CN112229923B - 一种采用高效液相色谱检测15-酮及其有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析化学领域的一种采用高效液相色谱检测15‑酮及其有关物质的方法，具体包括(1)色谱条件：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；检测器：紫外检测器；流动相：缓冲盐水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；所述流动相采用梯度洗脱；溶样溶剂：30％乙腈水溶液‑100％乙腈；(2)系统适用性溶液的制备：(3)供试品溶液的制备：(4)对照溶液的制备：(5)测定方法：精密量取系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算15‑酮和/或其有关物质的含量；该方法具有分离效果好、方法重复性及耐用性好等特点。

Description

一种采用高效液相色谱检测15-酮及其有关物质的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种采用高效液相色谱检测15-酮及其有关物质的方法。
背景技术
前列腺素(prostaglandins，简称PGs)是一类具有广泛生理活性的重要内源性物质。PGs存在于几乎所有哺乳动物的组织中，在生殖系统、消化系统、呼吸系统和心血管系统中发挥着重要作用，参与体温调节、炎症反应、青光眼、妊娠、高血压、溃疡及哮喘等生理病理过程。
15-酮，化学名为：(3aR,4R,5R,6aS)-5-(苯甲酰氧基)六氢-4-[(1E)-(3-氧代-1-辛烯-1-基)]-2H-环戊并[b]呋喃-2-酮，是全合成前列腺素的关键物料，它可用于卡前列甲酯、卡前列素氨丁三醇、地诺前列素、阿巴前列素以及前列地尔等药物的合成中。目前，在文献和专利中没有关于15-酮及其有关物质的高效液相色谱分析方法的报道，研究发现，15-酮中可能会存在氢解物[化学名:(3αR,4S,5R,6αS)-5-苯甲酰氧基-六氢-4-羟甲基-2H-环戊并[b]呋喃-2-酮)]、戊基15-酮或丁基15-酮等有关物质。因此，开发建立关键物料15-酮及其有关物质的高效液相色谱检测方法具有重要意义，将更加有利于指导生产，提升产品质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱检测15-酮及其有关物质的方法。
本发明的目的是这样实现的：一种采用高效液相色谱检测15-酮和/或其有关物质的方法，该检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测器：紫外检测器；
流动相：缓冲盐水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；
所述流动相采用梯度洗脱；
溶样溶剂：30％乙腈水溶液-100％乙腈；
(2)系统适用性溶液的制备；
(3)供试品溶液的制备；
(4)对照溶液的制备；
(5)测定方法：
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算15-酮和/或其有关物质的含量；
所述15-酮选自式I所示的化合物：
Figure BDA0002710929950000021
所述有关物质包括如式II所示的戊基15-酮、如式III所示的丁基-15酮、如式IV所示的氢解物中的一种或几种，
Figure BDA0002710929950000031
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％
0 40-50 60-50
40-46 30-38 70-62
；
所述系统适用性溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮和/或所述有关物质对照品各适量，加所述溶样溶剂溶解并稀释制成混合溶液，作为系统适用性溶液；
所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮样品，加所述溶样溶剂溶解并定量稀释，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括如下步骤：
精密量取供试品溶液，置量瓶中，用所述溶样溶剂稀释，摇匀，作为对照溶液；
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％
0 44-46 56-54
44-46 34-36 66-64
所述的戊基15-酮选自如式V所示的结构、所述的丁基15酮选自如式VI所示的结构、所述的氢解物选自如式VII所示的结构，
Figure BDA0002710929950000041
所述的缓冲盐选自磷酸盐、醋酸盐中的一种或几种；所述的磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种；所述的醋酸盐选自醋酸铵；所述缓冲盐水溶液的浓度为0.002-0.05mol/L；所述溶样溶剂选自40％乙腈水溶液-60％乙腈水溶液；所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min；所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液的进样量为2-100μl；所述紫外检测器的检测波长为210-240nm；所述色谱柱的柱温为25-45℃；所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱选自Waters C18色谱柱、Agilent C18色谱柱、Hypersic C18色谱柱或Inertsil C18色谱柱中的一种；所述Hypersic C18色谱柱选自Hypersic ODS-2；所述Inertsil C18色谱柱选自Inertsil ODS-3；所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为4.6×250mm，5μm；
所述计算15-酮和/或其有关物质的含量的方法如下：
丁基15-酮、戊基15-酮、氢解物、其他单一杂质、其他杂质总量按下式计算：
Figure BDA0002710929950000051
Figure BDA0002710929950000052
总量＝氢解物含量％+丁基15-酮％+戊基15-酮％+其他杂质总量％
式中：Ai：丁基15-酮、戊基15-酮、其他单一杂质的峰面积
AZ：除氢解物之外，其他杂质峰面积之和
A氢：氢解物的峰面积
AR：对照溶液的峰面积
所述15-酮按面积归一化法计算含量；
所述系统适用性溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮和/或所述有关物质对照品各适量，加所述溶样溶剂溶解并稀释制成每1ml中含15-酮2.0μg、和/或丁基15-酮1.0μg、和/或戊基15-酮1.0μg、和/或氢解物1.0μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；
所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮样品，加所述溶样溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括如下步骤：
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用所述溶样溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％
0 45 55
45 35 65
50 45 55
60 45 55
；
所述系统适用性溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮、丁基15-酮、戊基15-酮与氢解物对照品各适量，加50％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含15-酮2.0μg、丁基15-酮1.0μg、戊基15-酮1.0μg与氢解物1.0μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；
所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮样品，加50％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括如下步骤：
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；
所述缓冲盐水溶液的浓度为0.008-0.02mol/L，优选的浓度为0.01mol/L；所述流动相的流速为0.8-1.2ml/min，优选的所述流动相的流速为1.0ml/min；所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液的进样量为5-20μl；所述紫外检测器的检测波长为230nm；所述色谱柱的柱温为30-40℃。
本发明的要点在于一种采用高效液相色谱检测15-酮及其有关物质的方法，其原理是：(1)该方法采用高效液相色谱法,选用十八烷基硅烷键合硅胶(C18)色谱柱，使得氢解物(左旋苯甲酰科里内酯醇)、丁基15-酮、戊基15-酮等有关物质与15-酮的分离效果好、方法重复性及耐用性好等；(2)溶样溶剂优选50％乙腈，色谱峰峰型对称，保留时间重复性好等。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
图1为15-酮的结构式图
图2为氢解物的结构式图
图3为系统适用性溶液高效液相色谱图
图4为专属性试验高效液相色谱图
图5为不同盐浓度高效液相色谱图
图6为不同流速高效液相色谱图
图7为不同柱温高效液相色谱图
图8为不同色谱柱高效液相色谱图
图9为15-酮样品检测高效液相色谱图
图10为戊基15-酮的结构式图
图11为丁基15-酮的结构式图
图12为苯甲酰科里内酯醛的结构式图
图13为戊基15-酮的质谱图
图14为戊基15-酮的氢谱图
图15为戊基15-酮的碳谱图
图16为丁基15-酮的质谱图
图17为丁基15-酮的氢谱图
图18为丁基15-酮的碳谱图
具体实施方式
以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
实施例一
色谱条件的选择
1.1检测波长的选择
取15-酮样品适量，PDA检测器(二极管阵列检测器)检测，扫描波长范围为200-400nm，记录紫外吸收图谱，确定15-酮及其杂质的最大吸收波长。故选择230nm为15-酮及其有关物质的检测波长。
1.2色谱柱的选择
C18色谱柱。C18色谱柱选试Waters，Agilent，Hypersic ODS-2和Inertsil ODS-3，均能使15-酮与杂质分离，其中Inertsil ODS-3能使15-酮与各杂质实现较好的分离，各杂质间分离度符合规定，且主峰峰形最好，故优选Inertsil ODS-3色谱柱。
1.3柱温的选择
选择十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，温度使用范围为25-45℃，优选温度30-40℃。
1.4流动相的选择
选择水-甲醇流动相体系，主峰峰形不好，拖尾严重。用水-乙腈流动相体系，主峰峰形不好。用醋酸盐-乙腈(前者)、磷酸盐-乙腈(后者)流动相体系时，前者基线噪音较后者大，且梯度条件下前者基线飘移较后者严重，经筛选后最终选用磷酸氢二铵-乙腈体系作为流动相。考虑到高浓度盐容易析出，有可能对仪器和色谱柱造成损伤，故选用较低浓度的磷酸氢二铵，优选0.01mol/L的磷酸氢二铵水溶液。
1.5溶样溶剂的选择
通过对30％乙腈-100％乙腈进行考察，发现50％乙腈可将15-酮样品溶解且峰形较好，故选择40-60％乙腈，优选50％乙腈。
实施例二
方法学的建立
2.1系统适用性试验
精密量取系统适用性溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图3(图3中，保留时间17.345min的峰为15-酮峰，保留时间12.986min的峰为戊基15-酮峰，保留时间9.888min的峰为丁基15-酮峰，保留时间3.951min的峰为氢解物峰)，氢解物、丁基15-酮、戊基15-酮、15-酮依次洗脱；各组分间的分离度均符合规定(大于1.5)。
2.2专属性试验
精密量取15-酮稀释剂(即溶样溶剂：50％乙腈)、系统适用性溶液及供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图4(图4中，1代表50％乙腈；2代表系统适用性溶液【与图3一致】；3代表供试品溶液)，结果表明，15-酮稀释剂不干扰15-酮及各已知杂质和未知杂质的测定。
2.3检测限、定量限
精密称取15-酮、丁基15-酮、戊基15-酮及氢解物对照品各适量，用50％乙腈溶解并逐级稀释后单独进样10μl，信噪比(S/N)≈3时的相应浓度或注入仪器的量为检测限；信噪比(S/N)≈10时的相应浓度或注入仪器的量为定量限。记录峰高并计算峰高的RSD。
表1 15-酮及其有关物质检测限、定量限试验结果
Figure BDA0002710929950000101
Figure BDA0002710929950000111
Figure BDA0002710929950000121
2.4线性和范围
精密称取15-酮、丁基15-酮、戊基15-酮及氢解物对照品各适量，用50％乙腈溶解并稀释制成范围在定量限至200％供试品溶液限度的一系列溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标进行线性回归。
试验结果：
15-酮A＝41427C+155.5＝0.999，15-酮在0.0409～2.0468μg/ml范围内具有良好的线性关系；
丁基15-酮A＝47978C+201.6＝0.999，丁基15-酮在0.0193～1.5445μg/ml范围内具有良好的线性关系；
戊基15-酮A＝44275C+444.6＝0.999，戊基15-酮在0.0317～1.9782μg/ml范围内具有良好的线性关系；
氢解物A＝25237C+49.35＝0.999，氢解物在0.0245～0.4080μg/ml范围内具有良好的线性关系。
2.5校正因子
根据上述线性试验结果，以杂质丁基15-酮，戊基15-酮，氢解物和主成分15-酮线性方程的斜率，分别计算丁基15-酮，戊基15-酮，氢解物相对于主成分15-酮的校正因子f，结果见表2。根据《中国药典》2015年版四部0512高效液相色谱法规定，相对校正因子的计算方式如下：
Figure BDA0002710929950000131
根据校正因子计算的要求，应以多点计算验证校正因子，即将“A/C”定义为曲线之斜率，即：
Figure BDA0002710929950000132
表2 15-酮有关物质校正因子考察结果汇总表
Figure BDA0002710929950000141
由上述试验结果可知，丁基15-酮和戊基15-酮的校正因子在0.9～1.1之间，可不进行校正。氢解物的校正因子为1.6，须进行校正。在有关物质检查中，丁基15-酮和戊基15-酮采用不加校正因子的主成分自身对照法，氢解物采用加校正因子的主成分自身对照法。
2.6回收率
杂质对照品溶液：精密称取杂质对照品，用50％乙腈稀释至限度浓度，作为杂质对照品溶液，同法制备2份。
稀释剂溶液：精密称取15-酮样品，加50％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为稀释剂溶液；
杂质回收率溶液：
LOQ(定量限)回收率溶液：精密称取杂质对照品，用稀释剂溶液溶解并稀释至杂质的LOQ，作为LOQ回收率溶液，同法制备3份。
50％回收率溶液：精密称取杂质对照品，用稀释剂溶液溶解并稀释至杂质限度的50％，作为50％回收率溶液，同法制备3份。
80％回收率溶液：精密称取杂质对照品，用稀释剂溶液溶解并稀释至杂质限度的80％，作为80％回收率溶液，同法制备3份。
100％回收率溶液：精密称取杂质对照品，用稀释剂溶液溶解并稀释至杂质限度，作为100％回收率溶液，同法制备3份。
精密量取上述稀释剂溶液，杂质对照品溶液，杂质回收率溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算杂质回收率，结果见表3。
表3 15-酮有关物质回收率结果
Figure BDA0002710929950000151
戊基15-酮试验结果汇总表
Figure BDA0002710929950000152
Figure BDA0002710929950000161
氢解物试验结果汇总表
Figure BDA0002710929950000162
试验结果表明，15-酮有关物质的回收率在85％-115％范围内，证明该方法的准确度良好。
2.7精密度
加杂质样品重复性
根据供试品中已知杂质如有未检出或者检出含量较低的情况，可以采用加杂质对照品来测定相应的重复性，加样量为限度浓度。因此向供试品中加入0.1％氢解物验证方法的重复性。即取15-酮样品5mg共6份，分别置25ml量瓶，分别加氢解物后，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，配制成含氢解物0.1％的溶液作为加样供试品溶液，按有关物质项下测定方法测定，计算杂质含量。测定结果见下表。
表4 15-酮加样重复性试验结果
Figure BDA0002710929950000171
结论：15-酮有关物质检查方法精密度试验结果符合要求，精密度良好。
2.8耐用性
2.8.1不同盐浓度
适当改变流动相盐(磷酸氢二铵)浓度(±20％)，对系统适用性溶液及15-酮样品进行测定，结果见下表。15-酮样品色谱图见图5(图5中，4代表10mM，5代表8mM，6代表12mM)。
表5有关物质耐用性试验考察结果汇总表
Figure BDA0002710929950000172
Figure BDA0002710929950000181
2.8.2不同流速
适当改变流动相流速(±20％)，对系统适用性溶液及15-酮样品进行测定，结果见下表。15-酮样品色谱图见图6(图中，7代表1.0ml/min，8代表1.2ml/min，9代表0.8ml/min)。
表6有关物质耐用性试验考察结果汇总表
Figure BDA0002710929950000182
2.8.3不同柱温
适当改变柱温(±5℃)，对系统适用性溶液及15-酮样品进行测定，结果见下表。15-酮样品色谱图见图7(图7中，10代表35℃,11代表30℃,12代表40℃)。
表7有关物质耐用性试验考察结果汇总表
Figure BDA0002710929950000183
Figure BDA0002710929950000191
2.8.4不同色谱柱
方法开发前期阶段，考察了不同品牌的色谱柱，结果发现使用Inertsil ODS-3C18杂质分离较好，故推荐使用Inertsil ODS-3C18色谱柱或与之效能相当的色谱柱，本实验选用Inertsil ODS-3C18色谱柱。改变色谱柱批号，对系统适用性溶液及15-酮样品进行测定，结果见下表。15-酮样品色谱图见图8(图8中，13代表C18-GL-35，14代表C18-GL-33)。
表8有关物质耐用性试验考察结果汇总表
Figure BDA0002710929950000192
耐用性试验结果总结：通过对本品选定的色谱条件的盐浓度，流速，柱温，柱批号等适当调整，均不影响杂质间以及杂质与主成分间的分离度，对供试品溶液杂质的检出能力也无明显影响。进一步说明15-酮及其有关物质检查方法中已知杂质的定位方式及控制方法是合理准确的。
实施例三
(1)色谱条件：
色谱柱：C18，Inertsil ODS-3
柱温：35℃
紫外检测器检测波长：230nm
流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；
流动相的流速：1.0ml/min
溶样溶剂：50％乙腈水溶液
梯度洗脱：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 45 55
45 35 65
50 45 55
60 45 55
(2)溶液的制备：
供试品溶液：精密称取供试品5mg，置于25ml容量瓶中，用50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含0.2mg的溶液。
15-酮对照品贮备液：精密称取15-酮对照品5mg，置于25ml容量瓶中，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.2mg/ml。
丁基15-酮对照品贮备液：精密称取丁基15-酮对照品5mg，置于25ml容量瓶中，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.2mg/ml。
戊基15-酮对照品贮备液：精密称取戊基15-酮对照品5mg，置于25ml容量瓶中，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.2mg/ml。
氢解物对照品贮备液：精密称取氢解物对照品5mg，置于25ml容量瓶中，加50％乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.2mg/ml。
系统适用性溶液：精密吸取15-酮对照品贮备液1ml、丁基15-酮对照品贮备液、戊基15-酮对照品贮备液、氢解物对照品贮备液各0.5ml，置于同一100ml容量瓶中，加50％乙腈稀释至刻度，摇匀。制成每1ml中含15-酮2.0μg、丁基15-酮1.0μg、戊基15-酮1.0μg与氢解物1.0μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。
对照溶液的制备：精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
(3)测定方法：
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与系统适用性溶液中氢解物、丁基15-酮、戊基15-酮相对保留时间一致的色谱峰，按下列公式计算各杂质含量。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.1倍(0.05％)的色谱峰可忽略不计。
(4)计算公式：
丁基15-酮、戊基15-酮、其他单一杂质、其他杂质总量按下式计算：
Figure BDA0002710929950000221
Figure BDA0002710929950000222
总量＝氢解物含量％+丁基15-酮％+戊基15-酮％+其他杂质总量％
式中：Ai：丁基15-酮、戊基15-酮、其他单一杂质的峰面积。
AZ：除氢解物之外，其他杂质峰面积之和。
A氢：氢解物的峰面积。
AR：对照溶液的峰面积。
15-酮按面积归一化法计算含量。
根据上述色谱条件对一批15-酮样品进行15-酮及其有关物质检测，结果见表9。色谱图见图9。
表9 15-酮及其有关物质检测结果
Figure BDA0002710929950000223
实施例四
戊基15-酮的制备方法
1L四颈瓶中加入甲基三苯基溴化膦57.0g，四氢呋喃300ml，氮气保护下搅拌降温至-20℃～-15℃，滴加2.5M正丁基锂76.8ml(30分钟滴加完毕)，加毕后进行脱氢反应2h，维持-20℃～-15℃的温度范围，滴加戊酸乙酯27.5g，加毕后继续反应3h，加入水240ml淬灭反应，分液，水层用乙酸乙酯200ml分2次进行萃取，合并有机层，用饱和氯化钠200ml洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩，得油状物，放置析出固体，加入异丙醚200ml打浆2h，抽滤，滤饼用异丙醚50ml洗，干燥得1-三苯基膦-2-己酮40.5g。含量：98.9％(面积归一)。
500ml单口瓶中加入苯甲酰科里内酯醛的二氯甲烷溶液，1-三苯基膦-2-己酮15.7g，20-25℃进行wittig反应8h，得反应液，减压浓缩蒸出溶剂，剩余物加入无水乙醇75ml，-20℃析晶10h析出晶体，抽滤，滤饼先用异丙醚24ml洗，后用二氯甲烷15ml溶解，浓缩二氯甲烷溶液，得油状物，加入无水乙醇30ml，-20℃析晶10h，析出晶体，抽滤，滤饼用异丙醚12ml洗，干燥，得戊基15-酮粗品7.2g。含量：96.5％(面积归一)。
50ml单口瓶中加入戊基15-酮粗品3.5g，无水乙醇17ml，20-30℃搅拌打浆4h，抽滤，滤饼干燥得戊基15-酮3.2g，收率91.4％，含量99.9％(面积归一)，ESI-MS m/z：379.3[M+Na]+，395.3[M+K]+。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δ：7.983～7.970(d,J＝7.8Hz,2H),7.594～7.582(t,J＝6.6Hz,1H),7.466～7.442(t,J＝7.8Hz,2H),6.844～6.804(dd,J＝15.6Hz,7.8Hz 1H),6.288～6.262(d,J＝15.6Hz 1H),5.351～5.343(q,J＝5.4Hz 1H),5.163(t,J＝6.6Hz,1H),3.013～2.942(m,3H),2.639～2.580(m,3H),2.542～2.512(d,J＝16.8Hz,1H),2.251～2.218(dd,J＝15.6Hz,4.2Hz 1H),1.551～1.526(m,2H),1.325～1.288(m,2H),0.902～0.877(t,J＝7.2Hz,3H)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δ：202.8,179.2,167.2,145.9,134.5,132.4,130.9,130.6,129.6,85.6,80.5,55.7,43.9,40.9,38.7,35.8,27.4,23.3,14.2。参见图13、图14、图15。
实施例五
丁基15-酮的制备
1L四颈瓶中加入甲基三苯基溴化膦57.0g，四氢呋喃300ml，氮气保护下搅拌降温至-20℃～-15℃，滴加2.5M正丁基锂76.8ml(30分钟滴加完毕)，加毕后进行脱氢反应2h，维持-20℃～-15℃的温度范围，滴加丁酸乙酯25.0g，加毕后继续反应3h，加入水240ml淬灭反应，分液，水层用乙酸乙酯200ml分2次进行萃取，合并有机层，用饱和氯化钠200ml洗，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩，得油状物，放置析出固体，加入异丙醚200ml打浆2h，抽滤，滤饼用异丙醚50ml洗，干燥得1-三苯基膦-2-戊酮45.6g。含量：97.8％(面积归一)。
500ml单口瓶中加入苯甲酰科里内酯醛的二氯甲烷溶液，1-三苯基膦-2-戊酮15.3g，20-25℃进行wittig反应8h，得反应液，减压浓缩蒸出溶剂得棕色油状物。过硅胶柱纯化(200-300目硅胶，洗脱剂石油醚；乙酸乙酯体积比为2:1)，得油状丁基15-酮4.6g，含量99.8％(面积归一)。ESI-MS m/z：365.1[M+Na]+，m/z 380.9[M+K]+。1H-NMR(600MHz，CD3OD3)δ：7.984～7.970(d,J＝7.8Hz,2H),7.597～7.585(t,J＝7.2Hz,1H),7.471～7.445(t,J＝7.8Hz,2H),6.847～6.807(dd,J＝15.6Hz,7.8Hz 1H),6.286～6.260(d,J＝15.6Hz 1H),5.354～5.344(q,J＝4.8Hz 1H),5.171～5.160(m,1H),3.017～2.946(m,3H),2.638～2.513(m,4H),2.256～2.224(dd,J＝15.0Hz,3.6Hz 1H),1.609～1.572(m,2H),0.915～0.891(t,J＝7.2Hz,3H)。13C-NMR(150MHz，CD3OD3)δ：201.9,178.4,166.4,145.1,133.7,131.6,130.1,129.8,128.8,84.8,79.7,54.9,43.1,42.2,37.9,35.1,17.8,13.2。参见图16、图17、图18。
实施例六
本发明实施例四至五中的苯甲酰科里内酯醛的二氯甲烷溶液由如下方法制备：
1L四口瓶中加入左旋苯甲酰科里内酯醇12.0g，二甲亚砜73ml，DCC(二环己基碳二亚胺)30.0g，二氯甲烷150ml，搅拌下降温至10℃，加入吡啶3.4ml，三氟乙酸1.7ml，升温至20-25℃反应5h，降温至15℃，滴加稀盐酸(4.4ml盐酸与300ml水配制)，加毕后搅拌20min，抽滤，分液，水层用二氯甲烷100ml萃取2次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，抽滤，得苯甲酰科里内酯醛的二氯甲烷溶液。

Claims (11)

1.一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测器：紫外检测器；所述紫外检测器的检测波长为210-240nm；
流动相：缓冲盐水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；
所述的缓冲盐选自磷酸盐、醋酸盐中的一种或几种；
所述流动相采用梯度洗脱；
溶样溶剂：30％乙腈水溶液-100％乙腈；
(2)系统适用性溶液的制备；
(3)供试品溶液的制备；
(4)对照溶液的制备；
(5)测定方法：
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算15-酮和其有关物质的含量；
所述15-酮选自式I所示的化合物：
Figure FDA0003869810450000011
所述有关物质包括如式II所示的戊基15-酮、如式III所示的丁基-15酮、如式IV所示的氢解物中的一种或几种，
Figure FDA0003869810450000012
Figure FDA0003869810450000021
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％ 0 40-50 60-50 40-46 30-38 70-62
。
2.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：
所述系统适用性溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮和所述有关物质对照品各适量，加所述溶样溶剂溶解并稀释制成混合溶液，作为系统适用性溶液；
所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮样品，加所述溶样溶剂溶解并定量稀释，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括如下步骤：
精密量取供试品溶液，置量瓶中，用所述溶样溶剂稀释，摇匀，作为对照溶液。
3.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％ 0 44-46 56-54 44-46 34-36 66-64
所述的戊基15-酮选自如式V所示的结构、所述的丁基15酮选自如式VI所示的结构、所述的氢解物选自如式VII所示的结构，
Figure FDA0003869810450000031
4.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：所述的磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种；所述的醋酸盐选自醋酸铵；所述缓冲盐水溶液的浓度为0.002-0.05mol/L；所述溶样溶剂选自40％乙腈水溶液-60％乙腈水溶液；所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min；所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液的进样量为2-100μl；所述色谱柱的柱温为25-45℃；所述的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱选自Waters C18色谱柱、Agilent C18色谱柱、Hypersic C18色谱柱或Inertsil C18色谱柱中的一种；所述Hypersic C18色谱柱选自Hypersic ODS-2；所述Inertsil C18色谱柱选自Inertsil ODS-3；所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为4.6×250mm，5μm。
5.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：所述计算15-酮和其有关物质的含量的方法如下：
丁基15-酮、戊基15-酮、氢解物、其他单一杂质、“除氢解物之外，其他杂质总量”按下式计算：
Figure FDA0003869810450000032
除氢解物之外，
Figure FDA0003869810450000033
Figure FDA0003869810450000041
总量＝氢解物含量％+丁基15-酮％+戊基15-酮％+其他杂质总量％
式中：Ai：丁基15-酮、戊基15-酮、其他单一杂质的峰面积
AZ：除氢解物之外，其他杂质峰面积之和
A氢：氢解物的峰面积
AR：对照溶液的峰面积
所述15-酮按面积归一化法计算含量。
6.根据权利要求1所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：
所述系统适用性溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮和所述有关物质对照品各适量，加所述溶样溶剂溶解并稀释制成每1ml中含15-酮2.0μg、和/或丁基15-酮1.0μg、和/或戊基15-酮1.0μg、和/或氢解物1.0μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；
所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮样品，加所述溶样溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括如下步骤：
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用所述溶样溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
7.根据权利要求3所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％ 0 45 55 45 35 65 50 45 55 60 45 55
。
8.根据权利要求6所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：
所述系统适用性溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮、丁基15-酮、戊基15-酮与氢解物对照品各适量，加50％乙腈溶解并稀释制成每1ml中含15-酮2.0μg、丁基15-酮1.0μg、戊基15-酮1.0μg与氢解物1.0μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；
所述供试品溶液的制备包括如下步骤：
精密称取15-酮样品，加50％乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；
所述对照溶液的制备包括如下步骤：
精密量取供试品溶液1ml，置200ml量瓶中，用50％乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
9.根据权利要求4所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：所述缓冲盐水溶液的浓度为0.008-0.02mol/L；所述流动相的流速为0.8-1.2ml/min；所述系统适用性溶液、供试品溶液、对照溶液的进样量为5-20μl；所述紫外检测器的检测波长为230nm；所述色谱柱的柱温为30-40℃。
10.根据权利要求9所述的一种采用高效液相色谱检测15-酮和其有关物质的方法，其特征在于：所述缓冲盐水溶液的浓度为0.01mol/L；所述流动相的流速为1.0ml/min。
11.一种采用高效液相色谱检测15-酮有关物质的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测器：紫外检测器；所述紫外检测器的检测波长为210-240nm；
流动相：缓冲盐水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；
所述的缓冲盐选自磷酸盐、醋酸盐中的一种或几种；
所述流动相采用梯度洗脱；
溶样溶剂：30％乙腈水溶液-100％乙腈；
(2)系统适用性溶液的制备；
(3)供试品溶液的制备；
(4)对照溶液的制备；
(5)测定方法：
精密量取系统适用性溶液、供试品溶液与对照溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算15-酮有关物质的含量；
所述15-酮选自式I所示的化合物：
Figure FDA0003869810450000061
所述有关物质包括如式II所示的戊基15-酮、如式III所示的丁基-15酮、如式IV所示的氢解物中的两种以上，
Figure FDA0003869810450000062
所述流动相采用梯度洗脱的条件如下：
时间，min 流动相A，％ 流动相B，％ 0 40-50 60-50 40-46 30-38 70-62
。
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