CN111579653B - 氟康唑有关物质检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了氟康唑有关物质检测方法，采用高效液相色谱的方法对氟康唑有关物质进行定性或/和定量检测，液相色谱的检测条件包括：色谱柱为C18色谱柱，流动相包括水相、有机相，其中，水相为磷酸盐缓冲液；有机相为有机相，有机相选自乙腈；流动相采用梯度洗脱法。采用本发明的方法能够有效检测氟康唑原料药中主药及其他相关杂质，具有专属性和稳定性指示能力，灵敏度高，能检出多个中国药典方法中检测不到的杂质。

Description

氟康唑有关物质检测方法
技术领域
本发明涉及检测方法领域，特别是涉及药物中氟康唑原料药有关物质的检测方法。
背景技术
氟康唑，化学式C13H12F2N6O306.28，结构式为
Figure BDA0001972398290000011
其为1978年辉瑞制药有限公司(英国，三文治研究所)开发的三唑类抗真菌药，是治疗真菌感染的一种药物，为广谱抗真菌药，对人和动物的真菌感染均有治疗作用，目前市场上有片剂、胶囊、粉针剂和注射液几种剂型。截止至2013年2月20日，该产品已在包括美国，法国和英国在内的100多个国家和地区获得批准。
众所周知，药物中的工艺杂质含量决定着药物的品质，想要得到高品质的氟康唑药物，则需要从原料药入手，提高检测水平，控制好原料药的质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氟康唑原料药相关物质的检测方法。
发明人采用中国药典2015版所收载的氟康唑原料药、氟康唑胶囊的测定方法测定不同来源氟康唑原料药的有关物质，此两个方法均为等度洗脱，均无法实现对现有杂质的良好分离，且由于各药典有关物质方法均采用低比例有机相(不高于20％乙腈，或45％甲醇(中国药典2015版氟康唑胶囊))的等度洗脱系统，故样品中的弱极性杂质有可能无法完全检出。
本发明提供一种氟康唑原料药相关物质的检测方法，采用高效液相色谱进行定性或/和定量检测氟康唑纯度和相关杂质，液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：烷基硅烷键合硅胶柱或等效色谱柱，进一步选自C18色谱
柱；
流动相：水相、有机相；
其中，水相为磷酸盐缓冲液；有机相选自乙腈；流动相采用如下梯度洗脱程序：
时间(min) 水相(vol.％) 有机相(vol.％)
0 85～90 10～15
12 80～90 10～20
16 75～88 12～20
35 40～50 50～60
36 85～95 5～15
41 85～95 5～15
或采用如下梯度洗脱程序：
时间(min) 水相(vol.％) 有机相(vol.％)
0 85～95 5～15
20 75～85 15～25
40 25～35 65～75
45 25～35 65～75
45.01 85～95 5～15
52 85～95 5～15
所述杂质为合成等工艺过程中引入的杂质，包括反应物、中间体、副产物、试剂、催化剂等。
所述检测方法可检测氟康唑原料药中氟康唑纯度和相关杂质，是指当药物中只含有氟康唑，或氟康唑和其相关杂质均含有时，都能用此方法进行检测。
进一步地，所述杂质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质L、杂质K中的一种或几种。所述杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质L、杂质K的具体结构见表1。
表1.氟康唑相关杂质
Figure BDA0001972398290000031
Figure BDA0001972398290000041
所述磷酸盐缓冲液主要包括使用磷酸盐或/和磷酸氢盐或/和磷酸二氢盐或/和酸或/和碱或/和其它盐配制而成的磷酸盐缓冲液。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液中含有磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、磷酸根离子和碱金属离子；进一步地，所述碱金属离子选自钾离子、钠离子中的一种或两种。如可以是含有磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、磷酸根离子和钾离子的溶液，或含有磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、磷酸根离子和钠离子的溶液，或含有磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子、磷酸根离子、钾离子和钠离子的溶液。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠缓冲液。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节pH至6.0～7.0。
在本发明的具体实施方式中，使用的磷酸盐缓冲液为10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，并用磷酸调节pH至7.0。
在本发明的一个具体实施方式中，流动相采用如下梯度洗脱程序，其中，水相为pH为7的磷酸氢二钠缓冲液；有机相为乙腈：
Figure BDA0001972398290000042
Figure BDA0001972398290000051
或采用如下梯度洗脱程序：
时间(min) 水相(vol.％) 有机相(vol.％)
0 90 10
20 80 20
40 30 70
45 30 70
45.01 90 10
52 90 10
在本发明的具体实施方式中，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；
ii柱温：30～40℃；
iii流速：0.8～1.2ml/min；
iv检测波长：260～262nm。
进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；
ii柱温：35～40℃；
iii流速：0.9～1.1ml/min；
iv检测波长：261或262nm。
本发明具体实施方式中使用的色谱柱商品名为Agilent ZORBAX EclipsePlusC18，只要满足上述描述的色谱柱均可运用于本发明的检测方法，不限于上述商品。
进一步地，所述检测方法还包括以下内容：
(1)制备供试品溶液；
(2)制备对照溶液；
(3)将对照溶液进样检测；
(4)将供试品溶液进样检测。
所述检测方法可使用自身对照法、外标法等方法分析、计算检测结果。
进一步地，所述的检测方法对杂质A、杂质B、杂质C按照已知杂质进行控制，采用外标法进行定量检测，其他杂质采用主成分自身对照法进行定量检测。
进一步地，所述的检测方法步骤包括的制备供试品溶液或/和对照品溶液是将样品用稀释剂溶解并稀释到指定浓度即得。
进一步地，所述稀释剂为质量浓度为10～15％的乙腈水溶液。
本发明的具体实施例中，所使用的稀释剂为质量浓度为12％的乙腈水溶液。
本发明的有益效果是：
(1)采用本发明的检测方法较中国药典方法杂质检出量及杂质检出数均较多，该方法能实现杂质与杂质间、杂质与主峰间的有效分离，且更容易获得良好的峰形及分离。
(2)本发明分析方法中国药典方法相比较，灵敏度更高，专属性好，杂质检出能力强，更适用于氟康唑原料药的质量控制。
附图说明
图1是药典方法的检测谱图；
图2是本发明的检测方法的系统适用性试验谱图；
具体实施方法
下面通过具体实施方式和实验对本发明检测方法做进一步说明。
实施例1方法的开发
(1)ChP2015氟康唑原料有关物质色谱方法
各国药典收载的氟康唑有关物质色谱方法中，ChP2015氟康唑原料有关物质检测以乙腈-0.063％甲酸铵(20∶80)为流动相。
以杂质混合溶液(氟康唑对照品、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质L，杂质K)作为供试品溶液，对该方法进行确认。色谱条件见表2，检测结果见表3和图1。
表2 ChP2015原料有关物质方法确认色谱条件
Figure BDA0001972398290000071
表3 ChP2015氟康唑原料有关物质方法考察结果
Figure BDA0001972398290000072
结果表明，该色谱条件下，杂质L及杂质B重合，无法实现分离，故此方法不适用于氟康唑有关物质检测。
对ChP2015氟康唑原料药有关物质色谱方法进行确认，结果表明其均不能实现杂质与杂质间或杂质与主峰间的有效分离，不适用于氟康唑原料有关物质的检测，故开展有关物质方法筛选。
(2)方法筛选1
采用甲醇系统并进行流动相比例的调整，以试图得到良好的分离及峰形。色谱条件见表4，结果见表5。
表4色谱条件1
Figure BDA0001972398290000073
Figure BDA0001972398290000081
表5色谱条件1结果
峰归属 R.T(min) 塔板数 分离度
杂质1 3.843 7567 NA
杂质2 5.042 9572 6.36
杂质3 5.934 10899 4.18
氟康唑 6.185 9677 1.07
采用甲醇系统并进行细微的流动相比例的调整后，氟康唑峰与前一杂质峰未能实现有效分离，分离度仅1.07，且存在杂质峰重叠，此方法不适用。
(3)方法筛选2
加入杂质G、杂质K、杂质L，试图进行梯度洗脱，以考察该方法的适用性。色谱条件见表6，结果见表7。
表6色谱条件2
Figure BDA0001972398290000082
Figure BDA0001972398290000091
表7色谱条件2-结果
峰归属 R.T(min) 对称因子 与前峰分离度 塔板数
杂质L 8.976 1.02 NA 39216
杂质A 9.199 1.09 1.24 42080
杂质K 9.284 0.44 0.52 63095
杂质B 9.623 0.90 2.21 59180
杂质D 10.757 0.92 6.94 65522
杂质C 11.942 1.02 7.38 97888
氟康唑 12.120 0.41 0.79 27058
杂质G 14.793 0.92 11.43 118086
结果表明，在该梯度条件下，杂质A与杂质K无法实现有效分离，分离度仅0.52，且杂质C与氟康唑峰分离也较差，分离度仅0.79，该方法需要继续优化。
(4)方法筛选3
尝试采用乙腈-磷酸盐系统进行方法的开发，经过多次初始比例及乙腈梯度速率的调整，得到以下方法，能够实现杂质与杂质间，杂质与氟康唑峰之间的良好分离，并能得到良好的峰形。色谱条件见表8，结果见表9。
表8色谱条件3
Figure BDA0001972398290000092
Figure BDA0001972398290000101
表9色谱条件3-结果
Figure BDA0001972398290000102
结果表明，该色谱条件下，能够实现杂质与杂质间，杂质与氟康唑峰间的较好分离，且杂质与氟康唑峰峰形均较优，能够满足氟康唑有关物质已知杂质检测的要求。
实施例2
对方法筛选3的检测条件进行进一步优化，最终得到本发明方法，并用该方法进行氟康唑原料药杂质检测：
取本品适量，加稀释剂(12％乙腈)溶解，制成每1ml中含氟康唑约5mg的溶液作为供试品溶液；精密量取适量，用稀释剂定量稀释制成每1ml中约含氟康唑50μg的溶液，作为对照溶液(a)。取氟康唑对照品与杂质A对照品、杂质B对照品、杂质C对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含氟康唑1mg、杂质A20μg、杂质B10μg、杂质C5μg的溶液作为对照溶液(b)。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX EclipsePlus C184.6×250mm，5um色谱柱，或等效色谱柱)，以10mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(磷酸调节pH至7.0)为流动相A，乙腈为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，检测波长为261nm，柱温40℃。
精密量取对照溶液(b)20μl注入液相色谱仪，根据出峰顺序依次为杂质B、杂质A、杂质C及氟康唑，杂质C峰与氟康唑峰分离度应大于1.5。
精密量取对照溶液(a)、对照品溶液(b)、供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪。供试品溶液色谱图中如有杂质A、B、C峰，按外标法以峰面积计算。
色谱条件如表10：
表10优化的色谱条件
Figure BDA0001972398290000111
Figure BDA0001972398290000121
结果表明，上述方法可以将氟康唑原料药中的主药及其他不同杂质有效分离，且能检测出多种杂质(见图2)。
实施例3方法验证：
表11验证项目及结果简表
Figure BDA0001972398290000122
Figure BDA0001972398290000131
Figure BDA0001972398290000141
经过分析方法验证，本方法专属性良好，空白辅料不干扰杂质检测，各杂质与主峰分离良好，各杂质的检测限与定量限满足测定要求且各杂质线性良好；通过杂质加标试验，本方法准确度及精密度均符合要求；通过微调色谱条件，证明本方法耐用性较好。
综上所述，本发明检测方法较中国药典方法更优，能实现杂质与杂质间、杂质与主峰间的有效分离，且更容易获得良好的峰形及分离。且本发明检测方法，灵敏度更高，专属性和耐用性好，更适用于氟康唑原料药的质量控制。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种氟康唑原料药有关物质的检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱进行定性或/和定量检测氟康唑相关杂质，液相色谱的检测条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；
检测波长：261或262nm；
流动相：水相、有机相；
其中，水相为磷酸氢二钠缓冲液，用磷酸调节pH至6.0～7.0；有机相选自乙腈；流动相采用如下梯度洗脱程序：
时间，min 水相，vol.％ 有机相，vol.％ 0 88 12 12 85 15 16 83 17 35 45 55 36 88 12 41 88 12
或采用如下梯度洗脱程序：
时间，min 水相，vol.％ 有机相，vol.％ 0 90 10 20 80 20 40 30 70 45 30 70 45.01 90 10 52 90 10
所述杂质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质L、杂质K中的一种或几种；所述杂质的结构如下：
Figure FDA0003599272700000011
Figure FDA0003599272700000021
Figure FDA0003599272700000031
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述磷酸氢二钠缓冲液浓度为10mmol/L。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iii中的一项或多项：
i色谱柱规格：4.6×250mm，5μm；
ii柱温：35～40℃；
iii流速：0.9～1.1ml/min。
4.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，杂质A、杂质B、杂质C按照已知杂质进行控制，并采用外标法进行定量检测，其他杂质采用主成分自身对照法进行检测。
5.根据权利要求1～3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括制备供试品溶液或/和对照品溶液的步骤，所述供试品溶液或/和对照品溶液是将样品用稀释剂溶解并稀释到指定浓度得到，所述稀释剂为10～15％的乙腈水溶液。
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