CN104237399A - 测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法,在该方法中,采用十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱;采用pH为2.8~3.5的磷酸盐溶液为流动相A;以及采用乙腈作为流动相B,洗脱方式为等度洗脱。该方法能准确测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且该方法准确度高、分析时间短、专属性强。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域,涉及安立生坦原料药及其制剂含量的测定方法,具体地,涉及利用高效液相色谱法测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法。
背景技术
肺动脉高压是指各种原因引起的肺动脉压力持久增高,为罕见的慢性综合病症,表现为肺动脉缩小、破损及血压过高。肺动脉血管壁的增厚和损伤会促使血管缩小,小的血液凝块会在血管中形成,最终导致血管阻塞。因为右侧心肌不如左侧心肌强健,更容易受到损伤,因此血管阻力的增加会加重右侧心脏的工作负荷,最终导致患者右心衰竭而死亡。右心衰竭是所有类型肺动脉高压患者致残、致死的共同唯一因素,而肺动脉高压也是右心衰竭的最主要原因,其病因复杂,诊断、治疗棘手是该治疗领域长期以来发展缓慢的主要原因。
安立生坦(Ambrisentan)是一种新型的口服内皮素受体拮抗剂(ERA),该药物于2007年6月15日获得美国FDA批准,口服用于治疗肺动脉高血压,目前在国外已上市的为规格5mg和10mg片剂。
安立生坦及其制剂的分析方法尚未见报道。因此,对安立生坦及其制剂的含量测定方法的研究仍有待加强。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种利用高效液相色谱法测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法,其能够准确测定安立生坦及其制剂含量,并且分离度高、专属性强。
本发明提供了一种利用高效液相色谱法测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法。根据本发明的实施例,在该方法中,采用十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱;流动相由流动相A、流动相B组成,采用用磷酸调pH至2.8~3.5的磷酸盐溶液为流动相A;以及采用乙腈作为流动相B,洗脱方式为等度洗脱。发明人发现,该方法能够有效地分离安立生坦与其合成过程以及制剂引入的杂质和降解杂质,进而准确测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且该方法准确度高、分析时间短、专属性强。
根据本发明的实施例,通过对安立生坦原料药的酸破坏、碱破坏、氧化破坏等实验,进一步说明根据本发明实施例的本方法专属性强,能对安立生坦原料药及其制剂准确的进行含量测定。
根据本发明的实施例,检测波长为263nm。发明人将安立生坦供试品溶液在190nm~400nm进行扫描,发现在263nm处,安立生坦具有最大吸收波长,因此选择263nm作为安立生坦的检测波长。由此,检测安立生坦及其制剂含量的检测波长具有良好的专属性。
根据本发明的实施例,所述色谱柱的柱温为25~35摄氏度。由此,有利于将安立生坦和杂质分离。
根据本发明的实施例,所述磷酸盐溶液是4.5~5.5mmol/L的磷酸二氢钾(KH2PO4)溶液、4.5~5.5mmol/L的磷酸二氢钠(NaH2PO4)溶液的至少一种,用磷酸调节至pH为2.8~3.5而获得的。由此,有利于将安立生坦和存在的杂质分离。
根据本发明的实施例,在所述流动相中,所述磷酸盐溶液和乙腈的体积比例为(35~55)∶(65~45),洗脱方式为等度洗脱。由此,能够有效分离安立生坦和杂质,且能够准确测定安立生坦原料药及其制剂的含量。
根据本发明的实施例,包括以下步骤:
(1)取安立生坦原料药或制剂粉末,用乙腈超声溶解,离心,配制成安立生坦浓度为0.5mg/ml的供试品溶液;
(2)色谱条件:采用高效液相色谱法,采用十八烷基键合硅胶柱作为色谱柱,流动相由流动相A、流动相B组成,采用用磷酸调pH至2.8~3.5的磷酸盐溶液为流动相A,采用乙腈作为流动相B,柱温为25~35℃、流速为0.8~1.2ml/min、检测波长为263nm,进行等度洗脱,其中,在所述流动相中,所述磷酸盐溶液和乙腈的体积比例为(35~55)∶(65~45);
(3)取所述供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000,按外标法以峰面积计算,得到样品中安立生坦原料药及其制剂的含量。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的具体示例,采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.0、浓度为5mmol/L KH2PO4溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为45∶55,柱温为30摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.0毫升/分钟,进样体积为20μL,照上述的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图。理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的具体示例,采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至2.8、浓度为4.5mmol/L KH2PO4溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为35∶65,柱温为28摄氏度,检测波长为263nm,流速为0.8毫升/分钟,进样体积为20μL,照上述的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图。理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的具体示例,采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.5、浓度为5.5mmol/L KH2PO4溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为55∶45,柱温为35摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.2毫升/分钟,进样体积为20μL,照上述的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图。理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的具体示例,采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.0、浓度为5mmol/L的NaH2PO4溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为45∶55,柱温为30摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.0毫升/分钟,进样体积为20μL,照上述的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图。理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的具体示例,采用150×4.6mm,5μm的AgilentZobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至2.8、浓度为4.5mmol/L的NaH2PO4溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为35∶65,柱温为28摄氏度,检测波长为263nm,流速为0.8毫升/分钟,进样体积为20μL,照上述的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图。理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的具体示例,采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.5、浓度为5.5mmol/L的NaH2PO4溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为55∶45,柱温为35摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.2毫升/分钟,进样体积为20μL,照上述的色谱条件,注入液相色谱仪,记录色谱图。理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。由此,能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量,且准确度高、专属性强。
根据本发明的实施例,本发明具有如下有益效果:
1、根据本发明的实施例,通过等度洗脱的方式,确保了安立生坦的质量可控。采用此方法可以很好地分离安立生坦与其合成过程以及制剂引入的杂质和降解杂质,能准确测定安立生坦原料药及其制剂的含量。
2、根据本发明的实施例,本发明所建立的高效液相色谱法准确度高,分析时间短,所得的含量测定色谱图基线平稳、峰型对称。而且通过本发明所述对安立生坦原料药酸破坏、碱破坏、氧化破坏等实验证明本发明所述的利用高效液相色谱法测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法专属性强,能对安立生坦原料药及其制剂准确的进行含量测定。
附图说明
图1显示了根据本发明的一个实施例,安立生坦的紫外扫描图;
图2显示了根据本发明的一个实施例,安立生坦原料药含量测定典型色谱图;
图3显示了根据本发明的一个实施例,安立生坦原料药中的杂质与安立生坦在同一色谱条件下的分离色谱图;
图4显示了根据本发明的一个实施例,安立生坦原料药酸破坏色谱图;
图5显示了根据本发明的一个实施例,安立生坦原料药碱破坏色谱图;以及
图6显示了根据本发明的一个实施例,安立生坦原料药氧化破坏色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:检测波长的确定
取用无水乙醇制成的25μg/ml的安立生坦溶液,在紫外-可见分光光度计在190nm~400nm进行全扫描,安立生坦的紫外扫描图见图1。由图1可知,安立生坦的最大吸收波长为263nm,故选择263nm作为检测波长。
实施例2:对安立生坦的含量测定
仪器:高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱:Agilent Zobox SB-C18柱(150×4.6mm,5μm)
流动相:5mmol/L KH2PO4溶液(用磷酸调节pH至3.0)-乙腈(体积比为45∶55)
检测波长:263nm
流速:1.0ml/min
进样量:20μl
柱温:30℃
实验步骤:
(1)取安立生坦适量,用乙腈溶解并用乙腈-水(体积比为30∶70)定量稀释制成1ml含安立生坦0.5mg的供试品溶液。空白溶剂为乙腈-水(体积比为30∶70)。
(2)取(1)供试品溶液及空白溶剂照上述色谱条件,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图,理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000。安立生坦原料药含量测定典型色谱图见图2。
实施例3:对安立生坦的含量测定
色谱条件如下:
仪器:高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱:Agilent Zobox SB-C18柱(150×4.6mm,5μm)
流动相:4.5mmol/L KH2PO4溶液用磷酸调节pH至2.8-乙腈(35∶65)
检测波长:263nm
流速:0.8ml/min
进样量:20μl
柱温:25℃
实验步骤:同实施例2。
实施例4:对安立生坦的含量测定
色谱条件如下:
仪器:高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱:Agilent Zobox SB-C18柱(150×4.6mm,5μm)
流动相:5.5mmol/L KH2PO4溶液用磷酸调节pH至3.5-乙腈(55∶45)
检测波长:263nm
流速:1.2ml/min
进样量:20μl
柱温:35℃
实验步骤:同实施例2。
实施例5:安立生坦及其制剂的分析方法研究
1、色谱条件选择
通过实验分别比较:
本发明实施例2:以乙腈-5mmol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH至3.0)(55∶45)作为流动相,等度洗脱;
对比实施例:以甲醇-10mmol/L磷酸氢二钾溶液(磷酸调pH至6.5)(体积比为50∶50)作为流动相,等度洗脱;
结果表明:在本发明实施例2所述的等度洗脱条件下,分析时间为10分钟,基线平稳,峰型对称。而对比实施例所述的等度洗脱条件下,分析时间太长,另外,主峰与杂质分离度达不到要求。
故优选本发明流动相为乙腈和磷酸盐溶液。
2、检测条件的验证
(1)专属性
分别取安立生坦对照品和各杂质(杂质为合成路线中引入的杂质、以及降解产物杂质共6种,分别标记为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6)对照品适量,加乙腈-水(体积比为30∶70)制成每1ml含安立生坦500μg,各杂质约含0.5μg的混合溶液。结果表明主峰与各杂质分离度均大于1.5,专属性强。
(2)检测限
精密称取安立生坦对照品适量,加乙腈-水(体积比为30∶70)逐步稀释后的溶液,取20μl注入色谱仪,记录色谱图,当信噪比为3时,安立生坦的最小检出浓度为0.01μg/ml。
(3)线性
精密称取安立生坦对照品适量,加乙腈-水(体积比为30∶70)分别定量稀释成0.3571mg/ml,0.4081mg/ml,0.4591mg/ml,0.5101mg/ml,0.5611mg/ml,0.6121mg/ml,0.6631mg/ml的溶液。各取20μl注入色谱仪,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标进行线性回归,该条曲线的线性回归方程为y=17565.0852x+194.2179,r=0.9999,线性范围为0.3571~0.6613mg/ml。
(4)回收率
对照品溶液配制:取安立生坦对照品约25mg,精密称定,置50ml量瓶中,加15ml乙腈溶解,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
分别称取安立生坦原料药约0.240g、0.300g、0.360g,分别置于1、2、3号研钵中,再分别加入空白辅料8.00g,混匀;从1号研钵中精密称取细粉三份(约相当于安立生坦40mg);从2号研钵中精密称取细粉三份(约相当于安立生坦50mg);从3号研钵中精密称取细粉三份(约相当于安立生坦60mg)。将上述细粉分别置于100ml量瓶中,加入乙腈30ml,超声使安立生坦溶解,用水稀释至刻度,摇匀,离心至上清液完全澄清,取上清液,分别作为安立生坦片的回收率80%、100%、120%的供试品溶液。分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入色谱仪,计算回收率。该方法的平均回收率为100.5%,RSD为1.1%。
实施例6:安立生坦与杂质在同一色谱条件下的分离实验
色谱条件同实施例2。
实验步骤:
分别取安立生坦对照品和各杂质对照品适量,加乙腈-水(体积比为30∶70)制成每1ml含安立生坦500μg,其他各已知杂质约含0.5μg的混合溶液。
安立生坦原料药中的杂质与安立生坦在同一色谱条件下的分离色谱图见图3。由图3的结果可以看出,该色谱图中主峰与各杂质分离度均大于1.5,表明本发明的方法能够有效将安立生坦和杂质分离。
实施例7:对安立生坦原料药酸破坏的实验
色谱条件同实施例2。
实验步骤:
(1)取安立生坦约0.25g,精密称定,置100ml量瓶中,加乙腈-水(体积比为30∶70)溶解并稀释至刻度,作为溶液降解用母液。
(2)取母液5.0ml,置25-mL量瓶中,加入5ml 2mol/L HCl溶液,摇匀。将此溶液置于60℃水浴中加热1小时取样,加入2mol/L氢氧化钠溶液中和,用乙腈-水(体积比为30∶70)稀释至刻度,摇匀。
安立生坦原料药酸破坏色谱图见图4,由图4的结果可以看出,该色谱图破坏产生的杂质与主峰分离度良好。
实施例8:对安立生坦原料药碱破坏的实验
色谱条件同实施例2。
实验步骤:
(1)取安立生坦约0.25g,精密称定,置100ml量瓶中,加稀释液溶解并稀释至刻度,作为溶液降解用母液。
(2)取母液5.0ml,置25-mL量瓶中,加入5ml2mol/L氢氧化钠溶液,摇匀。将此溶液置于60℃水浴中加热15min取样,加入2mol/L HCl溶液中和,用乙腈-水(体积比为30∶70)稀释至刻度,摇匀。
安立生坦原料药碱破坏色谱图见图5,由图5的结果可以看出,该色谱图破坏产生的杂质与主峰分离度良好。
实施例9:对安立生坦原料药氧化破坏的实验
色谱条件同实施例2。
实验步骤:
(1)取安立生坦约0.25g,精密称定,置100ml量瓶中,加乙腈-水(体积比为30∶70)溶解并稀释至刻度,作为溶液降解用母液。
(2)取母液5.0ml,置25-mL量瓶中,加入5ml30%H2O2溶液,将此溶液置于60℃水浴中加热1小时后取样,用乙腈-水(体积比为30∶70)稀释至刻度,摇匀。
安立生坦原料药氧化破坏色谱图见图6,由图6的结果可以看出,该色谱图破坏产生的杂质与主峰分离度良好。
实施例10:对安立生坦的含量测定
仪器:高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱:Agilent Zobox SB-C18柱(150×4.6mm,5μm)
流动相:5mmol/L NaH2PO4溶液(用磷酸调节pH至3.0)-乙腈(体积比为45∶55)
检测波长:263nm
流速:1.0ml/min
进样量:20μl
柱温:30℃
实验步骤:
(1)取安立生坦适量,用乙腈溶解并用乙腈-水(体积比为30∶70)定量稀释制成1ml含安立生坦0.5mg的供试品溶液。空白溶剂为乙腈-水(体积比为30∶70)。
(2)取(1)供试品溶液及空白溶剂照上述色谱条件,分别注入高效液相色谱仪,记录色谱图。
实施例11:对安立生坦的含量测定
色谱条件如下:
仪器:高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱:Agilent Zobox SB-C18柱(150×4.6mm,5μm)
流动相:4.5mmol/L NaH2PO4溶液用磷酸调节pH至2.8-乙腈(35∶65)
检测波长:263nm
流速:0.8ml/min
进样量:20μl
柱温:25℃
实验步骤:同实施例10。
实施例12:对安立生坦的含量测定
色谱条件如下:
仪器:高效液相色谱仪配备紫外检测器
色谱柱:Agilent Zobox SB-C18柱(150×4.6mm,5μm)
流动相:5.5mmol/L NaH2PO4溶液用磷酸调节pH至3.5-乙腈(55∶45)
检测波长:263nm
流速:1.2ml/min
进样量:20μl
柱温:35℃
实验步骤:同实施例10。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二,,的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是两个或两个以上,除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种利用高效液相色谱法测定安立生坦原料药及其制剂含量的方法,其特征在于,
采用十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱;
流动相由流动相A、流动相B组成;
采用用磷酸调pH至2.8~3.5的磷酸盐溶液为所述流动相A;以及
采用乙腈作为所述流动相B,
洗脱方式为等度洗脱。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,检测波长为263nm。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述色谱柱的柱温为25~35摄氏度。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述磷酸盐溶液是将4.5~5.5mmol/L的磷酸二氢钾溶液、4.5~5.5mmol/L的磷酸二氢钠溶液的至少一种,用磷酸调节至pH为2.8~3.5而获得的。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在所述流动相中,所述磷酸盐溶液和乙腈的体积比例为(35~55)∶(65~45)。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取安立生坦原料药或制剂粉末,用乙腈超声溶解,离心,配制成安立生坦浓度为0.5mg/ml的供试品溶液;
(2)色谱条件:采用十八烷基键合硅胶柱作为色谱柱,流动相由流动相A、流动相B组成,采用用磷酸调pH至2.8~3.5的磷酸盐溶液为流动相A,采用乙腈作为流动相B,调节柱温为25~35℃、流速为0.8~1.2ml/min、检测波长为263nm,进行等度洗脱,其中,在所述流动相中,所述磷酸盐溶液和乙腈的体积比例为(35~55)∶(65~45);
(3)取所述供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,理论板数按安立生坦峰计算应不低于3000,按外标法以峰面积计算,得到样品中安立生坦原料药及其制剂的含量。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,色谱条件为选自下列的任意一种:
采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.0、浓度为5mmol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为45∶55,柱温为30摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.0毫升/分钟,进样体积为20μL;
采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至2.8、浓度为4.5mmol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为35∶65,柱温为28摄氏度,检测波长为263nm,流速为0.8毫升/分钟,进样体积为20μL;
采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.5、浓度为5.5mmol/L磷酸二氢钾溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为55∶45,柱温为35摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.2毫升/分钟,进样体积为20μL。
8.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,色谱条件为选自下列的任意一种:
采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.0、浓度为5mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为45∶55,柱温为30摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.0毫升/分钟,进样体积为20μL;
采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至2.8、浓度为4.5mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为35∶65,柱温为28摄氏度,检测波长为263nm,流速为0.8毫升/分钟,进样体积为20μL;
采用150×4.6mm,5μm的Agilent Zobox SB-C18柱,采用用磷酸调pH至3.5、浓度为5.5mmol/L磷酸二氢钠溶液作为流动相A,采用乙腈作为流动相B,进行等度洗脱,其中,所述流动相A和所述流动相B的体积比例为55∶45,柱温为35摄氏度,检测波长为263nm,流速为1.2毫升/分钟,进样体积为20μL。
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