CN111458423A - 一种分析测定琥珀酸曲格列汀中2-氰基-5-氟溴苄的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种分析测定琥珀酸曲格列汀中2‑氰基‑5‑氟溴苄的方法。本发明采用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸水溶液和乙腈溶液为流动相，采用梯度洗脱方式，所建立的高效液相分析方法能够准确测定琥珀酸曲格列汀中潜在基因毒性杂质2‑氰基‑5‑氟溴苄。本HPLC‑UV方法操作简单，分析时间短，准确度高，重复性好，灵敏度可达3.0ppm，为琥珀酸曲格列汀质量标准的提供了可靠检测方法，为患者的健康用药提供保障，属于医药技术领域。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体公开了一种利用HPLC法测定琥珀酸曲格列汀中潜在基因毒性杂质2-氰基-5-氟溴苄的药物分析方法。
背景技术
Trelagliptin(曲格列汀)是一种每周服药一次的二肽基肽酶IV(DPP-4)抑制剂，通过选择性、持续性抑制DPP-4，控制血糖水平。DPP-4为丝氨酸蛋白酶，能够引发肠促胰岛素(胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP))的失活，而这2种肠降胰岛素在血糖调节中发挥着重要作用。抑制DPP-4，能够增加血糖水平依赖性胰岛素分泌，从而控制血糖水平。对于本药品而言，其主要成分的纯度是药品药效的决定性因素，因此在制备该药物的后续检测是十分重要的。琥珀酸曲格列汀，化学名为2-[[6-[(3R)-3-氨基-1-哌啶基]-3,4-二氢-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基]甲基]-4-氟-苯甲腈琥珀酸盐，分子式：C18H20FN5O2·C4H6O4主要用于治疗Ⅱ型糖料病患者，具有半衰期长的优势，一周服用一次。其结构式如下：
2-氰基-5-氟溴苄是琥珀酸曲格列汀合成过程中的重要起始物料，其结构下：
2-氰基-5-氟溴苄是具备卤代烷烃结构，此类警示结构的化合物被ICH(人用药物注册技术要求国际协调会)、FDA(美国食品药品监督管理局)和EMEA(欧洲药品审评署)定义为潜在基因毒性杂质，因此，需要在琥珀酸曲格列汀中控制2-氰基-5-氟溴苄的含量。参考ICH《人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则》，每天最多摄入1.5μg的基因毒性杂质，被认可为大多数药品可以接受的风险。琥珀酸曲格列汀的每周最大摄入量为100mg，为了严格控制基因毒性杂质，我们设定其每天计量为100mg，所以2-氰基-5-氟溴苄相应限度为(1.5μg/day)/(100mg/day)＝15ppm。
近年来，随着国内外药政部门相关法规的逐步健全，基因毒性杂质研究已经成为保证产品质量的关键之一。目前，USP、EP、JP和中国药典及相关文献、专利均未见琥珀酸曲格列汀基因毒性杂质2-氰基-5-氟溴苄检测方法的报道。
发明内容
本发明提供一种高效液相色谱法分析测定琥珀酸曲格列汀中潜在基因毒性杂质即2-氰基-5-氟溴苄的方法。
本发明提供一种利用HPLC法分析测定琥珀酸曲格列汀中基因毒性杂质2-氰基-5-氟溴苄的方法，该方法包括：
(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸水溶液为流动相A，乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱方式；
(2)样品溶液的配置：采用乙腈水溶液作为溶剂将待检测样品配置成样品溶液；
(3)分离分析：将样品溶液注入高效液相色谱仪，完成珀酸曲格列汀基因毒性杂质的测定，其中，所述基因毒性杂质为2-氰基-5-氟溴苄。
本发明的上述方法中，其特征在于，所述固定相十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱的粒径为3.5um，长度为100mm，内径4.6mm。
本发明的上述方法中，其特征在于，步骤(2)中作为溶剂使用的乙腈溶液中乙腈浓度为20％～80％，优选50％。
本发明的上述方法中，其特征在于，作为流动相A的磷酸水溶液中，磷酸的浓度为0.05％～0.15％。优选磷酸浓度为0.1％。
本发明的上述方法中，其特征在于，所述流动相的流速为0.9～1.1ml/min，优选1.0ml/min。
本发明的上述方法中，其特征在于，所述色谱柱的柱温为35℃～45℃，优选38℃～42℃，更优选40℃。
本发明的上述方法中，其特征在于，检测波长为204nm；进样体积为10μl。
本发明的上述方法中，其特征在于，洗脱梯度为：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.0 | 66 | 34 |
| 13.0 | 66 | 34 |
| 13.1 | 10 | 90 |
| 19.0 | 10 | 90 |
| 19.1 | 66 | 34 |
| 25.0 | 66 | 34 |
发明人通过对杂质2-氰基-5-氟溴苄和琥珀酸曲格列汀的结构分析，针对化合物具备的酸碱性差异等情况，选择十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，磷酸水溶液和乙腈作为流动相，保证了2-氰基-5-氟溴苄与琥珀酸曲格列汀和相邻未知杂质之间的分离效果；采用2个等度洗脱的梯度洗脱方式，第一个等度(磷酸水溶液与乙腈的比例为66:34)是用于2-氰基-5-氟溴苄与琥珀酸曲格列汀和其他未知杂质基线分离开，第二个等度(磷酸水溶液与乙腈的比例为10:90)是用于将琥珀酸曲格列汀中极性小的杂质从体系中洗脱出来，以防干扰下一个样品的检测；发明人同时考虑到2-氰基-5-氟溴苄无解离基团、极性小，琥珀酸曲格列汀极性大易溶于水，采用水与乙腈体积比为50:50的溶液作为稀释液，既达到了样品溶解的目的，又防止样品产生溶剂效应等特点。
本发明的分析测定珀酸曲格列汀中基因毒性杂质2-氰基-5-氟溴苄的方法，灵敏度可达3.0ppm，对于琥珀酸曲格列汀原料药及制剂质量标准的制定和提升具有重要作用，同时也为其他采用类似起始原材料和合成路线的药物的基因毒性杂质研究提供了参考依据。
附图说明
图1实施例1中琥珀酸曲格列汀的定位溶液图；
图2实施例1中2-氰基-5-氟溴苄的定位溶液图；
图3实施例1中2-(二溴甲基)-4-氟苯的定位溶液图；
图4实施例1中空白溶剂的局部放大图；
图5实施例1中专属性溶液的局部放大图；
图6实施例2中检测限溶液的局部放大图；
图7实施例2中定量限溶液的局部放大图；
图8实施例3中线性溶液的局部放大图；
图9实施例3中2-氰基-5-氟溴苄的线性工作曲线图；
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。应当理解为：本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。在本发明技术方案的基础上对本发明的简单改进或者采用惯用手段或成分进行等同替换所得得到的技术方案均属于本发明的保护范围。
实施例一专属性与杂质定位试验
(1)样品溶液的配制
溶剂：50％乙腈水溶液
定位溶液：琥珀酸曲格列汀、2-氰基-5-氟溴苄、2-(二溴甲基)-4-氟苯腈(合成2-氰基-5-氟溴苄的副产物，是基因毒性杂质)各适量，精密称定，分别置不同的容量瓶中，加溶剂(50％乙腈水溶液)溶解并稀释制成含琥珀酸曲格列汀、2-氰基-5-氟溴苄和2-(二溴甲基)-4-氟苯腈各6.67mg/ml、0.1mg/ml、0.1mg/ml的溶液，作为化合物定位溶液。
专属性溶液：称取2-氰基-5-氟溴苄10mg，精密称定，置10ml的容量瓶中，加溶剂(50％乙腈水溶液)溶解并定容，摇匀。量取上述溶液100ul于10ml容量瓶，用稀释液溶解并定容，摇匀，作为2-氰基-5-氟溴苄储备液；称取琥珀酸曲格列汀66.67mg于10ml容量瓶，同时精密量取2-氰基-5-氟溴苄储备液1ml于同一容量瓶，加溶剂(50％乙腈水溶液)溶解并定容，摇匀，制成含琥珀酸曲格列汀6.667mg/ml、2-氰基-5-氟溴苄1μg/ml的溶液，作为专属性溶液。
精密量取空白溶剂、定位溶液、专属性溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，按照本发明实施例所述色谱条件检测。
(2)色谱条件：
高效液相色谱仪：Agilent 1100带紫外检测器。
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 100mm×4.6mm，3.5μm
流动相A：0.1％磷酸水溶液：准确移取1ml的磷酸溶解于1L的水中，混匀，超声脱气。
流动相B：乙腈
梯度洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.0 | 66 | 34 |
| 13.0 | 66 | 34 |
| 13.1 | 10 | 90 |
| 19.0 | 10 | 90 |
| 19.1 | 66 | 34 |
| 25.0 | 66 | 34 |
柱温：40℃；检测波长：204nm；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl。
(3)实验结果
定位试验结果：琥珀酸曲格列汀、2-氰基-5-氟溴苄、2-(二溴甲基)-4-氟苯腈的保留时间分别为0.926min、9.794min及15.074min，图谱见附图1～图3。
专属性试验结果：空白溶剂不干扰2-氰基-5-氟溴苄的检测；专属性溶液中，2-氰基-5-氟溴苄与相邻的未知杂质峰分离度均大于1.5；2-氰基-5-氟溴苄的色谱峰纯度角均小于纯度阈值，表明色谱峰为单一成分。以上表明，方法专属性符合要求。结果见表1，图谱见附图4、图5。
表1方法专属性试验结果
实施例二检测限和定量限
(1)样品溶液的配制
溶剂：50％乙腈水溶液
基线噪音的测定：精密量取溶剂10μl，注入液相色谱仪，连续进样3针，按照本发明实施例所述色谱条件检测。记录2-氰基-5-氟溴苄出峰时间范围内空白基线噪音，并计算平均值。
定量限溶液的制备：取2-氰基-5-氟溴苄适量，精密称定，用溶剂溶解并逐步稀释，按照本发明实施例一所述色谱条件检测，直至稀释至2-氰基-5-氟溴苄的峰高与相应噪音的比值(即信噪比，S/N)约为10为止，此时样品浓度与供试品测定浓度的比值即为定量限，以该浓度连续进样6针，计算6针峰面积的RSD。
检测限溶液的制备：取2-氰基-5-氟溴苄适量，精密称定，用溶剂溶解并逐步稀释，按照本发明实施例一所述色谱条件检测，直至稀释至2-氰基-5-氟溴苄的峰高与相应噪音的比值(即信噪比，S/N)约为3为止，此时样品浓度与供试品测定浓度的比值即为检测限，以该浓度进样1针。
(2)色谱条件
色谱条件同实施例1。
(3)实验结果
试验结果表明，在本发明所述分析方法下2-氰基-5-氟溴苄的检测限和定量限分别为1.0ppm和3.0ppm，即供试品中含量在3.0ppm以上的2-氰基-5-氟溴苄均可被检测到并准确定量。因此，方法的灵敏度符合要求。检测限和定量限结果见表2，检测限和定量限溶液图谱见图6和图7。
表2检测限和定量限结果
实施例三线性
(1)样品溶液的配制
精密称取2-氰基-5-氟溴苄10mg于100ml容量瓶，用稀释液溶解并定容，摇匀；精密量取上述溶液1ml于100ml容量瓶，加稀释液溶解并定容，摇匀，作为线性储备液。
分别精密量取线性储备液1.5ml、2.5ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml及7.5ml，置于不同的50ml容量瓶中，用稀释液溶解并定容，摇匀，分别作为限度的30％、50％、80％、100％、120％、150％线性溶液。按照本发明所述色谱条件检测，计算线性方程和相关系数。
(2)色谱条件
色谱条件同实施例一。
(3)实验结果
试验结果表明，2-氰基-5-氟溴苄在限度的30％至限度的150％浓度范围内，线性方程相关系数大于0.999，线性关系符合要求。试验结果见表3，线性溶液典型图谱见图8，工作曲线图谱见图9。
表3 2-氰基-5-氟溴苄线性试验结果
实施例四回收率
(1)样品溶液的配制
对照品储备液：称取2-氰基-5-氟溴苄10mg于100ml容量瓶，用稀释液溶解并定容，摇匀；精密量取上述溶液1ml于100ml容量瓶，用稀释液溶解并定容，摇匀，作为线性储备液。
对照品溶液：量取1.0ml对照品储备液于10ml容量瓶，用稀释液溶解并定容，摇匀，制成2-氰基-5-氟溴苄浓度为0.1μg/ml的溶液。
准确度溶液：称取供试品66.67mg，共2份，精密称定，分别置10ml容量瓶中，用稀释液溶解并定容，摇匀，作为空白溶液；另取供试品66.67mg，共9份，每3份为一组，共3组，分别置10ml量瓶中，每组分别加入对照品储备液0.8ml、1.0ml、1.2ml后，再用稀释液溶解并定容，摇匀，分别作为限度的80％、100％、120％的准确度测试溶液。上述溶液按本发明所述色谱条件检测。
(2)色谱条件
色谱条件同实施例一。
(3)实验结果
按如下公式计算每组样品中2-氰基-5-氟溴苄检出量，扣除样品中2-氰基-5-氟溴苄含量后的数据为实际检出量，计算实际检出量与理论加入量的比值，结果作为回收率数据，并统计回收率的范围、平均值和相对标准偏差(RSD)，用于评价方法的准确度。试验结果表明，2-氰基-5-氟溴苄含量的准确度测定溶液，其回收率范围在100.2％～109.4％之间，RSD小于5.0％，方法的准确度良好。试验结果见表5。
公式中：A样为供试品溶液中2-氰基-5-氟溴苄的峰面积；
C样为供试品溶液的浓度(mg/ml)；
A对为杂质对照品溶液中2-氰基-5-氟溴苄的峰面积；
C对为杂质对照品溶液中2-氰基-5-氟溴苄的浓度(mg/ml)。
表4准确度结果
实施例五耐用性
(1)样品溶液的配制
供试品溶液：同实施例四(样品溶液和样品加限度100％水平的溶液)。
(2)色谱条件
保持其它参数与实施例一项下色谱条件一致，分别将流速设为0.9ml/min、1.1ml/min、柱温设为38℃、42℃、波长设为202nm、206nm，流动相B的起始比例为32％、36％，并检测供试品溶液，记录各条件下的2-氰基-5-氟溴苄的回收率。试验结果见表6。
表5耐用性结果
综上所述，本发明所述方法操作简单，灵敏度高，专属性好，可准确测定琥珀酸曲格列汀中的潜在基因毒性杂质，是琥珀酸曲格列汀原料药及制剂工艺改进与创新及质量标准的进一步完善提升的前瞻性方法。
Claims (10)
1.一种分析测定琥珀酸曲格列汀中2-氰基-5-氟溴苄的方法，其特征在于，
(1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸水溶液为流动相A，以乙腈溶液为流动相B，梯度洗脱方式；
(2)样品溶液的配制：采用乙腈水溶液为溶剂将待检测样品配置成样品溶液；
(3)分离分析：将样品溶液注入高效液相色谱仪，完成琥珀酸曲格列汀基因毒性杂质2-氰基-5-氟溴苄的测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的粒径为3.5μm，长度为100mm，内径为4.6mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中作为溶剂使用的乙腈水溶液中乙腈的浓度为20％～80％
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中作为溶剂使用的乙腈水溶液中乙腈的浓度为50％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，作为流动相A的磷酸水溶液中，磷酸的浓度为0.05％～0.15％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，作为流动相A的磷酸水溶液中，磷酸的浓度为0.1％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.9～1.1ml/min，优选1.0ml/min；所述色谱柱的柱温为35℃～45℃。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为40℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测波长为204nm；进样体积为10μl。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱梯度为：
。
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