CN115420826B - 一种枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中杂质的分离检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种同时分离并检测枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中多种杂质的方法，采用所述方法对枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸进行高效液相色谱检测，可以同时准确分离并定量检测枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中四种已知杂质，所述方法的专属性强，并且检测限和定量限低，具有良好的分离度。
Description
发明领域
本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种同时分离并测定枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中多种杂质的方法。
发明背景
枸橼酸爱地那非作为枸橼酸西地那非的新型衍生物，是一种5型磷酸二酯酶(Phosphodieseterase 5，PDE5)抑制剂，用于治疗男性勃起功能障碍(ErectileDysfunction，ED)。其化学名为：1-〔3-(6，7-二氢-1-甲基-7-氧代-3-丙基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5-基)-4-乙氧基苯磺酰基〕-顺式-3,5-二甲基哌嗪枸橼酸盐(C23H32N6O4S·C6H8O7)，其结构式为：
有关物质(杂质)及其含量是反映药品纯度的直接指标，控制/降低有关物质数量及其含量是药品质量研究的关键内容。在枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中，目前已知的主要杂质为杂质17：邻羟基苯甲酸；杂质3：对乙氧基苯甲酸；杂质4：间乙氧基苯甲酸；杂质2：邻乙氧基苯甲酸乙酯，来自于工艺杂质、降解产物等，结构式如下：
通过检索国内外文献及专利，仅检索到：
专利1：CN 112198243 A公开了一种枸橼酸西地那非有关物质的检测方法，该方法采用超高效液相色谱方法进行检测，以缓冲液-甲醇-乙腈为流动相，所述缓冲液pH为5.5～6.8，可快速对枸橼酸西地那非7种已知的主要杂质A、B、C、D、E、F、G进行分离检测，缩短检测时间。7种已知杂质分别为：
专利2：CN 114062534 A通过高效液相色谱-质谱串联方法，实现对枸橼酸爱地那非原料药中的遗传毒性杂质4-氨基-1-甲基-3-正丙基吡唑-5-甲酰胺(SM3)超高灵敏度的检测方法，其中液相条件采用：Agilent Zorbax SB phenyl(4.6mm×75mm，3.5μm)色谱柱，流动相为0.01％甲酸水溶液-甲醇(40：60)，质谱条件采用正离子MRM检测模式。采用上述条件对枸橼酸爱地那非原料药中的遗传毒性杂质SM3进行检测。
以上两项专利介绍了枸橼酸西地那非杂质和衍生物枸橼酸爱地那非遗传毒性杂质的分离检测方法，并未涉及到枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中的4种已知杂质的分离检测方法，无法准确控制邻乙氧基苯甲酸的质量。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷与不足，本发明的第一方面建立了一种对枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中的四种已知杂质进行分离和检测的高效液相色谱方法，使最终成品枸橼酸爱地那非药品安全、有效且质量可控。
本发明方法同时测定4种已知杂质，包括杂质17：邻羟基苯甲酸；杂质3：对乙氧基苯甲酸；杂质4：间乙氧基苯甲酸；杂质2：邻乙氧基苯甲酸乙酯；同时对邻乙氧基苯甲酸中3种已知杂质，包括杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)进行了前端质量控制。
本发明方法分离效果显著(分离度大于1.5)、专属性强、灵敏度显著提升(最低定量限为0.28μg/mL，最低检测限低至0.08μg/mL)、回收率接近100％、测定准确度显著提高，测定范围广、可重复性和中间精密度优异、耐用性良好能够对邻乙氧基苯甲酸中的杂质进行准确定量测定。
具体来说，本发明提供了如下技术方案：
一种枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中杂质的分离检测方法，所述测定方法包括：配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液，采用高效液相色谱方法对溶液中的杂质进行检测：
色谱条件中：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相为流动相A和流动相B的混合液，所述流动相A为甲醇溶液；流动相B为0.1～0.3％三乙胺水溶液，优选为0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整流动相的pH为3.5；
流动相A和流动相B的体积比，流动相A：流动相B＝30～50：50～70，优选为流动相A：流动相B＝40：60。
在一些实施方案中，所述色谱条件中，色谱柱中填充剂的粒径为3.0～5.0μm；色谱柱规格为4.6mm×150～250mm。
在一些优选的实施方案中，色谱柱类型为月旭XB C18，色谱柱规格为4.6mm×250mm，粒径为5.0μm。
在一些实施方案中，检测过程采用的检测波长为282～286nm，优选为284nm。
在一些实施方案中，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为20～30℃，优选为25℃。
在一些实施方案中，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min，在一些优选的实施方案中，流速为1.0mL/min。
在一些优选的实施方案中，配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液的过程为：
供试品溶液：称量枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸，采用稀释剂溶解，作为供试品溶液；
混合杂质对照品溶液：分别量取邻乙氧基苯甲酸和杂质17、杂质3、杂质4和杂质2中的至少两种，用稀释剂溶解，作为混合杂质对照品溶液；优选的是，量取邻乙氧基苯甲酸和至少分别量取杂质17、杂质3、杂质4和杂质2中的杂质3、杂质4，用稀释剂溶解，作为混合杂质对照品溶液；
所述杂质17：邻羟基苯甲酸；
杂质3：对乙氧基苯甲酸；
杂质4：间乙氧基苯甲酸；
杂质2：邻乙氧基苯甲酸乙酯；
杂质的结构式如下：
在一些优选的实施方案中，所述供试品溶液和所述混合杂质对照品溶液采用流动相为稀释剂，流动相A和流动相B的体积比为30～50：50～70，优选为40：60，以稀磷酸调整流动相B的pH为3.5。
在一些实施方案中，进样体积为：10～30μL，优选的进样体积为20μL。
在一些优选的实施方案中，所述邻乙氧基苯甲酸中的杂质为以下中的一种或多种：
杂质17：邻羟基苯甲酸；
杂质3：对乙氧基苯甲酸；
杂质4：间乙氧基苯甲酸；
杂质2：邻乙氧基苯甲酸乙酯。
本发明的第二方面建立了一种乙氧基苯甲酸位置异构体的分离检测方法，所述测定方法包括：配制供试品溶液和混合对照品溶液，采用高效液相色谱方法对溶液中的乙氧基苯甲酸位置异构体进行检测：
色谱条件中：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相为流动相A和流动相B的混合液，所述流动相A为甲醇溶液；流动相B为0.1～0.3％三乙胺水溶液，优选为0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整流动相的pH为3.5；
流动相A和流动相B的体积比为30～50：50～70，优选流动相A和流动相B的体积比为40：60。
在一些实施方案中，所述色谱条件中，色谱柱中填充剂的粒径为3.0～5.0μm；色谱柱规格为4.6mm×150～250mm；
在一些优选的实施方案中，色谱柱类型为月旭XB C18，色谱柱规格为4.6mm×250mm，粒径为5.0μm。
在一些实施方案中，检测过程采用的检测波长为282～286nm，优选为284nm。
在一些实施方案中，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为20～30℃，优选为25℃。
在一些实施方案中，所述流动相的流速为0.8～1.2mL/min，优选为1.0mL/min。
在一些优选的实施方案中，配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液的过程为：
供试品溶液：称量待测乙氧基苯甲酸位置异构体，采用稀释剂溶解，作为供试品溶液；
混合对照品溶液：至少分别量取邻乙氧基苯甲酸、间乙氧基苯甲酸、对乙氧基苯甲酸中的两种，用稀释剂溶解，作为混合对照品溶液；优选的是，至少分别量取邻乙氧基苯甲酸、间乙氧基苯甲酸、对乙氧基苯甲酸中的间乙氧基苯甲酸、对乙氧基苯甲酸，用稀释剂溶解，作为混合对照品溶液；进一步优选的是，所述混合对照品溶液中还包括乙氧基苯甲酸和/或邻乙氧基苯甲酸乙酯。
在一些优选的实施方案中，所述供试品溶液和混合对照品溶液采用流动相为稀释剂。
在一些实施方案中，进样体积为：10～30μL，优选的进样体积为20μL。
在一些优选的实施方案中，所述乙氧基苯甲酸位置异构体为：邻乙氧基苯甲酸、间乙氧基苯甲酸、对乙氧基苯甲酸。
发明的有益效果如下：
本发明提供了一种同时分离和检测枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中4种已知杂质的方法，能实现同时分离和检测以下4种杂质，包括：杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)。
采用所述方法能对邻乙氧基苯甲酸的质量进行准确控制，其具有：分离效果显著(分离度大于1.5)、灵敏度提高显著(定量限和检测限低)、回收率接近100％、测定准确度增加显著，测定范围广、可重复性和中间精密度优异、耐用性良好等特点。
具体来说：
1)采用本发明分离方法，4种已知杂质特征峰的分离度大于1.5，各特征峰之间不存在相互干扰，分离度良好，检测方法的专属性强；
2)检测上述四种杂质的最低定量限为0.28μg/mL，相当于杂质限度浓度标准(供试品溶液浓度的1％)的三十五分之一以下；最低检测限为0.08μg/mL，相当于杂质限度浓度标准(供试品溶液浓度的1％)的一百二十五分之一以下，灵敏度显著提高；
3)上述4种已知杂质回收率均保持在在92％～105％范围内，最优能达到99.9％；并且多次检测的回收率RSD均小于3％，相较于一般标准要求的回收率RSD≤10.0％的标准，本发明检测方法的RSD降低了3倍以上，准确性提升显著；
4)在限定浓度范围内，邻乙氧基苯甲酸与杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)的特征吸收峰面积与其对应浓度之间表现出良好的的线性关系，线性方程的线性相关系数r＞0.999，最优能达到0.9999，线性关系良好；相较于一般标准要求的线性相关系数r＝0.99，测定的准确度提高了两个数量级；其检测方法的准确度提高显著，测定范围更广；
5)本发明分离检测方法对各杂质的检测结果保持一致，体现出良好的可重复性和精密度；
6)改变不同色谱条件和色谱柱批次，邻乙氧基苯甲酸中杂质的检测结果保持一致，说明本发明在上述条件范围内均能实现良好、准确的检测效果，并且在上述条件范围内，测定结果不受上述条件变化的影响，其表现出良好且显著的耐用性。
通过此方法能够通过准确控制邻乙氧基苯甲酸的质量，进而提升新药枸橼酸爱地那非的质量，有利于新药质量控制的安全推广与应用。
附图说明
图1为实施例3对邻乙氧基苯甲酸中杂质测定的专属性空白溶剂色谱图；
图2为实施例3检测爱地那非原料药邻乙氧基苯甲酸中各已知杂质定位色谱图：其中A为空白溶液、B为杂质17(邻羟基苯甲酸)、C为供试品、D为杂质3(对乙氧基苯甲酸)、E为杂质4(间乙氧基苯甲酸)、F为杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)；
图3为实施例3对邻乙氧基苯甲酸的混合杂质对照品溶液进行测定的色谱图；
图4为实施例7中邻乙氧基苯甲酸的线性回归曲线图；
图5为实施例7中杂质17(邻羟基苯甲酸)的线性回归曲线图；
图6为实施例7中杂质3(对乙氧基苯甲酸)的线性回归曲线图；
图7为实施例7中杂质4(间乙氧基苯甲酸)的线性回归曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
实施例1：专属性试验
1-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
空白溶剂：与稀释剂相同；
供试品溶液：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1mL含1mg邻乙氧基苯甲酸的溶液，作为供试品溶液；
杂质储备液：取杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL含0.1mg的溶液，分别作为杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)储备液；
杂质17(邻羟基苯甲酸)定位溶液：精密量取杂质17(邻羟基苯甲酸)储备液适量，以稀释剂稀释成每1mL含10μg的溶液，即得。
杂质3(对乙氧基苯甲酸)定位溶液：精密量取杂质3(对乙氧基苯甲酸)储备液适量，以流动相稀释成每1mL含10μg的溶液，即得。
杂质4(间乙氧基苯甲酸)定位溶液：精密量取杂质4(间乙氧基苯甲酸)储备液适量，以稀释剂稀释成每1mL含10μg的溶液，即得。
杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)定位溶液：精密量取杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)储备液适量，以稀释剂稀释成每1mL含10μg的溶液，即得。
混合杂质对照品溶液：取邻乙氧基苯甲酸10mg，精密称定，置10mL量瓶中，精密量取杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)储备液分别适量，同置10mL量瓶中，用稀释剂溶解稀释制成每1mL含杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)各10μg的溶液，摇匀，即得混合杂质对照品溶液。
1-2.测试条件：
仪器：高效液相色谱仪；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择色谱柱规格为：月旭XB，4.6mm×250mm，5.0μm的色谱柱；
流动相：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
柱温：25℃；
进样量：20μL；
检测器：紫外检测器；
检测波长：284nm；
流速：1.0mL/min；
洗脱方式：等度洗脱；
洗脱时间：150min。
1-3.实验步骤及结论：
精密量取上述配制空白溶液、供试品溶液、各杂质定位溶液和混合杂质对照品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表1和2。
表1专属性-定位试验结果
| 测定样品 | 空白溶剂 | 供试品溶液 |
| 邻乙氧基苯甲酸特征峰的保留时间(min) | / | 18.234 |
表2系统适用性试验结果
结论：
采用高效液相色谱仪对上述样品进行分离检测，由试验结果可知：
表1中采用空白溶剂进行专属性定位试验，由图1可知，空白溶剂中色谱图中没有产生多余特征峰，表明空白溶剂不干扰主峰及各杂质测定；并且由供试品溶液的的谱图可知，邻乙氧基苯甲酸特征峰的保留时间为18.234min。
表2为采用杂质定位溶液对各已知杂质进行定位的检测结果，结合图2可知，杂质17邻羟基苯甲酸(B)的保留时间为13.773min、杂质3对乙氧基苯甲酸(D)的保留时间为41.657min、杂质4间乙氧基苯甲酸(E)的保留时间为44.952min和杂质2邻乙氧基苯甲酸乙酯(F)的保留时间为118.055min。
采用混合杂质对照品溶液进行系统适用性试验(图3)，结果发现各杂质与相邻特征峰杂质之间分离度均大于1.5，最高达22.029；且杂质与主峰之间分离度均大于1.5，分离度良好，满足爱地那非原料药邻乙氧基苯甲酸中4种已知杂质测定的要求。
实施例2：色谱柱的选择
在实施例1的基础上，改变色谱柱的种类，其他色谱条件保持不变，对枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中的4种已知杂质进行检测。
其中，实施例1的色谱柱类型：月旭XB C18，4.6×250mm，5.0μm；
改变色谱柱类型，其中：
实施例2-方法1的色谱柱为：Agilent Zorbax C8，4.6×250mm，5.0μm；
实施例2-方法2的色谱柱为：依利特Kromasil C18，4.6×250m，5.0μm；
其他参数和步骤与实施例1相同。精密量取20μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
结论：
采用实施例1中月旭XB C18(4.6×250mm，5.0μm)色谱柱，其中4个已知杂质峰和邻乙氧基苯甲酸的特征峰分离度均大于1.5，显示出良好的分离度。
采用实施例2-方法1中Agilent Zorbax C8，(4.6×250mm，5.0μm)色谱柱以及实施例2-方法2中依利特Kromasil C18，(4.6×250m，5μm)色谱柱得到的色谱图，分离度差，并且杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)的峰出现部分重合，二者无法正常分离。
由上述分离度对比可知，采用实施例1月旭XB C18(4.6×250mm，5.0μm)色谱柱能实现对枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中4种杂质的分离检测，实施例2方法1和方法2使用Agilent Zorbax C8，(4.6×250mm，5.0μm)和依利特Kromasil C18，(4.6×250m，5μm)色谱柱均不能达到分离效果。
因此，采用本发明以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，能实现枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)的良好分离。其中，采用月旭XB C18(4.6×250mm，5.0μm)色谱柱时，分离效果最优。
实施例3：流动相的选择
在实施例1的基础上，改变流动相比例，其他色谱条件保持不变，对枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中4种已知杂质进行检测。
其中，实施例1中流动相体积比为流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
方法1改变流动相体积比为流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝25：75；
方法2改变流动相体积比为流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝55：45；
其他测试条件与实施例1相同，精密量取20μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
结论：
通过上述三种不同体积比的流动相对邻乙氧基苯甲酸中的杂质进行高效液相色谱分析，发现：
实施例1中，采用流动相A(甲醇)和流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)作为流动相，控制二者体积比为流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60时，得到的谱图中全部杂质均有出峰响应，并且各个特征峰之间的分离度良好。
实施例3方法1中，采用体积比为流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝25：75时，各杂质在180min的时间内均未出现特征峰，保留时间太长无法洗脱。
实施例3方法2中，采用体积比为流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶，以稀磷酸调整pH为3.5)＝55：45时，主峰(邻乙氧基苯甲酸特征峰)和杂质17(邻羟基苯甲酸)出峰过早，且杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)的特征峰不能正常分离。
通过上述不同比例流动相的实验结果证明，采用实施例1的流动相A(甲醇)和流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH3.5)，控制二者体积比保持40：60时能实现邻乙氧基苯甲酸中4种已知杂质的分离检测，并且主峰(邻乙氧基苯甲酸特征峰)和4种杂质的特征峰分离度良好，分离效果显著。
因此，采用本发明流动相A(甲醇)和流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)作为流动相，控制二者比例为流动相A(甲醇)：流动相B＝30～50:50～70，能实现枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)的良好分离；当二者比例为流动相A(甲醇)：流动相B＝40：60时，分离效果最好。
实施例4：破坏性试验
强制降解试验是在较为剧烈的条件下，如采用强光照射、高温、高湿、酸碱破坏及水解还有氧化破坏等方法，加速对样品进行破坏，目的是通过考察样品的降解产物和主峰以及已知杂质的分离情况，来评估分析方法的有效性和适用性。同时采用光二极管阵列检测，进行峰纯度检查：降解实验所得的图谱中，当峰纯度大于0.999时，判断该测定方法满足测定的要求。
4-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60，以稀磷酸调整pH为3.5；
空白溶剂：同稀释剂；
①未破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得未降解样品；
②酸空白溶剂样品：精密量取空白溶剂，置25mL量瓶中，精密加入1mol/L的盐酸溶液1mL，摇匀，于60℃水浴8小时，取出冷却，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
酸破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，精密加入1mol/L的盐酸溶液1mL，摇匀，于60℃水浴8小时，取出冷却，精密加入1mol/L氢氧化钠溶液1mL中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得酸降解样品；
③碱空白溶剂样品：精密量取空白溶剂，置25mL量瓶中，精密加入1mol/L的氢氧化钠溶液1mL，摇匀，于60℃水浴8小时，取出冷却，精密加入1mol/L盐酸溶液1mL中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
碱破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，精密加入1mol/L的氢氧化钠溶液1mL，摇匀，于60℃水浴8小时，取出冷却，精密加入1mol/L盐酸溶液1mL中和，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得碱降解样品；
④氧化破坏空白溶剂样品：精密量取空白溶剂，置25mL量瓶中，精密加入3％双氧水1mL，摇匀，于60℃水浴8小时，取出冷却，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
氧化破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，精密加入3％双氧水1mL，摇匀，于60℃水浴8小时，取出冷却，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得氧化降解样品；
⑤水解破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，精密加入水1mL，摇匀，于60℃水浴8h，取出冷却，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得水解样品；
⑥光照破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，于低温光照仪内4500lx±500lx光照6天，取出冷却，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得光照降解样品；
⑦高温破坏样品：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，于105℃放置16小时，取出冷却，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得高温降解样品。
4-2.实验步骤及结论：
精密量取上述各降解条件下的样品溶液及空白溶剂样品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪中，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，结果见表3。其中，峰纯度可用来检查色谱峰是否为光谱性的纯净，判断是单个化合物还是多个化合物。物料守恒计算通过如下公式进行计算：
注：A破坏总面积为各降解条件下样品的色谱峰总面积，A未破坏总面积为未破坏样品的色谱峰总面积，m未破坏为未破坏样品的称样量，m破坏为各降解条件下样品的称样量。
表3邻乙氧基苯甲酸中杂质测定破坏试验结果
结论：
通过高效液相色谱对未降解样品和各降解条件下样品进行检测，结果显示：
邻乙氧基苯甲酸在酸、碱、氧化、水解、光照、高温等破坏条件下邻乙氧基苯甲酸占比大于98％，表明邻乙氧基苯甲酸纯度未发生明显变化，在各降解条件下均未产生明显的降解产物，稳定性高；
邻乙氧基苯甲酸在各降解条件下物料守恒比例大于98％，表明物料基本守恒；
邻乙氧基苯甲酸在各降解条件下主峰与前后峰分离度均大于1.5，表明分离度良好；
各样品溶液的邻乙氧基苯甲酸的色谱峰纯度均大于0.999，表明空白溶剂的存在并不干扰其中的杂质测定；本发明方法满足邻乙氧基苯甲酸的测定要求；
以上结果表明此分析方法在各降解条件下均具有有效性和适用性。
实施例5：进样精密度
5-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
供试品溶液：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，制成每1mL中含1mg邻乙氧基苯甲酸溶液，摇匀，即得。
5-2.实验步骤及结论：
精密量取上述供试品溶液20μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，连续进样6次，记录色谱图和结果。相对标准偏差(RSD)计算采用如下公式：
表4邻乙氧基苯甲酸中4种已知杂质测定进样精密度结果
结论：采用上述分离检测条件，对邻乙氧基苯甲酸四种已知杂质进行检测，供试品溶液连续重复进样6次进样结果的保留时间的RSD控制在0.5％，峰面积的RSD值控制在0.1％以内，均小于1.0％，证明本发明检测方法的测量准确、误差小，精密度良好。
实施例6：检测限和定量限
6-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
供试品溶液：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，制成每1mL中含1mg邻乙氧基苯甲酸溶液，摇匀，即得；
灵敏度测试溶液：取邻乙氧基苯甲酸及相关已知杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)适量，精密称量，采用逐级稀释的方法，用稀释剂稀释至信/噪比(S/N)＝10:1及信/噪比(S/N)＝3:1，即为方法的定量限及检测限。
6-2.实验步骤及结论：
精密量取20μL灵敏度测试溶液注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，结果见表5。
表5邻乙氧基苯甲酸中杂质测定的检测限和定量限考察结果
结论：
采用上述分离条件，对邻乙氧基苯甲酸以及其中的4种已知杂质进行检测。其中，杂质17(邻羟基苯甲酸)的定量限和检测限最低，定量限低至0.28μg/mL，相当于杂质限度浓度标准(供试品溶液浓度的1％＝1mg/mL*1％＝10μg/mL)的三十五分之一以下；检测限低至0.08μg/mL，相当于杂质限度浓度标准(供试品溶液浓度的1％＝1mg/mL*1％＝10μg/mL)的一百二十五分之一以下。试验结果表明可以满足多种已知杂质的同时检测分离以及控制要求，灵敏度显著提高。
实施例7：线性与范围试验
7-1.邻乙氧基苯甲酸线性：
7-1-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
样品储备液：取邻乙氧基苯甲酸适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL含0.5mg的溶液，摇匀，即得；
线性样品储备液：精密量取样品储备液1mL，置100mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
线性样品溶液：精密量取线性样品储备液1mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性储备液1；按体积梯度依次增加1mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得线性样品溶液2～6；线性样品储备液，作为线性样品溶液7。具体配制如下表所示：
| 线性样品溶液 | 线性样品储备液(mL) | 稀释剂(mL) |
| 1 | 1 | 9 |
| 2 | 2 | 8 |
| 3 | 3 | 7 |
| 4 | 4 | 6 |
| 5 | 5 | 5 |
| 6 | 6 | 4 |
| 7 | 10 | 0 |
7-1-2.实验步骤及结论：
精密量取上述线性样品溶液1～7各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，以峰面积A(mV*min)为纵坐标，浓度c(μg/mL)为横坐标，进行线性回归分析，结果见表6和图4。
表6邻乙氧基苯甲酸线性试验结果
结论：邻乙氧基苯甲酸样品溶液在0.49μg/mL～4.95μg/mL浓度范围内，其线性回程为(图4)y＝17049.3154x-188.0638，线性相关系数(r)＝0.9998，大于0.999，邻乙氧基苯甲酸的峰面积和浓度呈良好的线性关系。
7-2.各已知杂质线性：
7-2-1.溶液配制：
稀释剂：选用甲醇和0.2％三乙胺水溶液，二者体积比为2:3；
杂质储备液：取杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL含0.1mg的杂质17(邻羟基苯甲酸)储备液、0.06mg的杂质3(对乙氧基苯甲酸)储备液和0.17mg的杂质4(间乙氧基苯甲酸)储备液；
混合杂质对照品线性储备液：分别精密量取杂质17(邻羟基苯甲酸)储备液、杂质3(对乙氧基苯甲酸)储备液和杂质4(间乙氧基苯甲酸)储备液各适量，加稀释剂稀释制成每1mL含4μg各杂质的溶液，即得；
杂质线性溶液：精密量取混合杂质对照品线性储备液1mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质线性溶液1；按体积梯度依次增加1mL，置10mL量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得杂质线性溶液2～6；混合杂质对照品线性储备液，作为杂质线性溶液7。具体配制如下表所示：
| 杂质线性溶液 | 混合杂质对照品线性储备液(mL) | 稀释剂(mL) |
| 1 | 1 | 9 |
| 2 | 2 | 8 |
| 3 | 3 | 7 |
| 4 | 4 | 6 |
| 5 | 5 | 5 |
| 6 | 6 | 4 |
| 7 | 10 | 0 |
7-2-2.实验步骤及结论：
精密量取杂质线性溶液1～7各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，以峰面积A(mV*min)为纵坐标，浓度c(μg/mL)为横坐标，进行线性回归分析，结果见表7、8、9和图5、6、7。
表7杂质17(邻羟基苯甲酸)线性试验结果
表8杂质3(对乙氧基苯甲酸)线性试验结果
表9杂质4(间乙氧基苯甲酸)线性试验结果
结论：
对各已知杂质进行线性试验发现，
杂质17(邻羟基苯甲酸)在0.42μg/mL～4.18μg/mL的浓度范围内其线性回归方程为(图5)y＝19499.2131x-46.5133，线性相关系数(r)＝0.9999，大于0.999，杂质17(邻羟基苯甲酸)的峰面积和浓度线性关系良好；
杂质3(对乙氧基苯甲酸)在0.41μg/mL～4.14μg/mL的浓度范围内其线性回归方程为(图6)y＝14830.5199x-1596.3298，线性相关系数(r)＝0.9998，大于0.999，杂质3(对乙氧基苯甲酸)的峰面积和浓度呈良好的线性关系；
杂质4(间乙氧基苯甲酸)在0.41μg/mL～4.12μg/mL的浓度范围内其线性回归方程为(图7)y＝12764.8874x-1225.2394，线性相关系数(r)＝0.9998，大于0.999，杂质4(间乙氧基苯甲酸)的峰面积和浓度呈良好的线性关系；
以上结果表明，各杂质在各线性浓度范围内线性相关系数均＞0.999，最优能达到0.9999，峰面积和浓度线性关系良好；相较于一般标准要求的相关系数r＝0.99，测定的准确度提高了两个数量级；其检测方法的准确度提高显著，测定范围更广。
7-3.校正因子：
7-3-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
线性溶液：由不同试验人员按照实施例7中7-1和7-2的方法配制邻乙氧基苯甲酸和各杂质的线性溶液。
7-3-2.实验步骤及结论：
由不同试验人员，在不同试验仪器上，精密量取邻乙氧基苯甲酸和各杂质的线性溶液20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图。分别计算各杂质相对于邻乙氧基苯甲酸的校正因子，结果见表10。
表10各杂质相对于枸橼酸爱地那非原料药邻乙氧基苯甲酸的校正因子试验
结论：校正因子试验测定结果显示，杂质17(邻羟基苯甲酸)校正因子为0.86；杂质3(对乙氧基苯甲酸)校正因子为1.16；杂质4(间乙氧基苯甲酸)校正因子为1.41，各杂质的校正因子均在0.9～1.1范围之外，故对杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)的测定采用自身对照法计算时，均需用校正因子校正计算试验结果。
实施例8：溶液稳定性
8-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
供试品溶液：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
8-2.实验步骤及结论：
将供试品溶液于室温条件下放置，分别于0、2、8、12、20、22、25和30小时精密量取20μL，注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图，结果见表11。
表11邻乙氧基苯甲酸中杂质测定的溶液稳定性结果
注：“ND”为未检出。
结论：供试品溶液在室温放置30小时，邻乙氧基苯甲酸的峰面积无明显变化，RSD值为0.11％；杂质17(邻羟基苯甲酸)含量无明显变化，检测结果一致，均为0.01％；杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和其他最大单杂和其他总杂均未检出，表明供试品溶液室温放置30小时内稳定性良好。
实施例9：回收率试验
9-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
杂质储备液：取杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)适量，精密称定，分别加稀释剂溶解并定量稀释制成每1mL含0.1mg杂质17(邻羟基苯甲酸)储备液、0.06mg杂质3(对乙氧基苯甲酸)储备液和0.17mg杂质4(间乙氧基苯甲酸)储备液的溶液，摇匀，即得；
混合杂质对照品溶液：分别精密量取上述杂质17(邻羟基苯甲酸)储备液、杂质3(对乙氧基苯甲酸)储备液和杂质4(间乙氧基苯甲酸)储备液适量，用稀释剂稀释成每1mL含2.5μg杂质17(邻羟基苯甲酸)、0.8μg杂质3(对乙氧基苯甲酸)和2.1μg的杂质4(间乙氧基苯甲酸)的混合杂质对照品溶液，即得，平行配制2份；
空白样品溶液：取邻乙氧基苯甲酸100mg，精密称定，置100mL量瓶，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
回收率样品溶液：取邻乙氧基苯甲酸100mg，精密称定，置100mL量瓶中，加适量稀释剂使溶解，分别加入杂质17(邻羟基苯甲酸)储备液、杂质3(对乙氧基苯甲酸)储备液和杂质4(间乙氧基苯甲酸)储备液，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为各浓度(80％、100％、120％)回收率样品溶液，平行配制3份。具体配制如下表所示：
9-2.实验步骤及结论：
精密量取上述各浓度回收率样品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，结果见表12～14。
表12杂质17(邻羟基苯甲酸)回收率测定结果
表13杂质3(对乙氧基苯甲酸)回收率测定结果
表14杂质4(间乙氧基苯甲酸)回收率测定结果
结论：
通过对各浓度回收率样品进行测试发现：
杂质17(邻羟基苯甲酸)的组间回收率为101.2％，RSD值为1.4％；
杂质3(对乙氧基苯甲酸)的组间回收率为99.1％，RSD值为2.6％；
杂质4(间乙氧基苯甲酸)的组间回收率为98.9％，RSD值为2.1％；
以上结果发现，各已知杂质的组间回收率均在92％～105％之间，最优能达到99.9％；RSD均小于3％，相较于一般标准要求的回收率RSD≤10.0％的标准，本发明检测方法的RSD降低了3倍以上，表明本检测方法的准确度显著提升。
实施例10：重复性试验
10-1.溶液配制：
稀释剂：流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝40：60；
供试品溶液：取邻乙氧基苯甲酸25mg，精密称定，置25mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置100mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，平行配制6份，记作：样1～样6；
10-2.实验步骤及结论：
精密量取上述样1～样6对照溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，结果见表15。
表15邻乙氧基苯甲酸方法学重复性结果
注：“ND”为未检出。
结论：
邻乙氧基苯甲酸中杂质的重复性测定结果显示：杂质17(邻羟基苯甲酸)含量均为0.01％，测定结果一致，重复性良好；其他已知杂质包括杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)及单一最大杂质均未检出，其他总杂质未检出；以上试验结果说明上述分离检测方法的稳定性良好，重复性能显著。
实施例11：中间精密度试验
于不同的时间，不同的试验人员，不同仪器按照重复性试验项下方法配制6份供试品溶液，记作样1～6。按照相同的色谱条件方法测定，色谱条件同实施例1，记录色谱图和结果，测定结果相对标准偏差(RSD)应小于10％，结果见下表16。
表16邻乙氧基苯甲酸方法学中间精密度测定结果
注：“ND”为未检出。
结论：进行中间精密度试验发现，杂质17(邻羟基苯甲酸)重复测定的6份样品中杂质17(邻羟基苯甲酸)含量均为0.01％，测定结果一致，RSD远远小于小于10％，中间精密度良好；其他已知杂质及单一最大杂质均未检出，其他总杂质未检出；以上结果表明本方法的中间精密度良好。
实施例12：精密度试验
统计重复性及中间精密度测定的12份样品结果，计算精密度结果，12份样品测定相对标准偏差(RSD)应小于10％，结果见下表17。
表17精密度试验测定结果
注：“ND”为未检出。
结论：通过统计12份供试品溶液精密度试验结果，发现各杂质含量均未见明显变化：杂质17(邻羟基苯甲酸)的含量均为0.01％，含量结果保持高度一致，RSD远远小于10％；其他已知杂质包括杂质3(对乙氧基苯甲酸)和杂质4(间乙氧基苯甲酸)及单一最大杂质均未检出，其他总杂质未检出，检测结果一致，以上结果表明本发明方法的精密度良好。
实施例13：耐用性试验
耐用性系指在测定色谱条件下微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。本品耐用性考察了在实施例1的检测条件的基础上，改变检测波长(±2nm)、柱温(±5℃)、流速(±0.2mL/min)、流动相pH值(±0.2)、流动相A(甲醇的比例变化±5％)以及更换不同批次色谱柱等条件下变化情况对测定结果各已知杂质的影响。结果见下表18。
表18耐用性试验结果
注：“ND”为未检出。
结论：耐用性试验结果显示，在实施例1的基础上，检测波长变化(±2nm)、柱温(+5℃)、流速变化(±0.2mL/min)、流动相pH值(±0.2)、流动相A(甲醇的比例变化±5％)，及更换不同批次色谱柱等色谱条件时，测定结果均未见变化：杂质17(邻羟基苯甲酸)的含量均为0.01％，其他已知杂质包括杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和单一最大杂质未检测，其他总杂质未检出，检测结果一致，试验表明本方法在检测波长282～286nm、柱温20～30℃、流速0.8～1.2mL/min、流动相pH3.3～3.7、流动相A(甲醇)：流动相B(0.2％三乙胺水溶液，以稀磷酸调整pH为3.5)＝(25～45)：(65～55)以及不同批次色谱柱条件下，检测邻乙氧基苯甲酸中杂质的耐用性良好。
对比例1
参照专利CN 112198243A的检测条件和方法，对本发明实施例供试品溶液和混合杂质对照品溶液中的杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)4种杂质进行分离检测。
表19本申请与对比文件研究方向对比
表20本申请与对比文件色谱条件对比
结论：
参照专利CN 112198243A的检测条件和方法，对本发明实施例供试品溶液和混合杂质对照品溶液中的杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)4种杂质进行分离检测。
通过分离结果可知，采用专利CN 112198243A的检测条件和方法无法分离检测邻乙氧基苯甲酸中的4种杂质。
对比例2
参照对比文件2“武婷,王超,王星,马强,张帆,刘柳.反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂.分析化学(Chinese Journal of Analytical Chemistry)2007 35(10)1439～1443”的检测条件和方法，对本发明实施例供试品溶液和混合杂质对照品溶液中的杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)4种杂质进行分离检测。
表21本申请与对比文件2研究方向对比
表22本申请与对比文件2色谱条件对比
结论：
参照对比文件2“武婷,王超,王星,马强,张帆,刘柳.反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂.分析化学(Chinese Journal of Analytical Chemistry)2007 35(10)1439～1443”的检测条件和方法，对本发明实施例供试品溶液和混合杂质对照品溶液中的杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)4种杂质进行分离检测。
通过分离结果可知，采用对比文件2“武婷,王超,王星,马强,张帆,刘柳.反相高效液相色谱法测定化妆品中的24种防腐剂.分析化学(Chinese Journal of AnalyticalChemistry)2007 35(10)1439～1443”的检测条件和方法无法分离检测邻乙氧基苯甲酸中的4种杂质。
综上所述，由上述结果可知，采用的分离检测条件得到的4种已知杂质特征峰的分离度大于1.5，分离度良好且显著；
采用本发明的方法检测杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)和杂质2(邻乙氧基苯甲酸乙酯)4种已知杂质的最低定量限为0.28μg/mL，相当于杂质限度浓度标准(供试品溶液浓度的1％)的三十五分之一以下；最低检测限低至0.08μg/mL，相当于杂质限度浓度标准(供试品溶液浓度的1％)的一百二十五分之一以下，灵敏度显著提高；
4种已知杂质回收率均保持在92％～105％范围内，最优能达到99.9％；并且多次检测的回收率RSD均小于3％，采用本发明分离方法准确度显著提高；
在限定浓度范围内，邻乙氧基苯甲酸与杂质17(邻羟基苯甲酸)、杂质3(对乙氧基苯甲酸)、杂质4(间乙氧基苯甲酸)的特征吸收峰面积与其对应浓度之间表现出良好的的线性关系，线性方程的相关系数r＞0.999，最优能达到0.9999，线性关系良好；相较于一般标准要求的相关系数r＝0.99，测定的准确度提高了两个数量级；其检测方法的准确度显著增加，测定范围更广；
采用的分离检测方法对各杂质的检测结果一致，精密度良好；
改变不同色谱条件和色谱柱批次，邻乙氧基苯甲酸中杂质的检测结果均保持一致，表现出良好且显著的耐用性。
本发明所采用的检测邻乙氧基苯甲酸4种已知杂质的方法为最优分离方法，可准确地对枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中的检出杂质进行定量质控，从而最终保证产品枸橼酸爱地那非药品安全、有效、质量可控。采用的高效液相色谱方法专属性强，灵敏度高，能够对邻乙氧基苯甲酸中的有关物质准确定量测定。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (27)
1.一种枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸中杂质的分离检测方法，所述杂质为杂质17、杂质3、杂质4和杂质2中至少两种；
所述杂质17为邻羟基苯甲酸；所述杂质3为对乙氧基苯甲酸；所述杂质4为间乙氧基苯甲酸；所述杂质2为邻乙氧基苯甲酸乙酯；杂质的结构式如下：
配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液，采用高效液相色谱方法对溶液中的杂质进行检测：
色谱条件中：
色谱柱为月旭XB C18色谱柱；
流动相为流动相A和流动相B的混合液，所述流动相A为甲醇溶液；流动相B为0.1~0.3%三乙胺水溶液，以稀磷酸调整流动相的pH为3.5；
流动相A和流动相B的体积比为40：60。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱条件中，流动相B为0.2%三乙胺水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述色谱条件中，色谱柱中填充剂的粒径为5.0μm；色谱柱规格为4.6mm×250mm。
4.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，检测过程采用的检测波长为282~286nm。
5.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，检测过程采用的检测波长为284nm。
6.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为20~30℃。
7.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为25℃。
8.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速为0.8~1.2mL/min。
9.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速为1.0mL/min。
10.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，配制供试品溶液和混合杂质对照品溶液的方法为：
供试品溶液：称量枸橼酸爱地那非原料药中起始物料邻乙氧基苯甲酸，采用稀释剂溶解，作为供试品溶液；
混合杂质对照品溶液：量取邻乙氧基苯甲酸、杂质3和杂质4，用稀释剂溶解，作为混合杂质对照品溶液。
11.根据权利要求1~3任一项所述的方法，所述供试品溶液和所述混合杂质对照品溶液采用流动相为稀释剂。
12.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，进样体积为：10~30μL。
13.根据权利要求1~3任一项所述的方法，其中，进样体积为：20μL。
14.一种乙氧基苯甲酸位置异构体的分离检测方法，所述乙氧基苯甲酸位置异构体为：邻乙氧基苯甲酸、间乙氧基苯甲酸、对乙氧基苯甲酸中的至少两种，所述分离检测方法包括：配制供试品溶液和混合对照品溶液，采用高效液相色谱方法对溶液中的乙氧基苯甲酸位置异构体进行检测：
色谱条件中：
色谱柱为月旭XB C18；
流动相为流动相A和流动相B的混合液，所述流动相A为甲醇溶液；流动相B为0.1~0.3%三乙胺水溶液以稀磷酸调整流动相的pH为3.5；
流动相A和流动相B的体积比为40：60。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述色谱条件中，流动相B为0.2%三乙胺水溶液。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，所述色谱条件中，色谱柱中填充剂的粒径为5.0μm；色谱柱规格为4.6mm×250mm。
17.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，检测过程采用的检测波长为282~286nm。
18.根据权利要求14-16任一项所述的方法，其中，检测过程采用的检测波长为284nm。
19.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为20~30℃。
20.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，所述色谱条件中，色谱柱的柱温为25℃。
21.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速为0.8~1.2mL/min。
22.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，所述流动相的流速为1.0mL/min。
23.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，配制供试品溶液和混合对照品溶液的方法为：
供试品溶液：称量待测乙氧基苯甲酸位置异构体，采用稀释剂溶解，作为供试品溶液；
混合对照品溶液：量取邻乙氧基苯甲酸、间乙氧基苯甲酸、对乙氧基苯甲酸，用稀释剂溶解，作为混合对照品溶液。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述混合对照品溶液中还包括邻乙氧基苯甲酸乙酯。
25.根据权利要求14~16任一项所述的方法，所述供试品溶液和混合对照品溶液采用流动相为稀释剂。
26.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，进样体积为：10~30μL。
27.根据权利要求14~16任一项所述的方法，其中，进样体积为：20μL。
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