CN104764829A - 测定氟康唑的有关物质及特征未知杂质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及测定氟康唑的有关物质及特征未知杂质的方法。本发明旨在建立HPLC法测定氟康唑的有关物质，并对特征未知杂质进行结构确证。本发明采用ODS柱；以醋酸钠缓冲液-甲醇为流动相A，乙腈-甲醇为流动相B，梯度洗脱。本发明接着用LC-MS分析特征未知杂质，再用半制备液相色谱分离纯化，通过NMR确定结构。由此，本发明建立的HPLC有关物质分析方法具有良好的方法学验证结果，与中国药典方法比较，杂质检出能力更强；特征未知杂质为2-(2,4-二氟苯基)-1,3-二(1H-1,2,4-三唑-1-基)-丁-2-醇。已经发现，本发明建立的方法简便、灵敏、专属性好、杂质检出能力强，能有效的反应药品质量。

Description

测定氟康唑的有关物质及特征未知杂质的方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别是涉及药品分析方法领域。本发明旨在建立HPLC法测定氟康唑的有关物质，并对特征未知杂质进行结构确证。本发明采用CERI L-column ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；以0.01mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)-甲醇(95:5)为流动相A，乙腈-甲醇(60:40)为流动相B，梯度洗脱；流速1.0mL/min；检测波长261nm，柱温30℃。本发明接着用LC-MS分析特征未知杂质，再用半制备液相色谱分离纯化，通过NMR确定结构。由此，本发明建立的HPLC有关物质分析方法具有良好的方法学验证结果，与中国药典方法比较，杂质检出能力更强；特征未知杂质为2-(2,4-二氟苯基)-1,3-二(1H-1,2,4-三唑-1-基)-丁-2-醇。已经发现，本发明建立的方法简便、灵敏、专属性好、杂质检出能力强，能有效的反应药品质量。

背景技术

氟康唑(fluconazole)，分子式C13H12F2N6O，分子量306.27；化学名：α-(2,4-二氟苯基)-α-(1H-1,2,4-三唑-1-基甲基)-1H-1,2,4-三唑-1-基乙醇；英文化学名：1-(2,4-difluorophenyl)-1-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-1H-1,2,4-Triazole-1-ethanol；CAS号86386-73-4。

氟康唑是治疗真菌感染的一种药物，为广谱抗真菌药，对人和动物的真菌感染均有治疗作用，目前市场上有片剂、胶囊、粉针剂和注射液几种剂型。

氟康唑为白色或类白色结晶或结晶性粉末；无臭或微带特异臭，味苦。该品在甲醇中易溶，在乙醇中溶解，在二氯甲烷、水或醋酸中微溶，在乙醚中不溶。熔点为137～141℃。

口服制剂以片剂为例，氟康唑片的适应症包括：1.念珠菌病：用于治疗口咽部和食道念珠菌感染；播散性念珠菌病，包括腹膜炎、肺炎、尿路感染等；念珠菌外阴阴道炎。尚可用于骨髓移植患者接受细胞毒类药物或放射治疗时，预防念珠菌感染的发生。2.隐球菌病：用于治疗脑膜以外的新型隐球菌病；治疗隐球菌脑膜炎时，本品可作为两性霉素B联合氟胞嘧啶初治后的维持治疗药物。3.球孢子菌病。4.用于接受化疗、放疗和免疫抑制治疗患者的预防治疗。5.本品亦可替代伊曲康唑用于芽生菌病和组织胞浆菌病的治疗。其用法用量为：口服；成人(1)播散性念珠菌病：首次剂量0.4g，以后一次0.2g，一日1次，至少4周，症状缓解后至少持续2周；(2)食道念珠菌病：首次剂量0.2g，以后一次0.1g，一日1次，持续至少3周，症状缓解后至少持续2周；根据治疗反应，也可加大剂量至一次0.4g，一日1次；(3)口咽部念珠菌病：首次剂量0.2g，以后一次0.1g，一日1次，疗程至少2周；(4)念珠菌外阴阴道炎：单剂量，0.15g。

注射制剂以注射液为例，氟康唑的注射液适应症是主要用于以下适应症中病情较重的患者：1.念珠菌病：用于治疗口咽部和食道念珠菌感染；播散性念珠菌病，包括腹膜炎、肺炎、尿路感染等；念珠菌外阴阴道炎。尚可用于骨髓移植患者接受细胞毒类药物或放射治疗时，预防念珠菌感染的发生。2.隐球菌病：用于治疗脑膜以外的新型隐球菌病；治疗隐球菌脑膜炎时，本品可作为两性霉素B联合氟胞嘧啶初治后的维持治疗药物。3.球孢子菌病。4.本品亦可替代伊曲康唑用于芽生菌病和组织胞浆菌病的治疗。

氟康唑属吡咯类抗真菌药。抗真菌谱较广。口服及静注该品对人和各种动物真菌感染，如念珠菌感染(包括免疫正常或免疫受损的人和动物的全身性念珠菌病)、新型隐球菌感染(包括颅内感染)、糠秕马拉色菌、小孢子菌属、毛癣菌属、表皮癣菌属、皮炎芽生菌、粗球孢子菌(包括颅内感染)及荚膜组织胞浆菌、斐氏着色菌、卡氏枝孢霉等有效。该品的体外抗菌活性明显低于酮康唑，但该品的体内抗菌活性明显高于体外作用。该品的作用机制主要为高度选择性干扰真菌的细胞色素P-450的活性，从而抑制真菌细胞膜上麦角固醇的生物合成。氟康唑对真菌依赖的细胞色素P-450酶具有高度选择性。一日服用该品0.5g，连续28天，已证明对男性的血浆睾丸素浓度及育龄期妇女的甾体激素浓度均无影响。

氟康唑口服吸收良好，且不受食物、抗酸药、H2受体阻滞药的影响。空腹口服该品约可吸收给药量的90％。单次口服该品100mg，平均血药峰浓度(Cmax)为4.5～8mg/L。表观分布容积(Vd)接近于体内水分总量。该品血浆蛋白结合率低(11％～12％)，在体内广泛分布于皮肤、水疱液、腹腔液、痰液等组织体液中，尿液及皮肤中药物浓度约为血药浓度的10倍；水疱皮肤中约为2倍；唾液、痰、水疱液、指甲中与血药浓度接近；脑膜炎症时，脑脊液中该品的浓度可达血药浓度的54％～85％。该品少量在肝脏代谢。主要自肾排泄，以原形自尿中排出给药量的80％以上。血消除半衰期(t1/2？)为27～37小时，肾功能减退时明显延长。血液透析或腹膜透析可部分清除该品。

氟康唑是三唑类的第三代抗真菌药，也是较少的水溶性抗真菌药之一。该品种由辉瑞公司于1981年首先研发成功，1992年国内开始生产并用于临床。《中国药典》2010年版和USP38、BP2015、EP8.0中均已收载本品种[中国药典2010年版二部p547；USP38p3509；BP2015p969；EP8.0p2245]，据文献报道[Vaijanath G.Dongre,Pravin P.Karmuse,Pradeep D.Ghugre,et al.Preparative isolation and structuralelucidation of impurities in fluconazole by LC/MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal,2006,42(3):334；VaijanathG.Dongre,Pradeep D.Ghugare,Pravin P.Karmuse,et al.Isolation and structural identification of animpurity in fluconazole bulk drug substance[J].J Pharm Biomed Anal,2007,45(3):422；Houda Bourichi,Youness Brik,Philipe Hubert,et al.Solid-state characterization and impurities determination of fluconazolgeneric products marketed in Morocco[J].J Pharm Anal,2012,2(6):412]，本品含有多个潜在的合成工艺杂质，原研厂注射剂执行的进口药品注册标准[JX20130312.进口药品注册标准.2013]中将BP2015列出的工艺杂质A和B(二者结构式见下文)作为特定杂质控制。2010年版中国药典方法不能将这两个杂质完全分开，且样品中含有的弱极性杂质用等度洗脱方式不能完全检出。

氟康唑及其杂质A、杂质B的结构式如下：

因此，本领域技术人员仍然期待有新的方法来检测和评价氟康唑原料药的质量状况，特别是，本领域技术人员仍然期待有新的方法来分析氟康唑的有关物质，例如对其特征未知杂质(其在本发明中亦可称为杂质X)用LC-MS和NMR确证结构，并确定新发现的氟康唑杂质的具体化学结构。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的方法来检测和评价氟康唑原料药的质量状况，特别是，提供一种新的方法来分析氟康唑的有关物质，例如对其特征未知杂质(其在本发明中亦可称为杂质X)用LC-MS和NMR确证结构，并确定新发现的氟康唑杂质的具体化学结构。已经出人意料地发现使用本发明HPLC法可以有效地分离、分析所涉及的杂质化合物。

为此，本发明第一方面提供了一种使用高效液相色谱法测定氟康唑原料药或者包含氟康唑的制剂中有关物质的方法，所述高效液相色谱法的色谱条件是：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(其粒度例如是3μm、5μm、或10μm；其内径例如是4.6mm；其长度例如是100～300mm，例如150～300mm，例如150mm、200mm、250mm、300mm；典型的，其粒度是5μm，内径是4.6mm，长度是250mm；例如是CERI L-column ODS柱)；

流动相：使用流动相A和流动相B两者混合作为流动相，进行梯度洗脱；流动相A为0.01mol/L醋酸钠溶液与甲醇以体积比95:5比例的混合液(所述0.01mol/L醋酸钠溶液的pH值为5.0，例如所述0.01mol/L醋酸钠溶液使用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)，流动相B为乙腈与甲醇以体积比60:40比例的混合液；所述梯度洗脱为：0～15min，22％B，15～75min，22％→42％B，75～95min，42％→60％B，95～96min，60％→22％B，96～105min，22％B；

流动相流速：1.0mL/min；

检测波长：261nm；

进样量：100μL；

柱温：30℃。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，使用所述色谱条件测定，以氟康唑、杂质A、杂质B三种对照品配制的溶液所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，其中杂质A的相对保留时间为0.55±0.05，杂质B的相对保留时间为0.50±0.05，杂质B比杂质A先出峰并且二者的分离度大于1.5(例如分离度大于2.0，例如分离度大于2.5)。如上文所述，杂质A、杂质B二者是已知。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，使用所述色谱条件测定，以氟康唑、特征未知杂质二种对照品配制的溶液所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，其中特征未知杂质的相对保留时间为2.50±0.20(例如相对保留时间为2.50±0.15，例如相对保留时间为2.50±0.10)。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，使用所述色谱条件测定，以氟康唑、杂质A、杂质B特征未知杂质四种对照品配制的溶液所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，其中杂质A的相对保留时间为0.55±0.05，杂质B的相对保留时间为0.50±0.05，特征未知杂质的相对保留时间为2.50±0.20(例如相对保留时间为2.50±0.15，例如相对保留时间为2.50±0.10)，杂质B比杂质A先出峰并且二者的分离度大于1.5(例如分离度大于2.0，例如分离度大于2.5)。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述特征未知杂质是具有如下化学结构的化合物：

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其还包括如下溶液配制的步骤：

对照溶液的配制：精密称取氟康唑对照品、杂质A对照品、杂质B对照品和任选的特征未知杂质对照品各适量，加流动相A和流动相B以体积比75～80：20～25比例的混合液(例如以体积比78:22比例的混合液)溶解并稀释制成各成分各约含5μg/mL的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的配制：精密称取相当于氟康唑约10mg的氟康唑原料药或者包含氟康唑的制剂，置10mL量瓶中，加流动相A和流动相B以体积比75～80：20～25比例的混合液(例如以体积比78:22比例的混合液)溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其还包括如下测定和计算的步骤：精密吸取规定量的对照溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪中，按规定的色谱条件进行分离分析；对于供试品溶液所得色谱图，如果杂质存在的话，其中的杂质A和杂质B按外标法以峰面积计算其相对于氟康唑的百分含量，特征未知杂质以及其它杂质用主成分为外标以峰面积计算其相对于氟康唑的百分含量，算得各杂质相对于氟康唑的百分含量以及全部杂质总和相对于氟康唑的百分含量。

在本发明中，短语“相对于氟康唑的百分含量”是指，对于某一供试品(不论是原料还是添加了辅料的制剂)，在该物料中，所述杂质的重量相对于氟康唑的含量的百分数，例如某1g制剂物料，经测定其中包含100mg的氟康唑，另经测定该1g制剂物料中杂质A的量为0.2mg，则杂质A相对于氟康唑的百分含量为0.2％。这种计算杂质的方式是有利的，其不受制剂因添加辅料而改变其中氟康唑百分比例的影响。

进一步地，本发明第二方面提供了制备特征未知杂质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供以下制备型色谱条件：使用型号为YMC-Pack ODS-A、规格为250mm×10mm，5μm的色谱梯形；流动相为水和乙腈以体积比63:37比例的混合液；流速为2.0mL/min；检测波长为261nm；进样量为200μL；

(2)取经检测含有所述特征未知杂质的氟康唑原料药，用0.01mol/L醋酸铵溶液(用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)：甲醇：乙腈以体积比47.5：22.5：30比例的混合液为溶剂将该原料药溶解并制成浓度为100mg/mL的溶液，滤过，进样分析，每次进样洗脱时间至少50min；多次进样洗脱并收集相对于氟康唑峰而言相对保留时间在1.27±0.05处(特别是相对保留时间在1.27±0.03处)色谱峰的流出液，合并这些流出液，于60℃下旋转蒸发至干，得到特征未知杂质。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述特征未知杂质是具有如下化学结构的化合物：

在本发明上述制备方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

说明书附图

图1：氟康唑原料样品原液及强制破坏的色谱图；图中，Ⅰ.未破坏样品，Ⅱ.酸破坏，Ⅲ.碱破坏，Ⅳ.光照破坏，Ⅴ.加热破坏，Ⅵ.氧化破坏；对于各色谱峰：1.杂质B，2.杂质A，3.氟康唑，4.特征未知杂质。

图2：对照品和两个厂家原料药样品的HPLC色谱图；其中，Ⅰ.对照品，Ⅱ.A厂样品，Ⅲ.B厂样品；1.杂质B，2.杂质A，3.氟康唑，4.A厂样品特征未知杂质，5.B厂样品典型未知杂质。

图3：中国药典方法的样品色谱图(1.杂质B，2.杂质A，3.氟康唑)。

图4：特征未知杂质的半制备液相色谱图；其中，1.氟康唑，2.特征未知杂质。

图5：特征未知杂质的质谱图。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

下文制备步骤为了举例的目的，并基于各举例的可比较性而作了某些具体描述，本领域技术人员根据已有知识完全可以从中概括得到本发明第一方面和/或第二方面的方法。

在本发明中，使用到以下一些典型的仪器与试药(当然，众所周知的，根据本发明的要求来改用其它品牌的仪器也是可行的)：

Waters e2695/2998高效液相色谱仪，Agilent 1100高效液相色谱仪，Thermo UltiMate 3000-QExactive高效液相色谱-高分辨质谱联用仪，Bruker 600MHz核磁共振仪，Heidolph Laborota 4001旋转蒸发仪，METTLER TOLEDO XA205电子天平；

氟康唑原料(国内A厂，批号2012-09-010、2012-09-011、2012-09-012；B厂，批号FCZ01303007、FCZ01303008、FCZ01303009)，氟康唑对照品(中国食品药品检定研究院，批号100314-201204)；杂质A对照品(美国辉瑞公司，批号02289-QCS-13)；杂质B对照品(美国辉瑞公司，批号99150-QCAS-7)。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。下文使用到的用于检测的氟康唑氯化钠注射液生产厂家未给予详列。下文各试验中涉及的特征未知杂质已在下文制备得到并得到结构确证。

实施例1：氟康唑原料药或其制剂的有关物质的检测

1、色谱条件

色谱柱：CERI L-column ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)；

流动相A：0.01mol/L醋酸钠溶液(用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)-甲醇(95:5)，流动相B：乙腈-甲醇(60:40)，梯度洗脱：0～15min，22％B，15～75min，22％→42％B，75～95min，42％→60％B，95～96min，60％→22％B，96～105min，22％B；

流速：1.0mL/min；

检测波长：261nm；

进样量：100μL；

柱温：30℃。

2、溶液的制备

对照溶液的配制：精密称取氟康唑对照品、杂质A对照品、杂质B对照品和特征未知杂质对照品(在该杂质量极低的情况下例如测定不到的情况下可以不加该特征未知杂质)各适量，加流动相A和流动相B以体积比78:22比例的混合液溶解并稀释制成各成分各约含5μg/mL的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的配制：精密称取相当于氟康唑约10mg的氟康唑原料药或者包含氟康唑的制剂，置10mL量瓶中，加流动相A-流动相B(78:22)溶解并稀释至刻度，摇匀。

3、测定和计算

精密吸取规定量的对照溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪中，按规定的色谱条件进行分离分析；对于供试品溶液所得色谱图，如果杂质存在的话，其中的杂质A和杂质B按外标法以峰面积计算其相对于氟康唑的百分含量，特征未知杂质以及其它杂质用主成分为外标以峰面积计算其相对于氟康唑的百分含量，算得各杂质相对于氟康唑的百分含量以及全部杂质总和相对于氟康唑的百分含量。

实施例2：方法学验证

针对实施例1的HPLC法，进行方法学验证，具体如下。

1、专属性试验

取A厂批号2012-09-010的样品约0.25g，置25mL量瓶中，加流动相A-流动相B(78:22)溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取5份，各1mL，分别置10mL量瓶中，进行如下处理：(1)酸破坏：加1mol/L盐酸溶液1mL，60℃水浴加热15h，加1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和；(2)碱破坏：加1mol/L氢氧化钠溶液1mL，60℃水浴加热15h，加1mol/L盐酸溶液1mL中和；(3)光破坏：在5000lx照度下放置24h；(4)热破坏：60℃水浴加热15h；(5)氧化破坏：加6％过氧化氢溶液1mL，60℃水浴加热15h。将上述5种破坏的溶液用流动相A-流动相B(78:22)稀释至刻度，摇匀，按实施例1所述HPLC法进样分析，结果见图1；图中，Ⅰ.未破坏样品，Ⅱ.酸破坏，Ⅲ.碱破坏，Ⅳ.光照破坏，Ⅴ.加热破坏，Ⅵ.氧化破坏；对于各色谱峰：1.杂质B，2.杂质A，3.氟康唑，4.特征未知杂质。结果表明，氟康唑仅在氧化破坏条件下产生的降解杂质较多，各杂质峰均能与主成分峰充分分离，表明本法的专属性良好。

2、线性和范围

精密称取氟康唑对照品、杂质A和杂质B对照品各约10mg，分别置100mL量瓶中，加流动相A-流动相B(78:22)溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为氟康唑、杂质A和杂质B对照品储备液。精密量取各杂质对照品储备液适量，加流动相A-流动相B(78:22)分别稀释制成氟康唑浓度为0.1022、0.3066、1.022、2.044、5.110、10.22、20.44μg/mL的系列溶液，杂质A浓度为0.1030、0.3089、1.030、2.060、5.149、10.30、20.60μg/mL的系列溶液，杂质B浓度为0.008256、0.04128、0.1032、0.3096、1.032、5.160、20.64μg/mL的系列溶液。按实施例1所述HPLC色谱条件进样测定，以浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，氟康唑、杂质A和杂质B的回归方程分别为：

Y＝1.171×10⁴X+3.560，r＝1.000

Y＝1.130×10⁴X-33.18，r＝1.000

Y＝1.113×10⁵X+1314，r＝1.000

结果表明，氟康唑和杂质A在0.1～20μg/mL浓度范围内，杂质B在0.008～20μg/mL浓度范围内线性关系良好。

3、检测限和定量限

取对照溶液逐级稀释，按实施例1所述HPLC色谱条件进样测定，结果氟康唑、杂质A和杂质B的检测限(S/N＝3)分别为3.1、3.1、0.25ng，定量限(S/N＝10)分别为为10.2、10.3、0.83ng。

4、进样精密度

取对照溶液，按实施例1所述HPLC色谱条件重复进样6次，测得氟康唑、杂质A和杂质B峰面积的RSD(n＝6)分别为0.25％、0.14％、0.04％。

5、重复性

取A厂批号2012-09-010的样品，按实施例1所述方法平行制备6份供试品溶液，按实施例1所述HPLC色谱条件进样分析，测得杂质A、杂质B、特征未知杂质和杂质总量的平均结果(n＝6)分别为0.15％、0.0070％、0.19％、1.24％，RSD分别为1.24％、1.19％、0.66％、1.41％。

6、杂质A、B的回收率

精密称取杂质A、B对照品各约10mg，置200mL量瓶中，加流动相A-流动相B(78:22)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品储备液。另精密称取A厂批号2012-09-010的样品约10mg，共9份，分别置10mL量瓶中，平均分成3组，分别加入杂质对照品储备液0.5、1.0、1.5mL，用流动相A–流动相B(78:22)溶解并稀释至刻度，摇匀，按实施例1所述HPLC色谱条件进样测定，测定杂质A、B的平均回收率(n＝9)分别为101.64％和100.65％，RSD分别为0.63％和0.49％。

7、溶液的稳定性

取A厂批号2012-09-010的样品，按实施例1所述方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、18、24h进样测定，检出的杂质个数不变，杂质A、杂质B、特征未知杂质和主成分峰面积的RSD分别为0.37％、0.34％、0.44％、0.12％，表明溶液在24h内稳定。

8、样品测定

取A厂和B厂两个厂家的6批原料药样品，按本实施例和实施例1建立的方法测定，色谱图见图2；其中，Ⅰ.对照品，Ⅱ.A厂样品，Ⅲ.B厂样品；1.杂质B，2.杂质A，3.氟康唑，4.A厂样品特征未知杂质，5.B厂样品典型未知杂质。杂质A、B按外标法计算，其他杂质用主成分为外标计算，结果见表1。

表1：有关物质测定结果(％)

厂家	批号	杂质A	杂质B	特征未知杂质	杂质总量
						A	2012-09-010	0.15	0.0070	0.19	1.24
	2012-09-011	0.15	0.0069	0.19	1.22
							2012-09-012	0.10	0.0068	0.17	1.34
B	FCZ01303007	0.50	0.0095	0.021	0.71
							FCZ01303008	0.48	0.0077	0.022	0.67
	FCZ01303009	0.50	0.0081	0.021	0.68

9、与中国药典方法测定结果的比较

按2010年版中国药典二部547页氟康唑原料药的有关物质检测方法，测定A、B两个厂家的6批样品，典型色谱图见图3(1.杂质B，2.杂质A，3.氟康唑)。结果显示该方法对各批原料药的杂质A、B均不能完全分开，主峰后极性小的杂质不能完全洗脱出，因此，检出的杂质个数及总量低于本发明实施例1和实施例2建立的方法，详见表2。

表2：两种方法的测定结果比较

本发明人在补充的试验中，分别使用欧洲药典EP8.0版2245页所载氟康唑有关物质检测方法、美国药典USP38版所载氟康唑中的“Organic Impurities,Procedure 1”法测定上述A厂和B厂的样品，结果检测出的杂质个数明显低于本发明实施例1和实施例2的方法；用USP38版所载氟康唑中的“OrganicImpurities,Procedure 2”法测定，A厂样品中主成分后洗脱出的多个未知杂质之间的分离效果不好，无法准确定量，这种结果是完全出人意料的。

10、制剂的有关物质测试

根据本发明实施例1和本实施例2的方法，对从市场上获得的六个厂家生产的各一批氟康唑氯化钠注射液进行有关物质测定，结果各批样品的有关物质分离效果良好，其中三批最大未知杂质的相对保留时间与本发明涉及的特征未知杂质相同，即有三个厂商的产品的最大未知杂质为本发明发现的特征未知杂质。这种发现是有重要意义的，原因在于监测具有显著含量的杂质对于原料药及其制剂的质量控制是极具意义的。

另外，根据本发明实施例1和本实施例2，以氟康唑、杂质A、杂质B、特征未知杂质四种对照品配制的溶液以及测试的全部原料药和制剂试样所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，如果这些杂质存在，其中杂质A的相对保留时间均在0.55±0.05范围内，杂质B的相对保留时间在0.50±0.05范围内，特征未知杂质的相对保留时间均2.50±0.15范围内，杂质B比杂质A先出峰并且二者的分离度大于2.0，均在2.6～3.4范围内。

实施例3：杂质制备和结构分析

针对上文相对保留时间在约2.50处的特征未知杂质，在本实施例中对其进行制备，接着对其进行结构分析。

1、杂质的制备

色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250mm×10mm，5μm)；流动相：水–乙腈(63:37)；流速：2.0mL/min；检测波长：261nm；进样量：200μL。

取A厂批号2012-09-010的样品，用流动相A–流动相B(50:50)溶解制成100mg/mL的溶液，流动相A：0.01mol/L醋酸铵溶液(用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)-甲醇(95:5)，流动相B：乙腈–甲醇(60:40)；滤过，进样分析，多次收集保留时间约13.9min峰的流出液(图4，相对于氟康唑的相对保留时间约为1.27，多次试验均在1.27±0.05范围内；图中，1.氟康唑，2.特征未知杂质)，60℃旋转蒸发至干，经HPLC分析纯度为93.2％(按面积归一化法计算)。

2、特征未知杂质的结构分析

(1)采用LC-MS法进行分析

色谱柱：CERI L-column ODS柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A：0.01mol/L醋酸铵溶液(用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)-甲醇(95:5)，流动相B：乙腈-甲醇(60:40)，梯度洗脱：0～15min，22％B，15～75min，22％→42％B，75～95min，42％→60％B，95～96min，60％→22％B，96～105min，22％B；流速：1.0mL/min；检测波长：261nm；进样量：50μL；柱温：30℃。质谱条件：采用HESI离子化方式，正离子模式，离子源前进样分流比3:1；加热器温度：100℃；喷雾电压：3kV；毛细管温度：350℃；鞘气：40arb，辅助气：10arb；扫描模式：一级质谱全扫描；分辨率：70000FWHM；扫描范围：m/z100～700。

取A厂批号2012-09-010的样品0.2g，置10mL量瓶中，加流动相A–流动相B(78:22)溶解并稀释至刻度，摇匀，进样分析，得到的HPLC色谱图与用“2.1.1”项下条件的图谱相似，可明确定位特征未知杂质，质谱图见图5，该杂质的准分子离子峰为m/z321.12671，推测元素组成为C₁₄H₁₅F₂N₆O(321.12699)，计算值与测定值偏差为0.88ppm，与氟康唑比较，相对分子质量多14，可能为一个亚甲基。

(2)采用核磁共振波谱(NMR)分析

特征未知杂质的¹H-NMR、¹³C-NMR信号与氟康唑核磁文献数据[Vaijanath G.Dongre,Pravin P.Karmuse,Pradeep D.Ghugre,et al.Preparative isolation and structural elucidation of impurities influconazole by LC/MS/MS[J].J Pharm Biomed Anal,2006,42(3):334；Vaijanath G.Dongre,Pradeep D.Ghugare,Pravin P.Karmuse,et al.Isolation and structural identification of an impurity in fluconazole bulkdrug substance[J].J Pharm Biomed Anal,2007,45(3):422]对比，特征未知杂质高场区出现甲基信号，与液质推断结果相同，再根据HMBC、HSQC、H-HCOSY谱对特征未知杂质结构和甲基位置进行确认(见下文结构式)，并对特征未知杂质的¹H-NMR、¹³C-NMR信号进行了归属，结果如下：

¹H-NMR(600MHz,CD₃CN)信号归属与上述文献数据对比：δ4.88(1H,d,J＝18，H-2a),δ3.78(1H,d,J＝18，H-2b),δ5.23(1H,t,J＝12,H-3),δ1.31(3H,d,J＝12,H-4),δ6.96(1H,m,J＝6.0,12.0,H-5),δ6.86(1H,m,J＝6.0,12.0,H-6),δ7.40(1H,m,J＝6.0,12.0,H-7),δ7.99(1H,s,H-11),δ8.45(1H,s,H-12),δ7.58(1H,s,H-13),δ7.94(1H,s,H-14)。

¹³C-NMR(600MHz,CD₃CN)信号归属与上述文献数据对比：δ56(C-1),δ78(C-2),δ60(C-3),δ16(C-4),δ105(C-5),δ165(C-6),δ112(C-7),δ131(C-8),δ124(C-9),δ161(C-10),δ152(C-11),δ145(C-12),δ152(C-13),δ146(C-14)。

根据上述波谱分析，确认氟康唑的特征未知杂质结构如下(其中标注的部分碳原子编号是示意性的)：

可见，上述特征未知杂质(或称为杂质X)与氟康唑的区别在于其中3位多了一个甲基，即2-(2,4-二氟苯基)-1,3-二(1H-1,2,4-三唑-1-基)-丁-2-醇。

在本发明中，使用二极管阵列检测器进行分析，采集各主要杂质的紫外光谱图，杂质A、2-(2,4-二氟苯基)-1,3-二(1H-1,2,4-三唑-1-基)-丁-2-醇和部分杂质与氟康唑的紫外光谱图相似，均在261nm波长处有最大吸收，杂质B和其他杂质在此波长有明显吸收，因此选择检测波长为261nm。

专属性试验考察时，强制降解产生的杂质除保留时间约为17.5min的杂质(含量约0.03％)外，其他杂质在样品中几乎均未检出，表明氟康唑的杂质主要在工艺过程中产生。根据样品测定结果，两个厂家的杂质谱存在差异。典型的A厂产品的杂质个数较多，杂质总量超出中国药典限度1.0％，其生产工艺需要改进。

采用2根色谱柱Phenomenex Gemini(250mm×4.6mm，5μm)和Shimadzu Shim-pack VP-ODS(250mm×4.6mm，5μm)进行耐用性试验，分析两个厂家的样品溶液，结果主成分及各杂质的保留时间基本一致，分离效果良好。

本发明人在进行LC-MS试验时，曾进行二级质谱全扫面分析，得到特征未知杂质主要碎片离子峰的质荷比均比氟康唑的主要碎片离子峰多14，不能确定亚甲基的位置，因此，用制备液相收集杂质，进行了NMR分析，确定结构。

Claims (10)

1.使用高效液相色谱法测定氟康唑原料药或者包含氟康唑的制剂中有关物质的方法，所述高效液相色谱法的色谱条件是：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(其粒度例如是3μm、5μm、或10μm；其内径例如是4.6mm；其长度例如是100～300mm，例如150～300mm，例如150mm、200mm、250mm、300mm；典型的，其粒度是5μm，内径是4.6mm，长度是250mm；例如是CERI L-column ODS柱)；

流动相：使用流动相A和流动相B两者混合作为流动相，进行梯度洗脱；流动相A为0.01mol/L醋酸钠溶液与甲醇以体积比95:5比例的混合液(所述0.01mol/L醋酸钠溶液的pH值为5.0，例如所述0.01mol/L醋酸钠溶液使用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)，流动相B为乙腈与甲醇以体积比60:40比例的混合液；所述梯度洗脱为：0～15min，22％B，15～75min，22％→42％B，75～95min，42％→60％B，95～96min，60％→22％B，96～105min，22％B；

流动相流速：1.0mL/min；

检测波长：261nm；

进样量：100μL；

柱温：30℃。

2.根据权利要求1的方法，使用所述色谱条件测定，以氟康唑、杂质A、杂质B三种对照品配制的溶液所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，其中杂质A的相对保留时间为0.55±0.05，杂质B的相对保留时间为0.50±0.05，杂质B比杂质A先出峰并且二者的分离度大于1.5(例如分离度大于2.0，例如分离度大于2.5)。

3.根据权利要求1的方法，使用所述色谱条件测定，以氟康唑、特征未知杂质二种对照品配制的溶液所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，其中特征未知杂质的相对保留时间为2.50±0.20(例如相对保留时间为2.50±0.15，例如相对保留时间为2.50±0.10)。

4.根据权利要求1的方法，使用所述色谱条件测定，以氟康唑、杂质A、杂质B特征未知杂质四种对照品配制的溶液所测试的色谱图中，相对于氟康唑峰而言，其中杂质A的相对保留时间为0.55±0.05，杂质B的相对保留时间为0.50±0.05，特征未知杂质的相对保留时间为2.50±0.20(例如相对保留时间为2.50±0.15，例如相对保留时间为2.50±0.10)，杂质B比杂质A先出峰并且二者的分离度大于1.5(例如分离度大于2.0，例如分离度大于2.5)。

5.根据权利要求1的方法，其中所述特征未知杂质是具有如下化学结构的化合物：

6.根据权利要求1的方法，其还包括如下溶液配制的步骤：

对照溶液的配制：精密称取氟康唑对照品、杂质A对照品、杂质B对照品和任选的特征未知杂质对照品各适量，加流动相A和流动相B以体积比75～80：20～25比例的混合液(例如以体积比78:22比例的混合液)溶解并稀释制成各成分各约含5μg/mL的溶液，摇匀，即得；

供试品溶液的配制：精密称取相当于氟康唑约10mg的氟康唑原料药或者包含氟康唑的制剂，置10mL量瓶中，加流动相A和流动相B以体积比75～80：20～25比例的混合液(例如以体积比78:22比例的混合液)溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。

7.根据权利要求1的方法，其还包括如下测定和计算的步骤：精密吸取规定量的对照溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪中，按规定的色谱条件进行分离分析；对于供试品溶液所得色谱图，如果杂质存在的话，其中的杂质A和杂质B按外标法以峰面积计算其相对于氟康唑的百分含量，特征未知杂质以及其它杂质用主成分为外标以峰面积计算其相对于氟康唑的百分含量，算得各杂质相对于氟康唑的百分含量以及全部杂质总和相对于氟康唑的百分含量。

8.制备特征未知杂质的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供以下制备型色谱条件：使用型号为YMC-Pack ODS-A、规格为250mm×10mm，5μm的色谱梯形；流动相为水和乙腈以体积比63:37比例的混合液；流速为2.0mL/min；检测波长为261nm；进样量为200μL；

(2)取经检测含有所述特征未知杂质的氟康唑原料药，用0.01mol/L醋酸铵溶液(用1mol/L醋酸溶液调节pH值至5.0)：甲醇：乙腈以体积比47.5：22.5：30比例的混合液为溶剂将该原料药溶解并制成浓度为100mg/mL的溶液，滤过，进样分析，每次进样洗脱时间至少50min；多次进样洗脱并收集相对于氟康唑峰而言相对保留时间在1.27±0.05处色谱峰的流出液，合并这些流出液，于60℃下旋转蒸发至干，得到特征未知杂质。

9.根据权利要求8的方法，其中所述特征未知杂质是具有如下化学结构的化合物：

10.根据权利要求8的方法，其中步骤(2)中，多次进样洗脱并收集相对于氟康唑峰而言相对保留时间在1.27±0.03处色谱峰的流出液。