg/ml的对照品溶液，优选为4.2μg/ml，待用；其中，溶剂为0.025mol/L枸橼酸溶液，采用50％氢氧化钠溶液将枸橼酸溶液调节pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20的溶液；

C：测定：分别量取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，得到所述供试品溶液中依折麦布的色谱峰面积和6-氧代辛伐他汀的色谱峰面积A_降解产物，以及对照品溶液中BHA(丁基羟基茴香醚)的色谱峰面积 A_对照；

D：计算：按照式(1)中的公式即得到所述供试品溶液中6-氧代辛伐他汀的含量；

式中，A_降解产物为6-氧代辛伐他汀的峰面积；A_对照为BHA(丁基羟基茴香醚)对照品溶液的主峰面积；C_对照为BHA(丁基羟基茴香醚)对照品溶液的浓度；W_供为供试品称样量；W_平均为平均片重；n_稀为供试品溶液的稀释倍数； 2.64为6-氧代辛伐他汀相对响应因子；标示量为供试品溶液中辛伐他汀的规格。标示量即样品的规格，如果每片含依折麦布10mg，含辛伐他汀20mg，辛伐他汀标示量即20mg，如果每片含依折麦布10mg，含辛伐他汀40mg，辛伐他汀标示量即40mg。

根据中国药典的指导原则，6-氧代辛伐他汀的标示含量＝6-氧代辛伐他汀的含量×平均片重/辛伐他汀标示量。因为6-氧代辛伐他汀是辛伐他汀产生的降解产物。故该公式是折算为基于辛伐他汀的标示量下的6-氧代辛伐他汀的含量，该计算方式是为了更客观的反映辛伐他汀的降解杂质6-氧代辛伐他汀。

需要说明的是，式(1)中的百分比是计算降解杂质6-氧代辛伐他汀与供试品中辛伐他汀的质量百分比。

其中，本公式(1)的原理是采用加校正因子的外标法进行测定，6-氧代辛伐他汀的浓度/6-氧代辛伐他汀峰面积＝BHA(丁基羟基茴香醚)的浓度/ (BHA(丁基羟基茴香醚)的峰面积×2.64)，即6-氧代辛伐他汀的浓度＝C _对照×A_降解产物/(A_对照×2.64)。

实施例

1仪器与试剂

1.1仪器：高效液相色谱仪(Agilent公司，型号：1260),电子分析天平 (梅特勒-托利多，型号：XS105)。

1.2试剂：依折麦布辛伐他汀片(自制，批号：130801,130802,130803)； BHA(丁基羟基茴香醚)(来源：USP，含量：99.8％)；无水磷酸二氢钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱级，CNW)。

2检测步骤

2.1色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl柱(150×4.6mm， 3μm)；流动相A：0.025mol/L磷酸二氢钠溶液(用10％磷酸溶液调节pH值至 4.0)-乙腈(80:20)；流动相B：乙腈；流速为1.5ml/min；检测波长为290nm；进样量为100μl；柱温为30℃；梯度洗脱程序见表1：

表1

时间(分钟)	流动相(A％)	流动相(B％)
			0	100	0
27.00	46	54
			27.01	100	0
37.00	100	0

2.2溶液的配制：

2.2.1供试品溶液的配制

取自制依折麦布辛伐他汀片约20片，研匀，精密称取研匀后的粉末(约相当于辛伐他汀20mg)，置10ml量瓶中，加溶剂适量，常温超声30min后，加溶剂定容至刻度，摇匀。

2.2.2对照品溶液的配制

精密称取BHA(丁基羟基茴香醚)对照品约21mg到50ml容量瓶，加乙腈溶解后定容至刻度，由于BHA(丁基羟基茴香醚)几乎不溶于水，易溶于乙腈，第一步先溶于乙腈，然后再用溶剂稀释至其相应的浓度，能够有效的改善溶解度差的问题。摇匀后，取1ml到100ml容量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，摇匀。

2.2.3阴性辅料溶液

精密称取不含依折麦布和辛伐他汀的空白辅料约180mg到10ml量瓶，加溶剂适量，超声30min,加溶剂定容到刻度，摇匀。

2.2.4 6-氧代辛伐他汀储备液的配制

精密称取6-氧代辛伐他汀对照品约21mg，置50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度摇匀后移取1ml到10ml容量瓶，加溶剂稀释定容至刻度，摇匀，作为6-氧代辛伐他汀储备液。

2.2.5溶剂的配制

0.025mol/L枸橼酸溶液(取无水枸橼酸4.8g，加水900ml使溶解，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至4.0，加水至1000ml)-乙腈(80:20)。

3.检测结果

3.1系统适用性实验

取供试品溶液作为系统适用性溶液，按“2.1”项下的色谱条件，进样分析，记录色谱图。依折麦布的保留时间为19.223min，BHA(丁基羟基茴香醚)的保留时间为17.848min，6-氧代辛伐他汀的保留时间为16.203min(见图1)，空白辅料对样品的测定无干扰，符合系统适用性要求，且峰型较好，符合中国药典的要求。

3.2检测限与定量限

分别精密称取6-氧代辛伐他汀对照品与BHA(丁基羟基茴香醚)对照品约10mg，逐级稀释，按“2.1”项下的色谱条件，进样分析，记录色谱图。当信噪比S/N＝10时，6-氧代辛伐他汀的定量限为2.17ng，BHA(丁基羟基茴香醚)的定量限为8.20ng，当信噪比S/N＝3时，6-氧代辛伐他汀的检测限为 0.87ng，BHA(丁基羟基茴香醚)的检测限为3.28ng。

3.3回收率实验

分别精密称取自制依折麦布辛伐他汀片研匀粉末约200mg，置10ml量瓶中，按6-氧代辛伐他汀浓度的50％、100％、150％分别精密移取6-氧代辛伐他汀储备液0.5ml、1ml、1.5ml到该容量瓶中，加溶剂适量，常温超声30min，加溶剂定容至刻度，摇匀，每个浓度平行配制3份。

分别精密量取上述溶液以及对照品溶液100μl注入高效液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件，进样分析，记录色谱图。结果见如下表2：

表2

由表2可以看出，6-氧代辛伐他汀各浓度的回收率在80％～115％之间，平均回收率为98.27％，RSD为4％，回收率良好。

3.4线性关系试验

将6-氧代辛伐他汀和BHA(丁基羟基茴香醚)分别制成每1ml为0.02μg、 2μg、3.2μg、4μg、6μg及8μg，精密量取100μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下的色谱条件，进样分析，记录色谱图。以对照溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，得6-氧代辛伐他汀线性方程为 Y＝181315.2686x-1994.1185(r＝0.99998)，BHA(丁基羟基茴香醚)线性方程为Y＝68729.2743x-2226.7692(r＝0.9999)。结果表明6-氧代辛伐他汀和 BHA(丁基羟基茴香醚)分别0.02～8μg/ml内线性关系良好，根据已知杂质的线性的相关斜率计算其相对响应因子(RRF)＝6-氧代辛伐他汀的斜率 /BHA(丁基羟基茴香醚)的斜率，得出6-氧代辛伐他汀计算后的相对响应因子为2.64。

3.5精密度试验

分别取6-氧代辛伐他汀和BHA(丁基羟基茴香醚)线性关系浓度下的 4μg/ml重复进样6次，结果见下表3：

表3

3.6重复性试验

取依折麦布辛伐他汀片(批号：130801)按“2.2.1”项下的方法配制6 份供试品溶液，按“2.2.2”项下的方法配制对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样分析。结果见表4，结果表明6-氧代辛伐他汀重复性良好。

表4

名称	1	2	3	4	5	6	平均值
								6-氧代辛伐他汀含量(％)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005

3.7溶液稳定性

取重复性项下的本品粉末适量(约相当于依折麦布10mg)，置10ml量瓶中，加溶剂适量，常温超声30min后，超声能够促进主成分及杂质的有效溶出，回收率提高，加溶剂定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液100μl,分别在 0h、2h、4h、8h、12h、24h时注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表5：

表5

3.8样品的测定

取3批依折麦布辛伐他汀片(批号：T1636、130801,130802,130803)，按“2.2.1”项下方法配制供试品溶液以及按“2.2.2”项下的方法配制对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样分析，结果见如下表6：

表6

批号	6-氧代辛伐他汀量(％)
		130801	0.005％
130802	0.004％
		130803	0.005％

由上表可以看出，该方法简便，准确，能有效检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀的含量。

由上述检测结果可知，采用上述方法不仅可以定量测定其存在的6-氧代辛伐他汀的含量，而且能够完全分离6-氧代辛伐他汀和各杂质，峰型较好，符合中国药典的规定，并且具备较低的检出限，有效控制依折麦布辛伐他汀片原料药的质量，专属性强、分离度高，灵敏度高，准确度良好。

由于采用“磷酸二氢钠溶液：乙腈”的流动相体系容易造成混合过程中的热效应，导致基线漂移，峰重现性不好等因素，本法采用“(磷酸二氢钠溶液-乙腈)：乙腈”的流动相体系能够有效的改善基线漂移的问题。

对于样品的制备中，采用超声提取的方法，能够促进主要成分及杂质的有效溶出，回收率提高。

BHA(丁基羟基茴香醚)几乎不溶于水，易溶于乙腈，本法第一步先溶于乙腈，然后再用溶剂稀释至其相应的浓度，能够有效的改善溶解度差的问题。

虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属于本发明所保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测条件如下：

固定相：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶；

检测波长为290nm；

流动相A：浓度为0.025mol/L的磷酸二氢钠溶液，磷酸二氢钠溶液采用10％磷酸溶液调节pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20的溶液；

流动相B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱；

所述洗脱梯度的程序为：

0min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

27.00min，流动相A的体积分数为46％，流动相B的体积分数为54％；

27.01min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

37.00min，流动相A的体积分数为100％，流动相B的体积分数为0；

流速为1.5ml/min；

进样量为100μl；

柱温为30℃。

3.根据权利要求2所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

A：供试品溶液的配制：称取依折麦布辛伐他汀片作为供试品称样量W_供研磨成粉末后置于n_稀ml的量瓶中，加溶剂常温超声处理后再加溶剂定容至刻度配制成供试品溶液，待用；

B：对照品溶液的配制：称取丁基羟基茴香醚先用乙腈溶解后再用溶剂稀释配制成浓度为C_对照的对照品溶液，待用；

C：测定：分别量取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，得到所述供试品溶液中依折麦布的色谱峰面积和6-氧代辛伐他汀的色谱峰面积A_降解产物，以及对照品溶液中丁基羟基茴香醚的色谱峰面积A_对照；

D：计算：按照式(1)即得到所述供试品溶液中6-氧代辛伐他汀的含量；

式中，A_降解产物为6-氧代辛伐他汀的峰面积；A_对照为对照品溶液中丁基羟基茴香醚的主峰面积；C_对照为对照品溶液中丁基羟基茴香醚的浓度；W_供为供试品称样量；W_平均为平均片重；n_稀为供试品溶液的稀释倍数；2.64为6-氧代辛伐他汀相对响应因子；标示量为供试品溶液中辛伐他汀的规格。

4.根据权利要求3所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述步骤A与所述步骤B中，所述溶剂为0.025mol/L的枸橼酸溶液，采用50％氢氧化钠溶液将枸橼酸溶液调节pH值至4.0，再与乙腈配制成体积比为80:20的溶液。

5.根据权利要求3或4所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述步骤A中，所述供试品溶液中含辛伐他汀的浓度为1.5～2.5mg/ml。

6.根据权利要求3或4所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述步骤B中，所述对照品溶液中含丁基羟基茴香醚的浓度为4.0～4.4μg/ml。

7.根据权利要求5所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述供试品溶液中含辛伐他汀的浓度为2mg/ml。

8.根据权利要求6所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述对照品溶液中含丁基羟基茴香醚的浓度为4.2μg/ml。

9.根据权利要求3所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述步骤A中，常温超声处理30min。

10.根据权利要求1至9任一项所述的一种检测依折麦布辛伐他汀片中6-氧代辛伐他汀含量的方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的色谱柱为Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl，规格为150mm×4.6mm，3μm。

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