CN104237432B - 利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法，该高效液相色谱分析方法采用十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成；采用15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0～6.9)作为流动相A；采用乙腈作为流动相B，洗脱方式采用梯度洗脱。该方法能够准确测定安立生坦及其制剂的含量，且该方法准确度高、专属性强。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及安立生坦及其制剂含量的分析方法，具体地，涉及利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法。
背景技术
肺动脉高压是指各种原因引起的肺动脉压力持久增高，为罕见的慢性综合病症，表现为肺动脉缩小、破损及血压过高。肺动脉血管壁的增厚和损伤会促使血管缩小，小的血液凝块会在血管中形成，最终导致血管阻塞。因为右侧心肌不如左侧心肌强健，更容易受到损伤，因此血管阻力的增加会加重右侧心脏的工作负荷，最终导致患者右心衰竭而死亡。右心衰竭是所有类型肺动脉高压患者致残、致死的共同唯一因素，而肺动脉高压也是右心衰竭的最主要原因，其病因复杂，诊断、治疗棘手是该治疗领域长期以来发展缓慢的主要原因。
安立生坦(Ambrisentan)是一种新型的口服内皮素受体拮抗剂(ERA)，该药物于2007年6月15日获得美国FDA批准，口服用于治疗肺动脉高血压，目前在国外已上市的为规格5mg和10mg片剂。安立生坦及其制剂含量的分析方法尚未见报道。
因此，对安立生坦及其制剂含量的分析方法的研究仍有待加强。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法，其能够准确测定安立生坦及其制剂含量，并且分离度高、专属性强。
安立生坦及其制剂含量的分析方法，其难度在于安立生坦是一个难溶于水的物质，在其原料合成过程中中间体和产生的杂质比较多、以及制剂中易产生降解杂质，而且各个杂质的性质与安立生坦的比较相近，难于分离。本发明的发明人对安立生坦及其制剂含量的分析方法进行了大量研究，特别的，发明人通过实验比较了在不同的色谱条件下，安立生坦中的杂质与安立生坦的分离色谱图。
其中，色谱条件中，流动相(1)：以体积分数为0.05％～0.10％磷酸溶液(用三乙胺调pH值至3.0～4.0)为流动相A，以甲醇为流动相B的梯度洗脱条件，测定样品的色谱图；
色谱条件中，流动相(2)：以15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％(质量体积比)三乙胺，用磷酸调pH至6.0～6.9)为流动相A，以乙腈为流动相B的梯度洗脱条件，测定样品的色谱图。
本发明流动相A的组成为：在15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液中，添加0.01％的三乙胺，然后用磷酸调pH至6.0～6.9，即得本发明所述流动相A。
结果：发现在流动相(1)的样品色谱图中，安立生坦未洗脱出，且基线不平；而在流动相(2)的样品色谱图中，基线平稳，各杂质与安立生坦完全分离，峰型对称，响应高，具体见图3。
因此，本发明选择的流动相为：以15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0～6.9)为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。
因而，本发明提供了一种利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法。根据本发明的实施例，该高效液相色谱分析方法的色谱条件采用十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为15～25mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0～6.9)作为流动相A；以及采用乙腈作为流动相B；洗脱方式采用梯度洗脱。根据本发明的实施例，本发明所述梯度洗脱的条件，包括流动相比例、洗脱时间如下：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 70～90 | 10～30 |
| 5 | 70～90 | 10～30 |
| 13 | 60～80 | 20～40 |
| 23 | 25～45 | 55～75 |
| 35 | 25～45 | 55～75 |
| 36 | 70～90 | 10～30 |
| 45 | 70～90 | 10～30 |
发明人发现，利用本发明的方法，能够有效地分离安立生坦与其合成过程以及制剂引入的杂质和降解杂质，准确测定安立生坦原料药及其制剂的含量，且该方法准确度高、专属性强。
根据本发明的实施例，检测波长为263nm。发明人将安立生坦供试品溶液在190nm～400nm进行扫描，发现在263nm处具有最大紫外吸收，因此，选择263nm作为安立生坦的检测波长。由此，检测安立生坦及其制剂含量的检测波长具有良好的专属性。
根据本发明的实施例，所述色谱柱的柱温为28～32摄氏度。由此，有利于安立生坦与杂质进行分离。
根据本发明的实施例，在根据本发明实施例的利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法中，流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为15～25mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0～6.9)作为流动相A；以及采用乙腈作为流动相B；采用梯度洗脱的方式，能够有效将安立生坦和杂质分离。
根据本发明的实施例，本发明的利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法包括以下步骤：
(1)取安立生坦原料药或制剂粉末，用乙腈超声溶解，离心，配制成安立生坦浓度为0.5mg/ml的供试品溶液；
(2)色谱条件：采用十八烷基键合硅胶柱作为色谱柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为15～25mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0～6.9)作为流动相A，采用乙腈作为流动相B，调节柱温为28～32℃、流速为0.8～1.2ml/min、检测波长为263nm，进行梯度洗脱；
(3)取所述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中安立生坦及其制剂的含量。
根据本发明的实施例，所述梯度洗脱的条件，包括流动相的比例、洗脱时间为：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 70～90 | 10～30 |
| 5 | 70～90 | 10～30 |
| 13 | 60～80 | 20～40 |
| 23 | 25～45 | 55～75 |
| 35 | 25～45 | 55～75 |
| 36 | 70～90 | 10～30 |
| 45 | 70～90 | 10～30 |
其中，柱温为28～32摄氏度，检测波长为263nm，流速为0.8～1.2毫升/分钟，进样体积为20μL。由此，能够有效测定安立生坦原料药及其制剂的含量，且准确度高、专属性强。
根据本发明的一个具体示例，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.5)作为流动相A，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 80 | 20 |
| 13 | 68 | 32 |
| 23 | 35 | 65 |
| 35 | 35 | 65 |
| 36 | 80 | 20 |
| 45 | 80 | 20 |
其中，柱温为30摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.0毫升/分钟，进样体积为20μL。由此，安立生坦和杂质的分离度较好，安立生坦原料药及其制剂的含量测定结果准确度高。
根据本发明的一个具体示例，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为25mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0)作为流动相A，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 13 | 60 | 40 |
| 23 | 25 | 75 |
| 35 | 25 | 75 |
| 36 | 70 | 30 |
| 45 | 70 | 30 |
其中，柱温为32摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.2毫升/分钟，进样体积为20μL。由此，安立生坦和杂质的分离度较好，安立生坦原料药及其制剂的含量测定结果准确度高。
根据本发明的一个具体示例，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为15mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.9)作为流动相A，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 90 | 10 |
| 13 | 80 | 20 |
| 23 | 45 | 55 |
| 35 | 45 | 55 |
| 36 | 90 | 10 |
| 45 | 90 | 10 |
其中，柱温为28摄氏度，检测波长为263nm，流速为0.8毫升/分钟，进样体积为20μL。由此，安立生坦和杂质的分离度较好，安立生坦原料药及其制剂的含量测定结果准确度高。
根据本发明的一个具体示例，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.5)作为流动相A，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 75 | 25 |
| 5 | 75 | 25 |
| 13 | 65 | 35 |
| 23 | 30 | 70 |
| 35 | 30 | 70 |
| 36 | 75 | 25 |
| 45 | 75 | 25 |
其中，柱温为30摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.0毫升/分钟，进样体积为20μL。由此，安立生坦和杂质的分离度较好，安立生坦原料药及其制剂的含量测定结果准确度高。
根据本发明的一个具体示例，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.5)作为流动相A，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 85 | 15 |
| 5 | 85 | 15 |
| 13 | 75 | 25 |
| 23 | 40 | 60 |
| 35 | 40 | 60 |
| 36 | 85 | 15 |
| 45 | 85 | 15 |
其中，柱温为30摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.0毫升/分钟，进样体积为20μL。由此，安立生坦和杂质的分离度较好，安立生坦原料药及其制剂的含量测定结果准确度高。
根据本发明的实施例，本发明具有如下有益效果：
根据本发明实施例的利用高效液相色谱法分析安立生坦及其制剂含量的方法，通过梯度洗脱的方式，可以很好地分离安立生坦与其合成过程以及制剂引入的杂质和降解杂质，峰型对称，响应高，能准确测定安立生坦原料药及其制剂的含量，从而确保了安立生坦的质量可控。本发明所建立的HPLC法准确度高，专属性强。
附图说明
图1显示了根据本发明的一个实施例，安立生坦的紫外扫描图；
图2显示了根据本发明的一个实施例，安立生坦原料药含量测定典型色谱图；以及
图3显示了根据本发明的一个实施例，安立生坦原料药中可能存在的杂质与安立生坦在同一色谱条件下的分离色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：检测波长的确定
取用无水乙醇制成的25μg/ml的安立生坦溶液，在紫外-可见分光光度计在190nm～400nm进行全扫描，安立生坦的紫外扫描图见图1。由图1的结果可知，安立生坦的最大吸收波长为263nm，故选择263nm作为检测波长。
实施例2：
色谱条件：
流动相A：20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.5)流动相B：乙腈，色谱柱为WatersXTeraC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长263nm，柱温30℃，进样量20μl。
梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 80 | 20 |
| 5 | 80 | 20 |
| 13 | 68 | 32 |
| 23 | 35 | 65 |
| 35 | 35 | 65 |
| 36 | 80 | 20 |
| 45 | 80 | 20 |
实验步骤：
(1)取安立生坦适量，用乙腈溶解并用乙腈-水(体积比为30∶70)定量稀释制成1ml含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
(2)取上述(1)中得到的供试品溶液照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，安立生坦原料药含量测定典型图谱见图2。由图2可以看出，峰型对称，安立生坦响应高。
实施例3：
色谱条件：
流动相A：25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.0)流动相B：乙腈，色谱柱为WatersXTeraC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流速1.2ml/min，检测波长263nm，柱温32℃，进样量20μl。
梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 70 | 30 |
| 5 | 70 | 30 |
| 13 | 60 | 40 |
| 23 | 25 | 75 |
| 35 | 25 | 75 |
| 36 | 70 | 30 |
| 45 | 70 | 30 |
实验步骤：同实施例2。
实施例4：
色谱条件：
流动相A：15mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.9)流动相B：乙腈，色谱柱为WatersXTeraC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流速0.8ml/min，检测波长263nm，柱温28℃，进样量20μl。
梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 90 | 10 |
| 13 | 80 | 20 |
| 23 | 45 | 55 |
| 35 | 45 | 55 |
| 36 | 90 | 10 |
| 45 | 90 | 10 |
实验步骤：同实施例2。
实施例5：
色谱条件同实施例2
实验步骤：
分别取安立生坦对照品和各杂质(杂质为合成路线中引入的杂质、以及降解产物杂质共6种，分别标记为杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5、杂质6)对照品适量，加乙腈-水(体积比为30∶70)制成每1ml含安立生坦500μg，各杂质约含0.5μg的混合溶液。按照实施例2的色谱条件进行色谱分析。安立生坦原料药中各杂质与安立生坦在同一色谱条件下的分离色谱图见图3.
由图3的结果可以看出，该色谱图中主峰与各已知杂质分离度均大于1.5，表明本发明的方法能够有效将安立生坦和杂质分离。
实施例6：
色谱条件：
流动相A：20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.5)流动相B：乙腈，色谱柱为WatersXTeraC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长263nm，柱温30℃，进样量20μl。
梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 75 | 25 |
| 5 | 75 | 25 |
| 13 | 65 | 35 |
| 23 | 30 | 70 |
| 35 | 30 | 70 |
| 36 | 75 | 25 |
| 45 | 75 | 25 |
实验步骤：
(1)取安立生坦片研磨成细粉，取细粉适量，用乙腈溶解并用乙腈-水(体积比为30∶70)定量稀释制成1ml含安立生坦0.5mg的供试品溶液。
(2)取上述(1)中得到的供试品溶液照上述色谱条件，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，安立生坦原料药含量测定典型图谱见图2。由图2可以看出，峰型对称，安立生坦响应较高。
实施例7：
色谱条件：
流动相A：20mmol/L磷酸氢二钠缓冲液(含0.01％三乙胺，用磷酸调pH至6.5)流动相B：乙腈，色谱柱为WatersXTeraC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流速1.0ml/min，检测波长263nm，柱温30℃，进样量20μl。
梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％V/V) | 流动相B(％V/V) |
| 0 | 85 | 15 |
| 5 | 85 | 15 |
| 13 | 75 | 25 |
| 23 | 40 | 60 |
| 35 | 40 | 60 |
| 36 | 85 | 15 |
| 45 | 85 | 15 |
实验步骤：同实施例6。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (7)
1.一种利用高效液相色谱法分析安立生坦原料药及其制剂中安立生坦含量的方法，其特征在于，
采用十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱，配备紫外检测器；
流动相由流动相A、流动相B组成，
采用15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液含有0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.0～6.9；
采用乙腈作为流动相B；
洗脱方式采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的条件为：
其中，柱温为28～32摄氏度，检测波长为263nm，流速为0.8～1.2毫升/分钟，进样体积为20μL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取安立生坦原料药或制剂粉末，用乙腈超声溶解，离心，配制成安立生坦浓度为0.5mg/ml的供试品溶液；
(2)色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶柱作为色谱柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述15～25mmol/L磷酸氢二钠缓冲液含有0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.0～6.9，采用乙腈作为流动相B，柱温为28～32℃、流速为0.8～1.2ml/min、检测波长为263nm，进行梯度洗脱；
(3)取所述供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到样品中安立生坦的含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器，流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液含0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.5，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
其中，柱温为30摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.0毫升/分钟，进样体积为20μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器，流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为25mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述浓度为25mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液含0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.0，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
其中，柱温为32摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.2毫升/分钟，进样体积为20μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为15mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述浓度为15mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液含0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.9，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
其中，柱温为28摄氏度，检测波长为263nm，流速为0.8毫升/分钟，进样体积为20μL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液含0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.5，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
其中，柱温为30摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.0毫升/分钟，进样体积为20μL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用150mm×4.6mm，5μm的WatersXTeraC18柱，配备紫外检测器；流动相由流动相A、流动相B组成，采用浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液作为流动相A，其中，所述浓度为20mmol/L的磷酸氢二钠缓冲液含0.01％三乙胺，并用磷酸调pH至6.5，采用乙腈作为流动相B，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱条件为：
其中，柱温为30摄氏度，检测波长为263nm，流速为1.0毫升/分钟，进样体积为20μL。
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