CN104515816B - 一种安立生坦原料及制剂有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种安立生坦原料及制剂中的有关物质的检测方法，该方法是采用高效液相色谱法进行的，包括下述步骤：（1）配制安立生坦样品溶液；和（2）将步骤（1）所得样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；其中，所述高效液相色谱法的色谱柱固定相填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶；流动相A的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积=30～50：50～70；流动相B的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积=50～80：20～50。本发明的检测方法在同一液相条件下测定安立生坦原料或制剂中的有关物质，所述检测方法操作简便、分离度高、测定方法专属性强、检测结果准确可信。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域。具体地说，本发明涉及一种采用高效液相色谱法测定安立生坦原料及制剂有关物质的检测方法。
背景技术
安立生坦（ambrisentan，Letairis）是由美国GileadScience公司开发的一种选择性内皮素受体A（ETAR）拮抗剂，其化学名为(+)-(2S)-2-[（4，6-二甲基嘧啶-2-基）氧基]-3-甲氧3，3-二苯丙酸，英文化学名：(2S)-2-[(4，6-Dimethylpyrimidin-2-yl)oxy]-3-methoxy-3，3-diphenylpropanoicacid，化学结构如下：
其分子量为378.42，分子式为C22H22N2O4。
安立生坦可强效抑制内皮抑素所致血管收缩，于2007年6月15日获得美国FDA批准，口服用于治疗肺动脉高血压，可以改善运动能力，延迟其恶化。目前上市的有普通片剂（规格为5mg和10mg）和缓释片（规格为23mg）。
肺动脉高压（pulmonaryarterialhypertension，PAH）是一种少见的进行性肺毛细血管前肺血管病变所引起的肺动脉压力持久升高，为罕见的慢性综合病症。包括特发性PAH（IPAH），肺广泛性病变引起的PAH，肺小动脉缺氧性痉挛、左心室疾病相关性、低氧和肺疾病、慢性血栓形成栓塞等所引起的PAH等，最终导致进行性血管阻力增加和右心衰竭。肺动脉高压是我国临床常见疾病，其致残和致死率颇高，也是严重危害患者身心健康、增加社会医疗负担的重大疾病。
近年来，肺血管内皮素（endothelin，ET）系统成为治疗PAH的新靶点，其中ET受体拮抗药已成为口服治疗重度PAH的一线药物，而安立生坦则是最新型的ET受体拮抗药。安立生坦经口服给药，可吸收并进入体循环；给予1天药物剂量，药效达稳态持续3～4天；PAH患者在口服安立生坦5mg后，终末半衰期为15h，长期服药，达稳态时其谷浓度是其峰浓度的15％，有效半衰期9h；安立生坦主要以原型或者糖苷化的形式存在于肝脏和血浆中，代谢过程主要是肝脏代谢Ⅱ（葡萄糖苷酸化阶段），其次是肝脏代谢I（羟基化反应阶段）。
目前，安立生坦原料合成工艺中，最终原料产品中可能含有的起始原料、中间体及降解的已知杂质共有7个，分别为：2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸（SRS1）、（s）-1-（4-硝基苯基）乙胺（SRS2）、3，3-二苯基-2，3-环氧丙酸甲酯（SRS3）、2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸甲酯（SRS4）、4，6-二甲基-2-甲基磺酰基嘧啶（SRS5）、4，6-二甲基-2-（2，2-二苯基-乙烯氧基）嘧啶（DP1）和二苯甲酮。见下式：
本发明所涉及的一种安立生坦原料及制剂有关物质的检测方法主要是针对以上七种安立生坦已知杂质进行有效的检测和分离。其中，（s）-1-（4-硝基苯基）乙胺（SRS2）、4，6-二甲基-2-甲基磺酰基嘧啶（SRS5）和二苯甲酮为起始原料；2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸（SRS1）、3，3-二苯基-2，3-环氧丙酸甲酯（SRS3）和2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸甲酯（SRS4）为合成中的中间体；4，6-二甲基-2-（2，2-二苯基-乙烯氧基）嘧啶（DP1）为降解产物。
目前，中国药典及国外药典未收录安立生坦原料及制剂有关物质的测定方法。在已公开的专利中，未查询到相关有关物质的检测条件。中国专利申请CN102219748A公开了一种无定型安贝生坦的制备方法；另一中国专利申请CN102276536A公开了一种光学纯的安倍生坦和光学纯的达芦生坦的制备方法。以上两个专利申请均未对安立生坦原料和制剂有关物质检测方法进行研究和阐述。此外，在PCT专利申请WO2010/091877A2（“ProcessForProducingAmbrisentan”）中，主要说明了一种安立生坦的合成工艺，以及安立生坦光学异构方面的测定，并未对有关物质测定方法进行研究。本发明所提供的检测方法可对上述七种杂质中的一种或多种进行有效检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用高效液相色谱法测定安立生坦原料及制剂有关物质的检测方法，从而准确有效测定安立生坦原料及制剂中的有关物质，精确控制产品质量。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明提供一种安立生坦原料及制剂中的有关物质的检测方法，其中所述安立生坦原料及制剂中的有关物质包括2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸、（S）-1-（4-硝基苯基）乙胺、3，3-二苯基-2，3-环氧丙酸甲酯、2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸甲酯、4，6-二甲基-2-甲基-磺酰嘧啶、4，6-二甲基-2-（2，2-二苯基-乙烯氧基）嘧啶和二苯甲酮中的一种或多种，该方法是采用高效液相色谱法进行的，包括下述步骤：
（1）配制安立生坦样品溶液，所述安立生坦样品溶液包括供试品溶液；和
（2）将步骤（1）所得样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；
其中，所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤：精密称取安立生坦原料或制剂样品，加稀释液溶解并稀释至安立生坦的浓度为0.2mg/ml～1mg/ml，得到供试品溶液；
所述高效液相色谱法的色谱柱固定相填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶，优选固定相填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相A的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积=30～50：50～70；
流动相B的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积=50～80：20～50。
优选地，其中流动相A的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积=45：55。
优选地，其中流动相B的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积=70：30。
优选地，所述高效液相色谱法的梯度洗脱顺序如下：
0-15分钟时流动相为：90～100体积%流动相A+0～10体积%流动相B；
15-20分钟时流动相为：45～55体积%流动相A+45～55体积%流动相B；
20-35分钟时流动相为：0～10体积%流动相A+90～100体积%流动相B；
35-40分钟时流动相为：90～100体积%流动相A+0～10体积%流动相B；
优选地，所述高效液相色谱法的梯度洗脱顺序如下：
0-15分钟时流动相为：100体积%流动相A+0体积%流动相B；
15-20分钟时流动相为：50体积%流动相A+50体积%流动相B；
20-35分钟时流动相为：0体积%流动相A+100体积%流动相B；
35-40分钟时流动相为：100体积%流动相A+0体积%流动相B。
优选地，所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾或磷酸氢二钠，优选为磷酸二氢钾；
优选地，磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM～50mM，优选为30mM；
优选地，流动相的pH值为2.0～7.0，优选流动相的pH值为3.5；和/或
优选地，流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选流动相的流速为1.0ml/min。
优选地，所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为25～40℃，优选30℃；
优选地，自动进样室温度为4～25℃，优选4℃；和/或
优选地，检测波长为220nm。
优选地，其中所述安立生坦样品溶液还包括自身对照溶液和/或杂质加样溶液；
所述自身对照溶液的制备方法包括下述步骤：精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，得到自身对照溶液；
所述杂质加样溶液的制备方法包括下述步骤：精密称取安立生坦对照品，加稀释液溶解并稀释至安立生坦的浓度为50μg/ml～5mg/ml，得到安立生坦对照品储备液；另分别取2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸、（S）-1-（4-硝基苯基）乙胺、3，3-二苯基-2，3-环氧丙酸甲酯、2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸甲酯、4，6-二甲基-2-甲基-磺酰嘧啶、4，6-二甲基-2-（2，2-二苯基-乙烯氧基）嘧啶和二苯甲酮标准品，精密称定，分别用稀释液溶解并稀释至浓度为50μg/ml～7.5mg/ml，得到各杂质对照品溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液和安立生坦各杂质对照品溶液母液，混合，加稀释液稀释，得到安立生坦杂质加样溶液；
优选地，其中所述稀释液为流动相A。
优选地，其中安立生坦供试品溶液中安立生坦的浓度为0.5mg/ml。
优选地，其中安立生坦各杂质对照品溶液母液浓度为75μg/ml。
优选地，在高效液相色谱法检测步骤（2）中，首先将自身对照溶液注入液相色谱仪，首先将对照溶液注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为记录仪满量程的20%；再将供试品溶液和杂质加样溶液分别注入液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；优选地，注入液相色谱仪中样品溶液的量均为20μl。
本发明的检测方法在同一液相条件下测定安立生坦原料或制剂中的有关物质，所述检测方法操作简便，安立生坦主峰保留时间较为合适，七种已知杂质均能得到有效检测，分离度高，测定方法专属性强，检测结果准确可信，为安立生坦原料和制剂质量控制、杂质研究提供了一种简便合理的检测方法。本发明方法适用于安立生坦原料或相关制剂有关物质的测定和样品检验。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1本发明所述安立生坦原料红外光谱图；
图2本发明所述安立生坦原料核磁谱图；
图3A实施例1中测定的安立生坦供试品溶液高效液相色谱图及数据列表；图3B实施例1中测定的安立生坦杂质加样溶液高效液相色谱图及数据列表；
图4A实施例2中测定的安立生坦供试品溶液高效液相色谱图及数据列表；图4B实施例2中测定的安立生坦杂质加样溶液高效液相色谱图及数据列表；
图5A实施例3中测定的安立生坦片杂质加样溶液高效液相色谱图及数据列表；图5B实施例3中测定的安立生坦片供试品溶液高效液相色谱图及数据列表；
图6A实施例4中测定的安立生坦杂质加样溶液典型色谱图及数据列表；图6B实施例4中测定的安立生坦供试品溶液典型色谱图及数据列表；
图7A实施例5中测定的安立生坦杂质加样溶液典型色谱图及数据列表；图7B实施例5中测定的安立生坦供试品溶液典型色谱图及数据列表；
图8A实施例6中测定的安立生坦片杂质加样溶液典型色谱图及数据列表；图8B实施例6中测定的安立生坦片供试品溶液典型色谱图及数据列表。
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一步解释与说明，但并不意味它以任何方式限制本发明的范围。
通过大量实验和探索，本发明的安立生坦原料及制剂有关物质的检测方法可以有效分离安立生坦与其相关七种已知杂质，方法可靠，测定准确。具体实验特征图谱见附图1-8。
以下实施例中所使用的试剂来源如下：
SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品分别由天津药物研究院合成、标化并提供；
安立生坦对照品和安立生坦原料样品由天津药物研究院合成、标化并提供；
安立生坦片来自葛兰素史克（加拿大）公司。
实施例1
本发明安立生坦原料有关物质的检测方法
1.检测仪器及检测条件
仪器：Waterse2695；Waters2489UV检测器
色谱柱：C18柱（5μ，4.6×250mm）
流动相：A：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=45：55（v/v）；
B：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=70：30（v/v）；
流速：1ml/min；检测波长：220nm；
柱温：30℃；自动进样室温度为4℃。
2.溶液配制：取安立生坦原料样品，加流动相A溶解制成每1ml中约含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
取安立生坦对照品约250.0mg，精密称定，置50mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为安立生坦对照品储备液；另分别取SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品各约7.5mg，精密称定，分置七个100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液1.0ml和各杂质溶液母液各1.0ml，置10ml容量瓶中混合，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制得安立生坦杂质加样溶液。
3.测定方法：取自身对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各20μl注入液相色谱仪，按照表1进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍。典型图谱见附图3。
表1梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（体积%） | 流动相B（体积%） |
| 0-15 | 100 | 0 |
| 15-20 | 50 | 50 |
| 20-35 | 0 | 100 |
| 35-40 | 100 | 0 |
附图3B中不同保留时间出峰位对应的样品名称见下表2。
表2
本发明方法操作简便，由附图3可见，安立生坦主峰保留时间13分钟左右，检测时间较为合适，七种已知杂质均能得到有效检测，分离度均大于2.0，测定方法专属性强，检测结果准确可信。
实施例2
本发明安立生坦制剂有关物质的检测方法
1.检测仪器及检测条件
仪器：Waterse2695；Waters2489UV检测器
色谱柱：C18柱（5μ，4.6×250mm）
流动相：A：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=45：55（v/v）
B：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=70：30（v/v）
流速：1ml/min；检测波长：220nm；
柱温：30℃；自动进样室温度为25℃；
2.溶液配制：取安立生坦片10片，置研钵中研磨均匀，精密称取片粉，置容量瓶中，加流动相A超声溶解，冷却用流动相A稀释至刻度，离心量取上清液，制成每1ml中约含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
取安立生坦对照品约250.0mg，精密称定，置50mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为安立生坦对照品储备液；另分别取SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品各约7.5mg，精密称定，分置七个100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液1.0ml和各杂质溶液母液各0.1ml，置10ml容量瓶中混合，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制得安立生坦杂质加样溶液。
3.测定方法：取自身对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各20μl注入液相色谱仪，按照表3进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍。见附图4。
表3梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（体积%） | 流动相B（体积%） |
| 0-15 | 100 | 0 |
| 15-20 | 50 | 50 |
| 20-35 | 0 | 100 |
| 35-40 | 100 | 0 |
从图中可以看出，安立生坦主成分峰在约13min出峰，在检测到的杂质峰中，16.754min的峰为未知杂质峰，而26.627min的峰为已知杂质DP1的峰；各杂质峰与主峰分离良好。
实施例3
本发明安立生坦原料有关物质的检测方法
1.检测仪器及检测条件
仪器：Waterse2695；Waters2489UV检测器
色谱柱：C8柱（5μ，4.6×250mm）
流动相：A：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=45：55（v/v）；
B：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=70：30（v/v）；
流速：1ml/min；检测波长：220nm；
柱温：30℃；自动进样室温度为4℃。
2.溶液配制：取安立生坦原料样品，加流动相A溶解制成每1ml中约含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
取安立生坦对照品约7.5mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为安立生坦对照品储备液；另分别取SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品各约7.5mg，精密称定，分置七个100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液1ml和各杂质溶液母液各1ml，置100ml容量瓶中混合，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制得安立生坦杂质加样溶液。
3.测定方法：取自身对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各20μl注入液相色谱仪，按照表4进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍。典型图谱见附图5。
表4梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（体积%） | 流动相B（体积%） |
| 0-15 | 100 | 0 |
| 15-20 | 50 | 50 |
| 20-35 | 0 | 100 |
| 35-40 | 100 | 0 |
由图5可以看出，色谱柱为C8柱（辛烷基硅烷键合硅胶柱）条件下，各杂质和主峰分离度最小为2.32，符合分离要求。
实施例4
本发明安立生坦制剂有关物质的检测方法
1.检测仪器及检测条件
仪器：Waterse2695；Waters2489UV检测器
色谱柱：C18柱（5μ，4.6×250mm）
流动相：A：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=30：70（v/v）
B：乙腈：30mM磷酸二氢钾（磷酸调至pH3.5）=80：20（v/v）
流速：1ml/min；检测波长：220nm；
柱温：25℃；自动进样室温度为25℃；
2.溶液配制：取安立生坦片10片，置研钵中研磨均匀，精密称取片粉，置容量瓶中，加流动相A超声溶解，冷却用流动相A稀释至刻度，离心量取上清液，制成每1ml中约含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
取安立生坦对照品约7.5mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为安立生坦对照品储备液；另分别取SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品各约7.5mg，精密称定，分置七个100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液1ml和各杂质溶液母液各1ml，置100ml容量瓶中混合，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制得安立生坦杂质加样溶液。
3.测定方法：取自身对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各20μl注入液相色谱仪，按照表5进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍。典型图谱见附图6。
表5梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（体积%） | 流动相B（体积%） |
| 0-15 | 100 | 0 |
| 15-20 | 50 | 50 |
| 20-35 | 0 | 100 |
| 35-40 | 100 | 0 |
由图6A可以看出，流动相配比改变后，各杂质和主峰分离度最小为2.24，均大于2.0，分离度良好，符合规定要求；由图6B可以看出，24.748min的峰为未知杂质峰，26.586min的峰为已知杂质DP1。
实施例5
本发明安立生坦制剂有关物质的检测方法
1.检测仪器及检测条件
仪器：Waterse2695；Waters2489UV检测器
色谱柱：C18柱（5μ，4.6×250mm）
流动相：A：乙腈：30mM磷酸二氢铵（磷酸调至pH3.5）=50：50（v/v）
B：乙腈：30mM磷酸二氢铵（磷酸调至pH3.5）=70：30（v/v）
流速：1ml/min；检测波长：220nm；
柱温：25℃；自动进样室温度为25℃；
2.溶液配制：取安立生坦片10片，置研钵中研磨均匀，精密称取片粉，置容量瓶中，加流动相A超声溶解，冷却用流动相A稀释至刻度，离心量取上清液，制成每1ml中约含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
取安立生坦对照品约7.5mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为安立生坦对照品储备液；另分别取SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品各约7.5mg，精密称定，分置七个100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液1ml和各杂质溶液母液各1ml，置100ml容量瓶中混合，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制得安立生坦杂质加样溶液。
3.测定方法：取自身对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各20μl注入液相色谱仪，按照表6进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍。典型图谱见附图7。
表6梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（体积%） | 流动相B（体积%） |
| 0-15 | 100 | 0 |
| 15-20 | 50 | 50 |
| 20-35 | 0 | 100 |
| 35-40 | 100 | 0 |
由图7A可以看出，流动相配比改变后，各杂质和主峰出峰时间有所改变，但是各杂质峰与主峰的分离度最小为2.16，均大于2.0，分离度良好，符合规定要求；由图7B可以看出，25.494min的峰为已知杂质DP1。
实施例6
本发明安立生坦制剂有关物质的检测方法
1.检测仪器及检测条件
仪器：Waterse2695；Waters2489UV检测器
色谱柱：C18柱（5μ，4.6×250mm）
流动相：A：乙腈：30mM磷酸氢二钠（磷酸调至pH3.5）=50：50（v/v）
B：乙腈：30mM磷酸氢二钠（磷酸调至pH3.5）=80：20（v/v）
流速：0.8ml/min；检测波长：220nm；
柱温：25℃；自动进样室温度为4℃；
2.溶液配制：取安立生坦片10片，置研钵中研磨均匀，精密称取片粉，置容量瓶中，加流动相A超声溶解，冷却用流动相A稀释至刻度，离心量取上清液，制成每1ml中约含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
取安立生坦对照品约7.5mg，精密称定，置100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为安立生坦对照品储备液；另分别取SRS1、SRS2、SRS3、SRS4、SRS5、二苯甲酮和DP1标准品各约7.5mg，精密称定，分置七个100mL容量瓶中，用流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液1ml和各杂质溶液母液各1ml，置100ml容量瓶中混合，用流动相A稀释至刻度，摇匀，制得安立生坦杂质加样溶液。
3.测定方法：取自身对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各20μl注入液相色谱仪，按照表7进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3～4倍。典型图谱见附图8。
表7梯度洗脱表
| 时间（min） | 流动相A（体积%） | 流动相B（体积%） |
| 0-15 | 100 | 0 |
| 15-20 | 50 | 50 |
| 20-35 | 0 | 100 |
| 35-40 | 100 | 0 |
由图8A可以看出，液相条件改变后，各杂质和主峰出峰时间有所改变，但是各杂质峰与主峰的分离度最小为2.13，均大于2.0，分离度良好，符合规定要求；由图8B可以看出，4.105min、9.134min、17.486min、22.076min的峰均为未知杂质峰，6.434min的峰为已知杂质SRS1，26.614min的峰为已知杂质DP1。
Claims (23)
1.一种安立生坦原料及制剂中的有关物质的检测方法，其中所述安立生坦原料及制剂中的有关物质包括2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸、(S)-1-(4-硝基苯基)乙胺、3，3-二苯基-2，3-环氧丙酸甲酯、2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸甲酯、4，6-二甲基-2-甲基-磺酰嘧啶、4，6-二甲基-2-(2，2-二苯基-乙烯氧基)嘧啶和二苯甲酮中的一种或多种，该方法是采用高效液相色谱法进行的，包括下述步骤：
(1)配制安立生坦样品溶液，所述安立生坦样品溶液包括供试品溶液；和
(2)将步骤(1)所得样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；
其中，所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤：精密称取安立生坦原料或制剂样品，加稀释液溶解并稀释至安立生坦的浓度为0.2mg/ml～1mg/ml，得到供试品溶液；
所述高效液相色谱法的色谱柱固定相填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合硅胶；
流动相A的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积＝30～50：50～70；
流动相B的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积＝50～80：20～50；
其中所述高效液相色谱法的梯度洗脱顺序如下：
0-15分钟时流动相为：90～100体积％流动相A+0～10体积％流动相B；
15-20分钟时流动相为：45～55体积％流动相A+45～55体积％流动相B；
20-35分钟时流动相为：0～10体积％流动相A+90～100体积％流动相B；
35-40分钟时流动相为：90～100体积％流动相A+0～10体积％流动相B。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述固定相填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中流动相A的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积＝45：55。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中流动相B的配制为乙腈的体积：磷酸盐缓冲溶液的体积＝70：30。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，
其中，所述高效液相色谱法的梯度洗脱顺序如下：
0-15分钟时流动相为：100体积％流动相A+0体积％流动相B；
15-20分钟时流动相为：50体积％流动相A+50体积％流动相B；
20-35分钟时流动相为：0体积％流动相A+100体积％流动相B；
35-40分钟时流动相为：100体积％流动相A+0体积％流动相B。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述磷酸盐为磷酸二氢铵、磷酸二氢钾或磷酸氢二钠。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为10mM～50mM。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为30mM。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述流动相的pH值为2.0～7.0。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述流动相的pH值为3.5。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述流动相的流速为1.0ml/min。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为25～40℃。
14.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为30℃。
15.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的自动进样室温度为4～25℃。
16.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的自动进样室温度为4℃。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的检测波长为220nm。
18.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中所述安立生坦样品溶液还包括自身对照溶液和/或杂质加样溶液；
所述自身对照溶液的制备方法包括下述步骤：精密量取供试品溶液1ml，置100ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，得到自身对照溶液；
所述杂质加样溶液的制备方法包括下述步骤：精密称取安立生坦对照品，加稀释液溶解并稀释至安立生坦的浓度为50μg/ml～5mg/ml，得到安立生坦对照品储备液；另分别取2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸、(S)-1-(4-硝基苯基)乙胺、3，3-二苯基-2，3-环氧丙酸甲酯、2-羟基-3-甲氧基-3，3-二苯基丙酸甲酯、4，6-二甲基-2-甲基-磺酰嘧啶、4，6-二甲基-2-(2，2-二苯基-乙烯氧基)嘧啶和二苯甲酮标准品，精密称定，分别用稀释液溶解并稀释至浓度为50μg/ml～7.5mg/ml，得到各杂质对照品溶液母液；精密量取安立生坦对照品储备液和安立生坦各杂质对照品溶液母液，混合，加稀释液稀释，得到安立生坦杂质加样溶液。
19.根据权利要求18所述的检测方法，其中所述稀释液为流动相A。
20.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其中安立生坦供试品溶液中安立生坦的浓度为0.5mg/ml。
21.根据权利要求18所述的检测方法，其中安立生坦各杂质对照品溶液母液浓度为75μg/ml。
22.根据权利要求18所述的检测方法，其中，在高效液相色谱法检测步骤(2)中，首先将样品自身对照溶液注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为记录仪满量程的20％；再将供试品溶液和杂质加样溶液分别注入液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图。
23.根据权利要求22所述的检测方法，其中，注入液相色谱仪中样品溶液的量均为20μl。
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