CN115266968A - 一种hplc分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的方法，所述舒更葡糖钠中间体为八(6‑溴‑6‑去氧)‑γ‑环糊精，所述杂质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质E和杂质H中的一个或多个；所述HPLC分离条件为：色谱柱为C18键合硅胶色谱柱；采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，所述流动相B为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂，所述流动相A为水与流动相B的混合溶剂。本发明还公开了一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的试剂组合和指纹图谱。本发明对于实现舒更葡糖钠中间体和原料药的质量控制具有极其重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的方法，尤其涉及一种HPLC法分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的试剂组合、指纹图谱及方法，属于制药技术领域。
背景技术
舒更葡糖钠是一种经过修饰的γ-环糊精，为20年来开发成功的首个、唯一的选择性肌肉松弛拮抗剂(结合剂)(SRBA)，其通过全新且唯一的途径包裹氨基甾体类非去极化肌肉松弛药而阻断松弛作用，能快速可预见性的逆转罗库溴铵和维库溴铵导致的任何强度的肌肉松弛，且副作用较小，能让肌松药的使用接近理想状态，其逆转神经肌肉阻断作用比现有药物更快速，更有可预见性。
舒更葡糖钠质量标准还未收录于各国药典中，相关分析方法报道比较少。专利申请CN110554102A公开了一种检测舒更葡糖钠及其有关杂质的方法，但是该分析方法主要用于原料药成品的检测和破坏性试验中如酸降解、碱降解、氧化降解、高温降解和光照降解条件的杂质检测，远不能满足实际生产过程中中间体的质量控制的需求。
根据《化学药物杂质研究的技术指导原则》的相关规定，一种药物杂质总含量应小于1.0％，单个杂质含量应小于0.1％，对于制备舒更葡糖钠过程中产生的杂质或引入的有关物质，不论是在原料药还是制剂中均需要进行严格控制。八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精为舒更葡糖钠制备过程中的关键中间体，该化合物的质量控制对高质量的舒更葡糖钠原料药制备起到重要的作用，由于制备八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精的原料是经过发酵而获得，其基质复杂，有机杂质较多，经过溴代反应制备得到的八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精需要对原料中带入的杂质和反应产生的副产物都进行严格控制，而大环类杂质结构相似，极性十分接近，导致定性和定量困难，所以开发一种高效且精确的分析方法，对舒更葡糖钠关键中间体进行质量分析，对后续制备高纯度的舒更葡糖钠有着重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的方法，该法可以有效的将式I所示化合物(即八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精)及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性良好，操作简单，结果稳定可靠。
同时，本发明提供一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的试剂组合，该试剂组合可实现式I所示化合物及其相关杂质的高效分离。
同时，本发明提供一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的指纹图谱，该指纹图谱可实现式I所示化合物及其相关杂质的鉴别。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明公开提供的一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的方法，其中，所述舒更葡糖钠中间体为八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精，其是合成舒更葡糖钠的关键中间体，在后简称为式I所示化合物，结构式如下：
所述杂质包括杂质A、杂质B、杂质C、杂质E和杂质H中的一个或多个，具体化学名如下所示：
色谱条件为：色谱柱为C18键合硅胶色谱柱；采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，所述流动相B为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂，所述流动相A为水与流动相B的混合溶剂，
梯度洗脱程序为：
流动相进行洗脱的流速为0.7-1.3mL/min；柱温选自20-50℃，然后进入检测器中该进行检测。
一些实施方案中，所述腈类溶剂选自乙腈或丙腈，所述醇类溶剂选自C1-C6烷基醇，具体的可选甲醇或乙醇，所述腈类溶剂与醇类溶剂的体积比选自10:1-1:10。
一些实施方案中，所述腈类溶剂选自乙腈，所述醇类溶剂为甲醇。
一些实施方案中，所述腈类溶剂与醇类溶剂的体积比选自5:1-1:5，具体可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或任意两个点值之间的数值。
一些实施方案中，所述流动相A中水与流动相B的体积比选自10:1-1:10，可选地，流动相A中水与流动相B的体积比选自5:1-1:5，具体可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或任意两个点值之间的数值。
一些实施方案中，流动相进行洗脱的流速选自0.8-1.2mL/min，具体可选0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min或1.2mL/min，或任意两个点值之间的数值。
一些实施方案中，柱温选自25-35℃，具体可选，25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃或35℃。
可选的实施方案中，梯度洗脱程序为：
一些实施方案中，C18键合硅胶色谱柱为Kromasil 100-5C18。
一些实施方案中，检测器为蒸发光散射检测器(ELSD)。
一些实施方案中，检测器温度选自50-60℃，具体可选50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。
一些实施方案中，所述流动相B为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂，所述腈类溶剂选自乙腈，所述醇类溶剂为甲醇，所述腈类溶剂和醇类溶剂的体积比为1:4，所述流动相A中水与流动相B的体积比为1:4。
一些实施方案中，流动相A为体积比20:80的水-流动相B的混合溶液，流动相B为体积比20:80的乙腈-甲醇混合溶液。
本发明另一方面公开提供一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的试剂组合，包含以下试剂：
流动相B：为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂；
流动相A：为水与流动相B的混合溶剂；所述相关杂质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质E、杂质H中的一个或多个。
可选的实施方案中，所述腈类溶剂选自乙腈或丙腈，所述醇类溶剂选自C1-C6烷基醇，具体的可选甲醇或乙醇，所述腈类溶剂与醇类溶剂的体积比选自10:1-1:10。
可选的实施方案中，所述腈类溶剂选自乙腈，所述醇类溶剂为甲醇。
可选的实施方案中，所述腈类溶剂与醇类溶剂的体积比选自5:1-1:5，具体可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或任意两个点值之间的数值。
可选的实施方案中，所述流动相A中水与流动相B的体积比选自10:1-1:10，可选地，流动相A中水与流动相B的体积比选自5:1-1:5，具体可以是5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，或任意两个点值之间的数值。
可选的实施方案中，所述流动相B为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂，所述腈类溶剂选自乙腈，所述醇类溶剂为甲醇，所述腈类溶剂和醇类溶剂的体积比为1:4，流动相A中水与流动相B的体积比为1:4。
本发明另一方面公开提供一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的指纹图谱，
| 出峰时间(min) | 杂质名称 |
| 4.239 | 杂质E |
| 11.508 | 杂质A |
| 15.062 | 杂质C |
| 26.804 | 杂质H |
| 28.879 | 八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精 |
| 31.584 | 杂质B |
本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种HPLC分离测定式I化合物及其杂质的方法，本发明的方法可以有效的将式I所示化合物及其相关杂质分开，且该方法具有很高的灵敏度及分离度，重复性良好，操作简单，结果稳定可靠。
2)本发明中式I化合物的分析研究对合成反应的控制及质量的提高起着至关重要的作用，也直接影响舒更葡糖钠成品的质量，所以该方法对于实现式I化合物及舒更葡糖钠质量控制具有极其重要的意义。
附图说明
图1为本发明的系统适用性溶液的高效液相色谱图；
图2为对比例1的高效液相色谱图；
图3为对比例2的高效液相色谱图。
具体实施方式
以下将结合附图、实施例或实验例更详细地解释本发明，本发明中的实施例或实验例仅用于说明本发明中的技术方案，并非限定本发明中的实质和范围。
实施例1
舒更葡糖钠中间体式I化合物及其相关杂质(杂质A、B、C、E、H)的分离：
1.色谱条件：
色谱柱：Kromasil 100-5C18，250mm×4.6mm，5μm，流动相A为水-流动相B(体积比20:80)，流动相B为乙腈-甲醇(体积比20:80)，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下表1：
表1.梯度洗脱程序
流速：1mL/min，柱温：30℃，进样体积：100μL，检测器：ELSD；55℃。
2.方法与结果：
2.1.溶液配制：
供试品溶液：取舒更葡糖钠中间体(即式I化合物)约15mg，精密称定，至于10mL量瓶，加四氢呋喃3mL，于40℃水浴中超声10min取出立即加甲醇-水(50:50)溶解并稀释至刻度，摇匀；对照品储备液：取舒更葡糖钠中间体(即式I化合物)对照品约15mg，精密称定，至于100mL量瓶，加四氢呋喃30mL，于40℃水浴中超声10min取出立即加甲醇-水(50:50)溶解并稀释至刻度，摇匀；对照品溶液(1)：精密移取对照品储备液1mL置10mL量瓶，加四氢呋喃2mL，加溶剂稀释置刻度，摇匀；对照品溶液(2)：精密移取对照品储备液2mL置10mL量瓶，加四氢呋喃2mL，加溶剂稀释置刻度，摇匀；对照品溶液(3)：精密移取对照品储备液3mL置10mL量瓶，加四氢呋喃2mL，加溶剂稀释置刻度，摇匀。
2.2.专属性：
取式I化合物与杂质A、杂质B、杂质C杂质E、杂质H各适量，用溶剂配制成每1mL含式I化合物约1.5mg及各杂质均约为45μg的溶液，作为系统适用性溶液。精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，系统适用性溶液结果见附图1，出峰顺序依次为杂质E(4.239min)、杂质A(11.508min)、杂质C(15.062min)、杂质H(26.804min)、式I化合物(28.879min)、杂质B(31.584min)。系统适用性溶液中，式I化合物与相邻杂质峰的分离度为4.3/9.1，保留时间为28.879。
2.3.线性与范围：
取式I化合物及其杂质对照品适量，加稀释剂溶解并稀释制成浓度均为100μg/mL的溶液，作为线性储备液。分别移取储备液1mL置10mL、2mL置10mL、3mL置10mL、4mL置10mL、6mL置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，作为线性供试液。以峰面积的对数值与浓度的对数值进行线性回归，得线性方程，式I化合物及其杂质在线性范围内具有良好的线性关系。
2.4.定量限与检测限：
取式I化合物及其杂质对照品适量，配制成一系列的溶液，S/N约为10时，作为定量限溶液，S/N约为3时，作为检测限溶液式I化合物及其杂质的定量限和检测限结果见表2。
表2.定量限和检测限结果
| 名称 | 检测限(μg/mL) | 信噪比(S/N) | 定量限(μg/mL) | 信噪比(S/N) |
| 式I化合物 | 3.4603 | 3.1 | 11.5345 | 17.8 |
| 杂质A | 1.5017 | 3.6 | 5.0058 | 17.2 |
| 杂质B | 0.6019 | 3.6 | 2.0063 | 17.9 |
| 杂质C | 1.4596 | 2.8 | 4.865 | 12.7 |
| 杂质E | 2.5637 | 3.8 | 8.5458 | 17.8 |
| 杂质H | 5.5698 | 3.0 | 18.5659 | 16.2 |
在该色谱条件下，式I化合物及其杂质可以完全分离，结果均符合中国药典规定的限度内，所得结果稳定可靠。
对比例1
舒更葡糖钠中间体式I化合物及其相关杂质(杂质A、B、C、E、H)的分离：
1.色谱条件：
色谱柱：Kromasil 100-5C18，250mm×4.6mm，5μm，流动相A为水，流动相B为乙腈-甲醇(10:90)，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下表3：
表3.梯度洗脱程序
其他条件同实施例1。
2.结果：
取供试品溶液进样，色谱图见附图2。
3.结论：
各有关物质整体保留靠后，且式I化合物(RT21.354min)与其相邻杂质H(RT21.058min)不能满足分离度大于1.5的要求，分离效果不好。
对比例2
舒更葡糖钠中间体式I化合物及其相关杂质(杂质A、B、C、E、H)的分离：
1.色谱条件：
色谱柱：Kromasil 100-5C18，250mm×4.6mm，5μm，流动相A为水，流动相B为乙腈-甲醇(20:80)，进行梯度洗脱，梯度洗脱设置如下表4：
表4.梯度洗脱程序
流速：1mL/min，柱温：30℃，进样体积：100μL，检测器：ELSD；55℃。
其他条件同实施例1。
2.结果：
取供试品溶液进样，色谱图见附图3。
3.结论：
式I化合物(RT16.758min)保留时间比较靠前，与其相邻杂质H(RT16.198min)分离较差，未达到基线分离，不适用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的方法，其特征在于，所述舒更葡糖钠中间体为八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精，所述杂质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质E和杂质H中的一个或多个，杂质具体化学名如下所示：
所述HPLC分离条件为：
色谱柱为C18键合硅胶色谱柱；
采用流动相A与流动相B进行梯度洗脱，所述流动相B为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂，所述流动相A为水与流动相B的混合溶剂；
梯度洗脱程序为：
流动相进行洗脱的流速选自0.7-1.3mL/min；柱温选自20-50℃，然后进入检测器进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述腈类溶剂选自乙腈或丙腈，所述醇类溶剂选自C1-C6烷基醇；所述流动相B中，所述腈类溶剂与所述醇类溶剂的体积比选自10：1-1：10；所述流动相A中，水与所述流动相B的体积比选自10：1-1：10。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述腈类溶剂为乙腈，所述醇类溶剂为甲醇；所述流动相B中，乙腈与甲醇的体积比为1：4；所述流动相A中，水与所述流动相B的体积比为1：4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C18键合硅胶色谱柱为Kromasil 100-5C18柱；所述检测器为蒸发光散射检测器ELSD；所述检测器温度选自50-60℃。
6.一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的试剂组合，其特征在于，包含以下试剂：
流动相B：为腈类溶剂和醇类溶剂的混合溶剂；
流动相A：为水与流动相B的混合溶剂；
所述舒更葡糖钠中间体为八(6-溴-6-去氧)-γ-环糊精，所述杂质选自杂质A、杂质B、杂质C，杂质E和杂质H中的一个或多个，所述杂质具体化学名如下所示：
7.根据权利要求6所述的试剂组合，其特征在于，所述腈类溶剂选自乙腈或丙腈，所述醇类溶剂选自C1-C6烷基醇；所述流动相B中，所述腈类溶剂与所述醇类溶剂的体积比选自10：1-1：10；所述流动相A中，水与所述流动相B的体积比选自10：1-1：10。
8.根据权利要求7所述的试剂组合，其特征在于，所述腈类溶剂为乙腈，所述醇类溶剂为甲醇；所述流动相B中，乙腈与甲醇的体积比为1：4；所述流动相A中，水与所述流动相B的体积比为1：4。
9.一种HPLC分离测定舒更葡糖钠中间体及其杂质的指纹图谱，其特征在于，
。
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