CN111351869B - 一种测定鲁比前列酮供试品有关物质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种测定鲁比前列酮供试品有关物质的分析方法，该方法采用反相高效液相色谱法，分离测定了鲁比前列酮化合物、式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物和式V化合物。本方法溶剂不干扰杂质检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑灵敏度高﹑重复性好﹑准确度好，可以快速准确地进行供试品有关物质的定性及定量分析，保证鲁比前列酮质量的可控性。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，特别涉及鲁比前列酮有关物质的高效液相色谱分析方法。
技术背景
鲁比前列酮(化合物L)
是一种局限性氯离子通道激活剂，可选择性地活化位于胃肠道上皮尖端管腔细胞膜上的2型氯离子通道，增加肠液的分泌和肠道的运动性，从而增加排便，FDA已批准鲁比前列酮用于治疗成人慢性特发性便秘，成年女性的便秘型肠易激综合征以及服用阿片类药物导致的便秘。但是鲁比前列酮结构本身不稳定，会存在化合物L与化合物L’的互变异构：
在鲁比前列酮供试品质量控制中，现有文献资料中，例如公开号为CN102020625B的专利中，公开了一种鲁比前列酮的反相高效液相色谱分析法，对鲁比前列酮供试品中有关物质进行检测。因此，为有效控制质量，分离鲁比前列酮有关物质，需寻找一种新的鲁比前列酮有关物质的分析方法。
发明内容
一方面，本发明提供了一种鲁比前列酮有关物质的分析方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，流动相为磷酸水溶液和乙腈的混合溶液，按等度或梯度洗脱。
在一些典型的实施方案中，所述流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈的混合溶液，按等度或梯度洗脱；在一些更为典型的实施方案中，所述流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈，按下表梯度洗脱：
| 时间(min) | 0.05％磷酸水溶液(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 10 | 40 | 60 |
| 15 | 40 | 60 |
| 25 | 10 | 90 |
| 35 | 10 | 90 |
| 36 | 70 | 30 |
| 45 | 70 | 30 |
在一些实施方案中，所述流动相的流速为0.5-2ml/min；在一些典型的实施方案中，所述流动相的流速选自0.5ml/min、1.0ml/min、1.4ml/min、1.5ml/min、1.6ml/min和2.0ml/min或其中任意两数值组成的范围；在一些更为典型的实施方案中，所述流动相的流速为1.5ml/min。
在一些实施方案中，所述反相色谱柱采用非极性固定相作为填料；在一些典型的实施方案中，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；在一些更为典型的实施方案中，所述反相色谱柱选自Agilent ZORBAX SB-C18，其规格为250mm×4.6mm，5μm。
在一些实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器、紫外检测器、示差折光检测器或蒸发光散射检测器；在一些典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外吸收检测器；在一些更为典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外吸收检测器，且其检测波长为292-296nm；优选为292nm、293nm、294nm、295nm、296nm；更优选为294nm。
在一些实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为20-40℃；在一些典型的实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为25-35℃；在一些更为典型的实施方案中，所述反相色谱柱的柱温为30℃。
另一方面，本发明提供了一种鲁比前列酮有关物质的分析方法，其特征在于：
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是紫外吸收检测器，检测波长是294nm；
色谱柱是反相色谱柱，柱温为30℃；
流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈，按下表进行梯度洗脱；
| 时间(分钟) | 0.05％磷酸水溶液(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 10 | 40 | 60 |
| 15 | 40 | 60 |
| 25 | 10 | 90 |
| 35 | 10 | 90 |
| 36 | 70 | 30 |
| 45 | 70 | 30 |
流速为1.5ml/min；
分别注入鲁比前列酮供试品溶液、对照溶液和系统适应性溶液；
所述系统适用性溶液包含化合物L和选自式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物和式V化合物中的一种或两种以上混合物；
通过主成分自身对照法计算样品中式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物和/或式V化合物的含量。
在一些实验方案中，所述的自身对照法按加入校正因子计算；在一些实验方案中，所述的自身对照法按不加入校正因子进行计算；在一些典型的实施方案中，式III化合物和式V化合物的含量计算按照加入校正因子进行计算，式I化合物、式II化合物和式IV化合物的含量计算按照不加入校正因子进行计算；在一些更为典型的实施方案中，式III化合物的校正因子为0.65，式V化合物的校正因子为0.63。
在一些特定的实施方案中，本发明提供了一种鲁比前列酮有关物质的分析方法，其特征在于：
(1)流动相溶液为0.05％磷酸水溶液和乙腈；
(2)式I化合物定位溶液配制：取式I化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式I化合物，其结构式为：
(3)式II化合物定位溶液配制：取式II化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式II化合物，其结构式为：
(4)式III化合物定位溶液配制：取式III化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式III化合物，其结构式为：
(5)式IV化合物定位溶液配制：取式IV化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式IV化合物，其结构式为：
(6)式V化合物定位溶液配制：取式V化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式V化合物，其结构式为：
(7)化合物L定位溶液配制：取化合物L对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述化合物L，其结构式为：
(7)系统适用性溶液配制：取式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物、式V化合物和化合物L各适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得；
(8)供试品溶液配制：取鲁比前列酮供试品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得；
(9)对照溶液配制：精密量取供试品溶液适量，加乙腈稀释100倍，作为对照溶液；
(10)供试品测定：采用反相色谱柱，流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈，调整流速为1.5ml/min，柱温为30℃；检测波长为294nm；进样量为50μl；分别量取流动相溶液、式I化合物定位溶液、式II化合物定位溶液、式III化合物定位溶液、式IV化合物定位溶液、式V化合物定位溶液和化合物L定位溶液、系统适用性溶液﹑供试品溶液和对照溶液，分别注入液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱，记录各色谱图；
| 时间(分钟) | 0.05％磷酸水溶液(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 10 | 40 | 60 |
| 15 | 40 | 60 |
| 25 | 10 | 90 |
| 35 | 10 | 90 |
| 36 | 70 | 30 |
| 45 | 70 | 30 |
(11)含量计算：根据各色谱图，通过加校正因子或不加校正因子的主成分自身对照法计算样品中各杂质含量：
其中，A’t为供试品溶液色谱图中式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物或式V化合物各自的峰面积；f’为校正因子，A’为对照溶液中主峰的峰面积，即化合物L的峰面积。
在一些实施方案中，供试品溶液中，式I化合物含量不高于0.50％，优选为不高于0.10％，式II化合物含量不高于0.50％，优选为不高于0.10％，式III化合物含量不高于1.00％，优选为不高于0.50％，式IV化合物含量不高于0.50％，优选为不高于0.10％，式V化合物含量不高于0.50％，优选为不高于0.10％，其他未知单个杂质的含量均不高于0.50％，优选为不高于0.10％。
再一方面，本发明提供了一种式I化合物，其结构为：
在一些实施方案中，本发明提供了一种纯度≥90％的式I化合物；在一些典型的实施方案中，本发明提供了一种纯度≥95％的式I化合物；在一些更为典型的实施方案中，本发明提供了一种纯度≥98％的式I化合物。
再一方面，本发明还提供了一种式I化合物在鲁比前列酮的杂质检查时作为参比标示物的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了一种纯度不低于90％的式I化合物在鲁比前列酮的杂质检查时作为参比标示物的用途；在一些典型的实施方案中，本发明提供了一种纯度不低于95％的式I化合物在鲁比前列酮的杂质检查时作为参比标示物的用途；在一些更典型的实施方案中，本发明提供了一种纯度不低于98％的式I化合物在鲁比前列酮的杂质检查时作为参比标示物的用途。
在一些实施方案中，鲁比前列酮供试品中式I化合物的含量不高于0.5％；在一些更为典型的实施方案中鲁比前列酮供试品中式I化合物的含量不高于0.1％。
再一方面，本发明提供了一种式I化合物的制备方法，其特征在于，化合物I-2经反应得到式I化合物：
在一些实施方案中，化合物I-2在醋酸、纯化水和四氢呋喃存在下，经反应，得到式I化合物。
在一些实施案例中，本发明提供了一种式I化合物的制备方法，包括以下步骤：反应瓶中加入醋酸、纯化水和四氢呋喃配成混合溶液，将化合物I-2用该混合液溶解，升温搅拌，待反应结束后，经过萃取、洗涤、干燥、浓缩，得式I化合物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种式I化合物的制备方法，包括以下步骤：反应瓶中加入醋酸、纯化水和四氢呋喃配成混合溶液，将化合物I-2用该混合液溶解，升温搅拌，待反应结束后，将反应液冷却倒入纯化水中，用乙酸乙酯萃取，用纯化水洗涤，再用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，10％氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，得式I化合物粗品，用柱层析纯化，得到油状物，即式I化合物。
进一步的，本发明提供了一种式I-2化合物的制备方法，其特征为：将化合物I-1与Dess-Martin氧化剂反应得式I-2化合物：
在一些实施方案中，本发明提供了一种化合物I-2的制备方法，其特征为：化合物I-1与Dess-Martin氧化剂在二氯甲烷中反应，即得化合物I-2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种化合物I-2的制备方法，其特征为：化合物I-1与Dess-Martin氧化剂在二氯甲烷中反应，控制温度，待反应结束后，经萃取，洗涤，干燥，浓缩，柱层析得化合物I-2。
在一些实施方案中，本发明提供了一种化合物I-2的制备方法，其特征为：化合物I-2的二氯甲烷溶液滴加至含Dess-Martin氧化剂的二氯甲烷溶剂中，控制内温为0℃～10℃；滴加完毕后，内温升至25℃～35℃，搅拌3h～5h；待反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，搅拌；经二氯甲烷萃取，纯化水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩，柱层析纯化，得到化合物I-2。
本文中，式I化合物结构式为
该化合物可以通过实施例提供的方法制备得到。
本文中，式II化合物结构式为
该化合物可以通过直接购买或参照已公开的文献制备得到，所述的文献包括但不限于WO2007091697。
本文中，式III化合物结构式为
该化合物可以通过实施例中的制备方法制得。
本文中，式IV化合物结构式为
该化合物可以通过直接购买或参照已公开的文献制备得到，所述的文献包括但不限于US20130184476。
本文中，式V化合物结构式为
该化合物可以通过直接购买或参照已公开的文献制备得到，所述的文献包括但不限于US 20130184476、CN102050808A。
本文中，除非另有说明，所述的鲁比前列酮包括化合物L或其药学上可接受的盐；用以“供试品配置”的鲁比前列酮包括但不限于新制备或经储存的鲁比前列酮原料药、包含鲁比前列酮的药物组合物。
本文中，有关物质也表述为杂质。
本文中，适量是指在根据实验目的，各化合物的量均在其高效液相色谱仪的检测限或定量限范围内。
定位溶液浓度为10ng/ml-100mg/ml；优选为0.1μg/ml-10mg/ml；更优选为1μg/ml-2mg/ml。
系统适用性溶中化合物I、化合物II、化合物III、化合物IV和化合物V的浓度为：0.1μg/ml-100mg/ml；优选为1μg/ml-10mg/ml；更优选为2μg/ml-2mg/ml。
系统适用性溶中化合物L的浓度为：1μg/ml-1000mg/ml；优选为10μg/ml-100mg/ml；更优选为50μg/ml-50mg/ml。
对照溶液中，化合物L的浓度为0.1μg/ml-10mg/ml；优选为2μg/ml-2mg/ml；更优选为5μg/ml-1mg/ml。
本发明中校正因子的计算可通过精密称取主成分(化合物L)对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，HPLC检测，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子。
本发明的方法并不限于上述5个杂质，任何采用本发明方法分离测定鲁比前列酮及其杂质，均落入本发明保护范围内，特别是分离测定鲁比前列酮及本发明所述的式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物、式V化合物。
本发明要解决的技术问题是提供一种能准确测定鲁比前列酮供试品有关物质含量的高效液相色谱分析方法，该检测方法中，溶剂不干扰杂质检测，方法专属性良好，且该检测方法简便﹑快速﹑准确﹑灵敏度高﹑重复性好﹑准确度好。
本发明提供的方法可以准确测定鲁比前列酮供试品中上述已鉴定杂质(式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物、式V化合物)，且主峰与相邻杂质峰的分离度≥1.2、各杂质间的分离度≥1.5，可以快速准确地进行供试品有关物质的定性及定量分析，保证鲁比前列酮质量的可控性。
附图说明
图1系统适用性溶液的色谱图
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1有关物质测定方法
取鲁比前列酮供试品适量，精密称定，用乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的溶液，作为供试品溶液；取鲁比前列酮对照品适量，精密称定，用乙腈溶解并稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为对照品溶液；另取鲁比前列酮、式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物、式V化合物对照品各适量，精密称定，用乙腈溶解并分别稀释制成每1ml中约含鲁比前列酮5mg的溶液，每1ml中约含式I化合物5μg的溶液、每1ml中约含式II化合物5μg的溶液、每1ml中约含式III化合物5μg的溶液、每1ml中约含式IV化合物5μg的溶液、每1ml中约含式V化合物5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。使用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱，以0.05％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱；
| 时间(分钟) | 0.05％磷酸水溶液(％) | 乙腈(％) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 10 | 40 | 60 |
| 15 | 40 | 60 |
| 25 | 10 | 90 |
| 35 | 10 | 90 |
| 36 | 70 | 30 |
| 45 | 70 | 30 |
流速为每分钟1.5ml；检测波长为294nm；柱温为30℃。精密量取系统适用性试验溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(图1)。量取对照品溶液50μl注入液相色谱仪，记录色谱图。再精密量取供试品溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
根据各色谱图，通过加校正因子/或不加校正因子的主成分自身对照法计算样品中各杂质含量：
其中，A’t为供试品溶液色谱图中式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物或式V化合物各自的峰面积；f’为校正因子，其中，式III化合物和式V化合物的含量计算按照加入校正因子进行计算，式I化合物、式II化合物和式IV化合物的含量计算按照不加入校正因子进行计算，式III化合物的校正因子为0.65，式V化合物的校正因子为0.63；A’为对照溶液中主峰的峰面积，即化合物L的峰面积。
在上述色谱图条件下，鲁比前列酮为双峰，鲁比前列酮1(化合物L)、鲁比前列酮2(化合物L’)及各有关物质的保留时间、分离度级含量见下表：
| 名称 | 保留时间(min) | 分离度 | 含量 |
| 鲁比前列酮1 | 12.426 | / | / |
| 鲁比前列酮2 | 13.498 | 3.576 | / |
| 式I化合物 | 14.313 | 2.685 | 未检出 |
| 式III化合物 | 15.094 | 2.185 | 0.04 |
| 式IV化合物 | 23.028 | 24.063 | 未检出 |
| 式II化合物 | 24.247 | 4.693 | 未检出 |
| 式V化合物 | 27.295 | 13.791 | 未检出 |
供试品中其他最大单杂含量为0.03％，总杂含量为0.07％
实施例2有关物质测定重复性实验
取供试品适量，加乙腈溶解并稀释制成每1ml约含5mg的溶液，作为供试品溶液，平行配制六份，按照实施例1中所述方法，进样分析，用自身对照法计算各杂质及总杂含量，考察本方法的重复性。测定结果见下表：
重复性试验测定结果表
| 样品 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 式III化合物(％) | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.05 |
| 式I化合物(％) | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| 式IV化合物(％) | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| 式II化合物(％) | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| 式V化合物(％) | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| 其他最大单杂(％) | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
| 总杂(％) | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.08 |
由上表可见，六次测定结果显示，式III化合物在0.04％～0.05％，最大单杂0.03％，总杂0.07％～0.08％之间波动，说明本方法重复性良好。
实施例3有关物质中间精密度实验
按实施例1所述方法，两位分析人员分别在两台不同的高效液相色谱仪上，按照有关物质测定方法进行测定，统计各杂质及总杂含量。有关物质测定方法中间精密度结果见下表：
有关物质中间精密度结果表
由上表可见，中间精密度的结果显示，式III化合物含量在0.03％～0.05％，最大单杂含量为：0.03％～0.04％，总杂含量为：0.07％～0.10％之间波动，说明本方法中间精密度良好。
实施例4耐用性试验
取系统适用性溶液、供试品溶液，按照实施例1所述方法，通过将色谱条件的柱温、流速、有机相比例、色谱柱进行微小的变动，统计主峰与各杂质峰保留时间、分离度和杂质情况，考察该色谱条件的耐用性，结果见下表：
耐用性试验结果(保留时间)
注：表中柱温-5℃是指柱温为25℃，柱温+5℃是指柱温为35℃；流速-0.1mL/min是指流速为1.4mL/min，流速+0.1mL/min是指流速为1.6mL/min；有机相比例-2％是指各梯度乙腈比例均降低2％，相应的0.05％磷酸水溶液比例均增加2％；有机相比例+2％是指各梯度乙腈比例均增加2％，相应的0.05％磷酸水溶液比例降低2％；换色谱柱是指更换同型号(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm)的其他色谱柱。
耐用性试验结果(分离度)
注：表中柱温-5℃是指柱温为25℃，柱温+5℃是指柱温为35℃；流速-0.1mL/min是指流速为1.4mL/min，流速+0.1mL/min是指流速为1.6mL/min；有机相比例-2％是指各梯度乙腈比例均降低2％，相应的0.05％磷酸水溶液比例均增加2％；有机相比例+2％是指各梯度乙腈比例均增加2％，相应的0.05％磷酸水溶液比例降低2％；换色谱柱是指更换同型号(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm)的其他色谱柱。
耐用性试验结果(含量)
注：表中柱温-5℃是指柱温为25℃，柱温+5℃是指柱温为35℃；流速-0.1mL/min是指流速为1.4mL/min，流速+0.1mL/min是指流速为1.6mL/min；有机相比例-2％是指各梯度乙腈比例均降低2％，相应的0.05％磷酸水溶液比例均增加2％；有机相比例+2％是指各梯度乙腈比例均增加2％，相应的0.05％磷酸水溶液比例降低2％；换色谱柱是指更换同型号(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×250mm，5μm)的其他色谱柱。
由上述实验结果可见，各条件下各峰保留时间基本保持不变，鲁比前列酮与杂质间的分离度均大于1.5，杂质按面积归一化计算，式III化合物含量在0.05％～0.09％，最大未知单杂0.03％～0.06％，总杂0.08％～0.15％之间波动，能满足有关物质测定的检测要求，实验表明该方法耐用性较好。
实施例5鲁比前列酮及各有关物质的检测限和定量限
取鲁比前列酮、式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物、式V化合物适量(约10mg)，分别置于100.0mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，作为各自杂质的储备溶液。然后分别取各储备液适量，置量瓶中，进行逐级稀释，并将稀释后的溶液进样测定，确定各杂质的检测限和定量限。以信噪比S/N＝3计算，对应样品浓度为检测限；以信噪比S/N＝10计算，对应样品浓度为定量限。结果见下表
鲁比前列酮和各杂质定量限检测限表
实施例6式I-2化合物的制备
将3.0g Dess-Martin氧化剂和18.0g二氯甲烷加入到反应瓶中，冷却至0℃～5℃。将1.5g化合物I-1的二氯甲烷(7.0g)溶液滴加到上述混合物中，控制内温0℃～10℃。滴加完毕后，内温升至25℃～35℃，搅拌3h～5h。TLC监控反应至终点(乙酸乙酯：正己烷＝1:3，磷钼酸显色)。将50ml饱和碳酸氢钠溶液缓慢加入到反应液中，搅拌15min～30min。加入10.0g二氯甲烷萃取，分液，水层用15.0g二氯甲烷反萃取，合并二氯甲烷层。用15.0g纯化水洗涤，1.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩干得到黄色油状物1.2g(化合物I-2粗品)。将化合物I-2粗品用柱层析进行纯化，得到油状物1.0g，即化合物I-2。
实施例7化合物I的制备
在反应瓶中加入6.0g醋酸、2.5g纯化水、2.0g THF配成混合溶液，将实施例5中柱层析纯化后得到的1.0g化合物I-2用上述混合液溶解，升温至45℃～55℃搅拌反应6h～10h。TLC监控反应至终点(乙酸乙酯:正己烷＝1:3，磷钼酸显色)。反应结束后，将反应液冷却至25℃，将反应液倒入25.0g纯化水中，用乙酸乙酯(25ml*2)萃取两次，合并乙酸乙酯层。用纯化水(20g*2)洗涤两次，再分别用饱和碳酸氢钠溶液(6.0g)洗涤，10％氯化钠溶液(6.0g)洗涤，1.0g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩得到0.8g化合物I粗品。用柱层析纯化，得到油状物化合物I(410mg)纯度为97.2％(HPLC)。
氢谱：δ7.59(m,1H)，δ6.20(m,1H)，δ5.48(m,1H)，δ5.38(m,1H)，δ2.77(t,2H)，δ2.66(m,1H)，δ2.38(m,3H)，δ2.12(m,2H)，δ2.04(m,2H)，δ1.85(m,2H)，δ1.77(m,2H)，δ1.55(m,2H)，δ1.41(m,4H)，δ0.95(t,3H)
碳谱：δ210.7，δ200.5(t)，δ170.6，δ165.9，δ133.6，δ131.2，δ126.6，δ118.3(t)，δ51.0，δ46.0，δ33.7，δ33.2，δ32.1(t)，δ28.2，δ26.6，δ26.5，δ24.4，δ23.2(t)，δ22.4，δ13.7。
质谱：[M+H]+371.3。
实施例8化合物III的制备
将2.0g化合物L’与15ml乙腈加入到50ml反应瓶中，搅拌溶解至澄清，加入24g冰醋酸室温搅拌，升温40min，内温升至50℃后搅拌过夜，停止加热，加入1.5ml三氟乙酸反应至结束，在反应瓶中加入水，并用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤一次，再用饱和氯化钠溶液洗涤一次，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压干燥，得油状物0.6g，即的化合物III(HPLC＞97.0％)。
氢谱：δ7.57(m,1H)，δ6.16(m,1H)，δ2.77(t,2H)，δ2.67(m,1H)，δ2.34(t,2H)，δ1.83-2.01(m,5H)，δ1.59-1.73(m,3H)，δ1.34-1.45(m,11H)，δ0.96(t,3H)。
碳谱：δ211.6，δ200.5(t)，δ179.6，δ165.5，δ133.6，δ118.3(t)，δ51.2，δ46.6，δ33.9，δ33.6，δ32.1(t)，δ31.0，δ29.3，δ28.7，δ26.8，δ26.7，δ24.5，δ23.2(t)，δ22.3，δ13.7。
质谱：[M+H]+373.2。
Claims (21)
1.一种鲁比前列酮有关物质的分析方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈，按下表梯度洗脱：
；
其中，所述流动相的流速为0.5-1.6ml/min；反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外吸收检测器、示差折光检测器或蒸发光散射检测器；所述反相色谱柱的柱温为20-40℃。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述流动相的流速为选自0.5ml/min、1.0ml/min、1.4ml/min、1.5ml/min和1.6ml/min。
3.如权利要求2所述的分析方法，其特征在于：所述流动相的流速为1.5ml/min。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述反相色谱柱选自Agilent ZORBAXSB-C18，其规格为250mm×4.6mm，5μm。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法采用紫外吸收检测器，且其检测波长为292-296nm。
6.如权利要求5所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法检测波长为292nm、293nm、294nm、295nm或296nm。
7.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于：所述分析方法检测波长为294nm。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述反相色谱柱的柱温为25-35℃。
9.如权利要求8所述的分析方法，其特征在于：所述反相色谱柱的柱温为30℃。
10.一种鲁比前列酮有关物质的分析方法，其特征在于：
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是紫外吸收检测器，检测波长是294nm；
色谱柱是反相色谱柱，反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料，柱温为30℃；
流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈，按下表进行梯度洗脱；
流速为1.5ml/min；
分别注入鲁比前列酮供试品溶液、对照溶液和系统适用性溶液；
所述系统适用性溶液包含化合物L和选自式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物和式V化合物中的一种或两种以上混合物；
通过主成分自身对照法计算样品中式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物和/或式V化合物的含量；其中，所述化合物L、式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物和式V化合物的结构如下
11.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于，所述的主成分自身对照法按加入校正因子计算或不加入校正因子进行计算。
12.如权利要求11所述的分析方法，其特征在于，式III化合物和式V化合物的含量计算按照加入校正因子进行计算，式I化合物、式II化合物和式IV化合物的含量计算按照不加入校正因子进行计算。
13.如权利要求12所述的分析方法，其特征在于，式III化合物的校正因子为0.65，式V化合物的校正因子为0.63。
14.一种鲁比前列酮有关物质的分析方法，其特征在于：
(1)流动相溶液为0.05％磷酸水溶液和乙腈；
(2)式I化合物定位溶液配制：取式I化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式I化合物，其结构式为：
(3)式II化合物定位溶液配制：取式II化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式II化合物，其结构式为：
(4)式III化合物定位溶液配制：取式III化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式III化合物，其结构式为：
(5)式IV化合物定位溶液配制：取式IV化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式IV化合物，其结构式为：
(6)式V化合物定位溶液配制：取式V化合物对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述的式V化合物，其结构式为：
(7)化合物L定位溶液配制：取化合物L对照品，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述化合物L，其结构式为：
(8)系统适用性溶液配制：取式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物、式V化合物和化合物L各适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得；
(9)供试品溶液配制：取鲁比前列酮供试品适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释，定容，摇匀，即得；
(10)对照溶液配制：精密量取供试品溶液适量，加乙腈稀释100倍，作为对照溶液；
(11)供试品测定：采用反相色谱柱，反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料，流动相为0.05％的磷酸水溶液和乙腈，调整流速为1.5ml/min，柱温为30℃；检测波长为294nm；进样量为50μl；分别量取流动相溶液、式I化合物定位溶液、式II化合物定位溶液、式III化合物定位溶液、式IV化合物定位溶液、式V化合物定位溶液和化合物L定位溶液、系统适用性溶液﹑供试品溶液和对照溶液，分别注入液相色谱仪，按下表进行梯度洗脱，记录各色谱图；
；
(12)含量计算：根据各色谱图，通过加校正因子或不加校正因子的主成分自身对照法计算样品中各杂质含量：
其中，A’t为供试品溶液色谱图中式I化合物、式II化合物、式III化合物、式IV化合物或式V化合物各自的峰面积；f’为校正因子，A’为对照溶液中主峰的峰面积，即化合物L的峰面积。
15.如权利要求10-14任意一项所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，式I化合物含量不高于0.50％，式II化合物含量不高于0.50％，式III化合物含量不高于1.00％，式IV化合物含量不高于0.50％，式V化合物含量不高于0.50％，其他未知单个杂质的含量均不高于0.50％。
16.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，式I化合物含量不高于0.10％。
17.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，式II化合物含量不高于0.10％。
18.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，式III化合物含量不高于0.50％。
19.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，式IV化合物含量不高于0.10％。
20.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，式V化合物含量不高于0.10％。
21.如权利要求15所述的分析方法，其特征在于，供试品溶液中，其他未知单个杂质的含量不高于0.10％。
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