CN104447892A - 一种精氨酸双糖苷检测方法及其医用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种精氨酸双糖苷（AFG）半合成方法及一种新的检测方法。AFG具有提高机体免疫力的作用,AFG能够使由环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数恢复正常，提高淋巴细胞自然转化、T细胞转化和B细胞转化的转化率，并且可以改善小鼠的体内白细胞介素和肿瘤坏死因子水平，具有预防和改善免疫低下的潜质,AFG可应用于癌症患者恢复和提高机体免疫力。采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）定量检测AFG,建立了一种快速、简洁、准确的检测精氨酸双糖苷的方法。

Description

一种精氨酸双糖苷检测方法及其医用用途

技术领域

本发明涉及一种精氨酸双糖苷（AFG）半合成及一种新检测方法，及其在增强免疫方面的应用, 属化学分析及新药开发领域。 

背景技术

红参系五加科人参属植物人参（Panax gensing C.A. Meyer）根的加工品，属于传统中药材，其含有多种生理活性成分，如皂苷，多糖，氨基酸及氨基酸衍生物等，其中皂苷类成分研究报道较多^[1]，而鲜有对非皂苷类成分尤其是氨基酸衍生物的研究报道。 

精氨酸双糖苷(Arginyl-fructosyl-glucose，AFG)是一种精氨酸衍生物，由郑毅男等首次从红参中分离得到，是鲜人参加工成红参的蒸制和干燥过程中精氨酸与麦芽糖发生美拉德反应的中间产物，其化学结构如图10.所示^[2]。据报道，精氨酸双糖苷在红参中含量非常丰富^[3]，通常采用水提法提取红参中的AFG^[4]。郑毅男等模拟红参加工过程中精氨酸与麦芽糖发生美拉德反应的条件，以冰醋酸为反应介质，按照一定比例使精氨酸和麦芽糖发生美拉德反应，再用硅胶湿柱及生物胶柱进行分离纯化^[5]，本发明对这种合成和提取分离方法进行了进一步优化。对精氨酸双糖苷体内代谢^[6]及各种药理活性的研究表明，精氨酸双糖苷在抗氧化、扩张血管、促进微循环、增强免疫力、抗糖尿病、增强细胞膜渗透性、抗炎、抗衰老、刺激一氧化氮产生等方面有着显著效果^[3,7-14]。精氨酸双糖苷除了可以预防、治疗疾病，还可以作为护肤品使用^[15]，这在很大范围上进一步扩展了精氨酸双糖苷的使用范围。 

据报道，红参具有维持体内免疫系统平衡的作用，并能通过调节免疫机能来抵抗疾病侵袭^[9]，AFG在红参中含量丰富，因此可能在红参的免疫增强药理活性中发挥了重要的作用。 

精氨酸及其衍生物的检测多采用柱前衍生化法^[3]，这种方法本身要求衍生化反应选择性强、定量进行，还需要对衍生化试剂，反应条件及产物的稳定性等进行考察，不利于直接、快速地测定氨基酸^[16]。此外，氨基酸自动分析仪的使用也较广泛，这种方法析时间短检测成本更短，工作效率更高的优点，但是与其他液相色谱仪相比，氨基酸自动分析仪管路更细，原理及结构更复杂，受缓冲液PH影响更大的因素，即使配制出的相同的缓冲液在不同的仪器上，由于受到分离柱反应柱填充的紧密程度的影响，最终得到的氨基酸图谱也可能有明显的差别^[17-18]。为了更加快捷，准确的检测精氨酸及其衍生物，近年 Ju,Gyeong Mi等,建立了一种新的检测氨基酸衍生物的方法--离子色谱，这种方法不仅可以快速检测红参中美拉德反应产物AFG，而且可以检测出动物血液等生物样本中AFG含量，可用于定量分析^[19-20]。本专利报告，采用HPLC-LSD检测精氨酸及其衍生物的方法操作更加简单，检测时间更短，且灵敏度较高。 

  发明内容

本发明继续优化了AFG的合成、分离方法，具有合成率高，试分离纯化成本低，该化合物具有药用价值，并且适于工业化生产。 

本发明精氨酸糖苷的制备方法，包括以下步骤： 

1）将精氨酸与麦芽糖以1:2的重量比例置入1:15（精氨酸：冰醋酸，m:v）倍量的冰醋酸中，在50-100℃条件下，反应10-60min得总反应物；

2）将总合成物过阳离子树脂柱，0.2-2%氨水洗脱，收集各流份，薄层色谱检查，收集Rf 值为0.2 的洗脱液部分，低压浓缩，冷冻干燥成粉末，溶于2倍量的0.2% 醋酸水溶液中，过聚丙烯酰胺柱以0.2% 醋酸水溶液洗脱，收集各流份，薄层色谱检查，收集Rf 值为0.2 的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥即得。

3) 本发明还披露液相色谱-蒸发光检测器（HPLC-ELSD）检测AFG的方法。 

4) 本发明还公开了精氨酸糖苷及其组合物在制备治疗环磷酰胺导致的免疫低下的药物中的新用途。 

本发明中的药物，其中AFG 含量为92-99%，还含有氨基酸、微量元素等。本领域技术人员可以理解到，这些物质的存在会维持或者增强本发明的药物的作用。 

  

实验例1 精氨酸双糖苷AFG的合成

1 仪器与试剂

FD-1D-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；EYELA-DPE 2110系列旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；2110 Fraction Collector（USA）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；Sartorius BP211D型电子分析天平（十万分之一）（德国赛多利斯公司）；Smart-Ms 2021磁力搅拌器（SCIFORD）；电热恒温水浴锅（余姚市东方电工仪器厂）。

L-精氨酸（L-Arg）（北京奥博星生物技术有限责任公司）；麦芽糖(北京奥博星生物技术有限责任公司)；醋酸（北京化工厂，分析纯）；乙腈（美国Fisher公司，色谱纯）；阳离子树脂、薄层层析硅胶H（青岛海阳化工厂）；聚丙烯酰胺凝胶；实验用水为二次蒸馏水。 

2.方法 

2.1  精氨酸双糖苷(AFG)的合成 ： 按质量比为1:2精确称取精氨酸和麦芽糖，加冰醋酸适量，分别溶解后，80°C磁力搅拌合成30min。反应结束后，39°C水浴锅上挥去冰醋酸，既得AFG粗品。

2.2  精氨酸双糖苷(AFG)的分离及纯化 :将得到的AFG粗品加水稀释后上阳离子树脂柱，用2%氨水洗脱后薄层跟踪AFG，展开系统为：正丁醇-冰醋酸-水（2:1:1）；显色剂为：0.2%茚三酮乙醇溶液，80℃烤板显色，收集Rf值为0.2的洗脱液。用低压旋转蒸发仪将收集到的洗脱液浓缩，经真空冷冻干燥机冻干后，取冻干粉末以0.2%醋酸水配制成浓度0.5g/ml的溶液，过聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P-Ⅱ）柱纯化后冻干即可。 

实验例2 

HPLC-ELSD法测定红参中精氨酸双糖苷含量

1仪器与试剂

创新通恒高效液相色谱仪，Alltech 2000ES蒸发光散射检测器，N2000色谱工作站。

精氨酸对照品（美国Sigma公司），纯度大于99.0%。三氟乙酸（Aladdin试剂有限公司,GC）,七氟丁酸（Aladdin试剂有限公司,GC），乙腈为色谱纯（美国Fisher公司），水为二次蒸馏水。 

2 方法 

2.1 色谱条件

色谱柱：Prevail^TMC₁₈(4.6mm×250mm,5μm)；流动相A：乙腈，流动相B：5.0mmol·L^-1七氟丁酸的0.7%三氟乙酸溶液，流动相A与B比例：0min为0:100,5min为0:100,8min为15:85,25min为35:65；漂移管温度：115℃；气体流量：3.2L·min^-1;柱温35℃；进样量:20μL。

2.2 标准品及供试品溶液的制备 

精密称取精氨酸及精氨酸双糖苷（AFG）适量，分别置容量瓶中，用三重水定溶至刻度，配置成1mg/mL溶液，以0.45μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，置4℃冰箱保存，备用。

3 方法学考察 

3.1 线性关系和检出限

    称取适量AFG，置容量瓶中，用三重水定容至刻度，制成1mg/mL AFG溶液，并用此溶液作为母液，分别稀释出浓度为0.8,0.6,0.4,0.2,0.002mg/mL的AFG水溶液，过0.45μm微孔滤膜，备用。在上述色谱条件下分析,色谱图如图2所示，以各种氨基酸峰面积的对数值Y 为纵坐标, 氨基酸质量浓度( g /L)的对数值X 为横坐标进行线性回归, 得到的线性回归方程y = 0.4996x + 12.721(R2 = 0.999)。

当信噪比为3 时, 测得AFG的最低检测限约为0.002 mg /mL。 

3.2 方法的精密度和重复性考察 

    取1mg/mL标准品溶液20μL, 连续进样5次, 各组分色谱峰的保留时间波动小于0.1min, 峰面积的相对标准偏差(RSD)为0.471%。

取同一批样品按供试品溶液制备方法平行制备5份, 分别进样20μL, 同时取不同浓度的标准品混合溶液各20μL进样测定, 按外标两点法分别取对数值, 计算其含量的RSD, 结果为0.439%。 

3.3 供试品溶液的稳定性和加样回收率考察 

    取同一供试品溶液, 分别在保存0,2,4,6,8,10 h后以新配制的标准品混合溶液为对照, 按外标两点法分别取对数值计算, 其RSD为0.491%, 说明供试品溶液在10 h内稳定性良好。 

    精密称取AFG样品粗粉约25 mg 置于锥形瓶中, 加入一定量的氨基酸标准品混合溶液后, 按供试品溶液制备方法制备后测定, 其RSD为0.441%,。 

3.4 样品分析 

    合成粗品用蒸馏水稀释125倍，过0.45μm微孔滤膜，备用，进样量为20μL。

4 讨论 

    目前，氨基酸衍生物的测定方法有很多种，其中精氨酸双糖苷（AFG）可以用氨基酸自动分析仪^[2],柱前衍生法^[3,6]，离子交换色谱法^[20]及电喷雾电离质谱法^[21]进行检测,但未见采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）检测AFG。

本研究对精氨酸及人工合成精氨酸衍生物进行分析。研究中采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法对精氨酸及精氨酸双糖苷进行定性和定量测定, 样品无需衍生化可直接进样分析, 不需要繁琐的前处理,减小了测定误差, 操作简便, 结果可靠。 

  

试验例3

AFG 环磷酰胺(CTX)致免疫抑制小鼠免疫功能的影响

1 材料与方法

1.1     仪器、材料与试剂

离心机（Eppendorf, 型号5430 R），酶标仪（BIO-RAD, iMark），超净工作台（博讯，型号操作HD-1360），显微镜(蔡康型号XDS-200)，培养箱(美国Thermo公司，型号3100)。  

刀豆蛋白A(ConA, Sigma，批号c-2010);脂多糖（LPS, Sigma，批号L2880）;二苯基四氮唑溴盐（MTT, Sigma，批号0733）；二甲基亚砜（DMSO,北京化工厂，批号20120210）;小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司,140207）；RPMI1640培养基（GIBCO，795681）;白细胞介素2试剂盒（IL-2试剂盒，美国R&D，DZE20054）；肿瘤坏死因子试剂盒（TNF-α试剂盒，美国R&D，DZE30223）。

精氨酸双糖AFG,由本实验室自制，纯度>95%(HPLC)；BALB/C小鼠（20±2g,吉林大学实验动物中心提供，SCXK(吉)）；SPF级ICR小鼠(18~22g,吉林省亿斯实验动物中心提供，SCXK(吉)-2011-0004),雌性。 

1.2     实验方法 

1.2.1 动物分组和给药

80只ICR小鼠，适应性饲养一周，随机分成8组，正常对照组，免疫抑制对照组，A1:免疫抑制AFG高剂量组（50mg·kg^-1 AFG），A2：免疫抑制AFG中剂量组（30mg·kg^-1 AFG），A3：免疫抑制AFG低剂量组（10mg·kg^-1 AFG），B1:AFG高剂量组（50mg·kg^-1 AFG），B2：AFG中剂量组（30mg·kg^-1 AFG），B3：AFG低剂量组（10mg·kg^-1 AFG）。AFG用生理盐水溶解，以10 mL·kg^-1 的体积灌胃给药，1 次/d，连续30 d。模型组及A1，A2，A3组于第1、2、3、9、16 和23天腹腔注射环磷酰胺（CTX）80 mg·kg^-1。

1.2.2 小鼠免疫器官脏器指数测定 

    给药30天后，小鼠眼球采血,分离血清,分装后置-20℃冰箱保存,待用。将小鼠颈椎脱臼处死,取其胸腺和脾脏用生理盐水漂洗,滤纸吸干水分,称量,计算脾脏指数和胸腺指数。

脏器指数(%)=脏器重量(g)/体重(g)×100 

1.2.3 体外淋巴细胞增殖实验

BALB/C小鼠，脱臼处死, 置体积分数为75%的酒精浸泡5 m in, 在无菌条件下取出脾脏, 去除被膜, 用Hanks'液洗两次, 剪碎, 把组织碎块放入培养皿内, 反复研磨, 制成脾细胞悬液，用200目网过滤脾细胞, 然后进行细胞计数, 配成2×10⁶细胞悬液待用。实验分为空白组，阴性对照组，阳性对照组和样品组（AFG6个浓度，分别为1、2、4、6、8、10μg·mL^-1）。将调整好的细胞悬液加入96孔细胞培养板中,每组3个复孔，空白组加入100μL培养基，其他各组每孔加100μL细胞悬液，置培养箱中1h后取出。空白组和阴性对照组各加入100μL培养基，阳性对照组加入50μg·mL^-1 Con A 10μL,置37℃，5%CO₂孵箱中培养48h,取出，每孔加入5mg·mL^-1 MTT溶液20μL,继续培养4h后，取出培养板，2000rmp·min^-1,离心10min,小心将上清液吸去，加入150μL DMSO,充分溶解结晶，用酶标仪比色，490nm测定各孔OD值。

1.2.4 淋巴细胞转化实验 

   小鼠分组同上，灌胃给药, 连续30天,末次给药后1 h, 将小鼠脱臼处死, 置体积分数为75%的酒精浸泡5 m in, 在无菌条件下取出脾脏, 去除被膜, 用Hank s'液洗两次, 剪碎, 把组织碎块放入培养皿内, 反复研磨, 制成脾细胞悬液，用200目网过滤脾淋巴细胞, 然后进行细胞计数, 配成2×10⁶细胞悬液待用。实验分为空白孔，自然转化空，刀豆蛋白（Con A）刺激孔和脂多糖（LPS）刺激孔，每孔设3个复孔。将各组细胞分别加入96孔板中，空白孔和自然转化孔分别加入100μl培养液，Con A刺激孔加入100μL浓度为5.0μg·mL^-1 Con A, LPS刺激孔加入100μL浓度为μg·mL^-1 LPS. 置37℃，5%CO₂孵箱中培养48h,取出，每孔加入5mg·mL^-1 MTT溶液20μL,继续培养4h后，取出培养板，2000rmp·min^-1离心10min,小心将上清液吸去，加入150μLDMSO,充分溶解结晶，用酶标仪比色，490nm测定各孔OD值。     

1.2.5 肿瘤坏死因子TNF-α及白细胞介素IL-2的测定

取分装好的小鼠血清，采用酶联免疫试剂盒的测定，严格按照ELISA说明书操作。

1.2.6 统计学处理 

采用SPSS17.0 软件，数据以（x±s）表示，统计方法应用单因素方差分析^*** P<0.01，^### P<0.01,^SSS P<0.01表明具有极显著性, ^** P<0.05，^## P<0.05,^SS P<0.05表明具有显著性。

2 实验结果 

2.1 AFG对小鼠脏器指数的影响

表1.可知与空白组相比模型组脾指数，胸腺指数均下降，且具有显著性（p<0.05），说明造模成功。但各给药组脾指数，胸腺指数都明显上升，与模型组相比有显著性差异（P<0.05），但与空白组相比并无显著性差异。说明AFG对于免疫抑制小鼠的脾和胸腺具有增重作用,可使脾和胸腺恢复正常水平，对正常小鼠无影响。

         Tab.1 Effects of AFG on thymus coefficient and spleen coefficient in mice(±s) 

         表1.AFG对免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数的影响(±s)

注：与空白组比较， ^*** P<0.01, ^** P<0.05;与模型组比较， ^### P<0.01，^## P<0.05。

2.2 AFG对体外脾淋巴细胞转化的影响 

由图4.曲线可以看出随着AFG浓度的逐渐增大，小鼠淋巴细胞转化率逐渐升高，且呈现较好的量效关系，说明AFG可促进免疫缺陷小鼠淋巴细胞的转化。

                  

2.3   AFG对正常小鼠免疫功能的影响

对给药组小鼠淋巴细胞转化的影响实验分三组进行：第一组脾细胞自然转化，不加刺激剂；第二组加入ConA刺激T细胞转化；第三组加入LPS刺激B细胞转化。结果如图所示。

如图5,6,7，小鼠灌胃AFG30天，能明显促进脾淋巴细胞的转化，在不加刺激剂的情况下，AFG高低剂量给药组的细胞转化率与对照组比较，具有显著性差异（p<0.05）,低剂量组具有极显著性（p<0.01），并且空白给药组中AFG中剂量组脾淋巴细胞转化率与空白组相比也具有显著性差异（p<0.05），加入刺激剂后，各给药组淋巴细胞转化率与模型组比较均增加。 

  

T淋巴细胞转化，刺激剂为ConA，AFG高剂量组与模型组比较具有显著性差异（P<0.05），空白给药组与空白组相比均明显提高T细胞转化率，且AFG中剂量组与空白组相比有显著性差异（P<0.05）。B淋巴细胞转化，刺激剂为LPS,AFG高中低剂量组与模型组比较都具有显著性(P<0.05)，低剂量组与模型组想比具有极显著性差异（P<0.01）,空白给药组与空白组相比虽然没有显著性，但都有增加。

2.4 AFG对免疫抑制小鼠血清中细胞因子IL-2，TNF-α 

酶联免疫法测定血清中IL-2，TNF-α，TNF-α检测结果如图8.所示模型组与空白组比较具有显著性（p<0.05）, AFG高中低剂量组与模型组相比都显著升高，并且具有极显著性差异（P<0.01）。空白给药组TNF-α值也有提高但与空白组比较无显著性。IL-2检测结果如图9.所示，模型组与空白组相比具有显著性差异（P<0.05）,免疫抑制给药组中，AFG高剂量组与模型组相比具有极显著性差异（P<0.01），中剂量组具有显著性差异（P<0.05），AFG高中低空白给药组中，IL-α有所升高，但与空白组相比，并无统计学意义。

  

3.讨论

     环磷酰胺是医学上常用的抗癌药,也是一种免疫抑制剂^[27], 可抑制各种动物的体液与细胞免疫应答。用环磷酰胺诱导小鼠免疫抑制模型, 其机体免疫功能下降可表现在诸多方面。本实验选择其中三项指标以观察不同浓度AFG对免疫抑制小鼠机体免疫功能的影响: ①对离体淋巴细胞转化的影响: 淋巴细胞只有向成熟T淋巴细胞转化, 才能发挥免疫效应, 因此淋巴细胞转化率是评价细胞免疫功能的一个重要指标^[27]。②对体内细胞因子的影响：TNF-α 由单核巨噬细胞产生，有免疫调节、参与炎症发生的功能^[28]。心脏含有的巨噬细胞，是炎性细胞因子TNF-α 的重要来源。TNF-α 具有的生物学活性具有双重作用，一方面在机体免疫调节、机体生理功能和抗感染等方面发挥重要作用， 另一方面若持续释放或产生过多则会引起发热、休克、恶病质等。IL- 2 主要由T h1 细胞系产生,是参与免疫应答的重要细胞因子, 并参与炎症反应、抗肿瘤效应、移植排斥反应,并可诱生干扰素等^[29], 是衡量机体免疫功能, 尤其是细胞免疫水平的一个重要指标^[30]。③胸腺是T 细胞在分化成熟的场所，也是T 细胞和B 细胞受抗原等异物刺激后发生免疫应答的主要部位，在细胞免疫、体液免疫以及巨噬细胞的吞噬功能等发挥重要的作用，脾脏是成熟T 细胞、B 细胞主要存在部位，两者均为机体的主要免疫器官^[31-32]。

在环磷酰胺刺激下，免疫抑制组小鼠的胸腺指数与脾脏指数都有所下降，AFG可显著提高免疫抑制小鼠胸腺指数和脾指数，增强免疫应答，对抗环磷酰胺对免疫器官的抑制造成的脾和胸腺的萎缩。AFG能显著促进脾淋巴细胞的体外转化，且淋巴细胞转化率随浓度的增大而增大。AFG高中给药组脾淋巴细胞自然转化率较高，与模型组相比具有显著性；AFG中剂量组在ConA刺激的T淋巴细胞转化中具有显著性；AFG高中低剂量组在B淋巴细胞的转化中与模型组相比均具有显著性，说明AFG不仅在体外淋巴细胞转化中作用显著，并且在体内灌胃给药中起到了显著的作用，能够通过同时提高体液免疫和细胞免疫来增强机体的免疫能力。AFG能显著提高免疫抑制小鼠细胞因子TNF-α含量，与模型组相比具有显著性，但与空白组相比并无显著性，说明AFG能够通过适当增加体内TNF-α含量使其在机体免疫调节、机体生理功能和抗感染等方面发挥重要作用。AFG能够增加IL-2的含量，从而增强巨噬细胞的非特异性吞噬作用，诱导产生干扰素等。环磷酰胺作为多种癌症治疗药物，可造成免疫力低下。根据上述实验结果，AFG可作为癌症患者化疗期间，恢复和提高免疫力的作用。 

实施例 1 

     按照上述实验例方法合成AFG，并分离纯化，准确称取1g, 加入9g（落叶松阿拉伯半乳聚糖、 环糊精、乳糖各3g），混合均匀，使成每片0.1g，压片，每片含AFG10mg，,成年人服用量为,2-4 片/日，一日两次。

附图说明

图1.精氨酸双糖苷色谱图 

图2.精氨酸色谱图

图3.高丽红参中AF和AFG检测色谱图

图4.小鼠脾淋巴细胞在不同浓度AFG作用下的转化率

注：与阴性组比较， ^*** P<0.01。

图5.AFG对小鼠脾细胞自然转化的影响 

注：与空白组比较， ^*** P<0.01，^SS P<0.05;与模型组比较，^### P<0.01，^## P<0.05。

图6.AFG对小鼠T淋巴细胞转化的影响               

注：与空白组比较^，** P<0.05，^SSP<0.01;与模型组比较， ^## P<0.05。  

图7AFG对小鼠B淋巴细胞转化的影响

注：与空白组比较，^** P<0.05;与模型组比较，^### P<0.01，^## P<0.05。

图8AFG对免疫抑制小鼠血清中细胞因子TNF-α的影响图     

注：与空白组比较^，** P<0.05;与模型组比较， ^## P<0.05。 

图9.AFG对免疫抑制小鼠血清中细胞因子IL-α的影响  

注：与空白组比较，^** P<0.05;与模型组比较，^### P<0.01，^## P<0.05。

图 10.AFG 化学结构式 .

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Claims (4)

1.精氨酸双糖苷（AFG）的制备方法，其具体制备方法如下：

(1) 精氨酸双糖苷(AFG)的合成：按质量比1:2精确称取精氨酸和麦芽糖，加冰醋酸适量，溶解后，在50-100°C条件下搅拌一种，反应10-60min,得AFG粗品；

(2)精氨酸双糖苷(AFG)的分离及纯化:取AFG粗品上阳离子交换树脂柱，用0.2-2%氨水洗脱，收集洗脱液，薄层色谱检查（展开剂为正丁醇-冰醋酸-水（2:1:1），以0.2%茚三酮乙醇溶液显色，Rf值为0.2），收集Rf值为0.2部分洗脱液，真空冷冻干燥，得粉末，溶于水中，过聚丙烯酰胺柱，以0.2% 醋酸水溶液洗脱，收集Rf 值为0.2 的洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥即得。

2..根据权利要求1，所得精氨酸双糖苷用高效液相-蒸发光散射（HPLC-ELSD）检测。

3..根据权利要求1，所得精氨酸双糖苷能使环磷酰胺所致免疫力低下的小鼠提高免疫力，因此可用于人癌症化疗期间的辅助治疗药。

4..根据权利要求1，所得的精氨酸双糖苷（AFG）能够提高T淋巴细胞和B淋巴细胞的转化率，能显著提高免疫抑制小鼠肿瘤坏死因子TNF-α含量，并使其保持在正常水平，可用于抗炎及抗感染类药物。