CN105699510B - 一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法，属于医药技术领域。所述方法包括：1)制备山柰苷对照品溶液和绵马贯众药材供试品溶液；2)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用仪进行测定；3)以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。本发明为绵马贯众药材中山柰苷含量的测定提供了灵敏、准确的方法。

Description

一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种中药绵马贯众药材的含量测定方法，特别涉及一种利用液相色谱-串联三重四级杆质谱(HPLC-MS/MS)测定绵马贯众药材中山柰苷含量的方法，属于医药技术领域。

背景技术

绵马贯众为鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨Dryopteris crassirhizoma Nakai的干燥根茎和叶柄残基，具有清热解毒、驱虫的功效，可以用于虫积腹痛，疮疡。

绵马贯众中活性成分主要包括间苯三酚类、黄酮类、萜类等。目前，该药材活性成分的含量研究主要集中在间苯三酚类成分，例如肖国君等公开了绵马贯众中一种间苯三酚单体的高效液相色谱含量测定方法[药物分析杂志,2005,25(5):502-504]，高增平等公开了绵马贯众中总间苯三酚含量的紫外分光光度测定方法[北京中医药大学学报,2009,32(4):259-262]，马国祥等公开了绵马贯众中两种间苯三酚单体的薄层色谱扫描含量测定方法[中国药科大学学报,1994,25(6):376-377]。

根据结构中是否存在糖基，黄酮类成分可以分为黄酮苷元和黄酮糖苷。文献报道，绵马贯众中含有去甲氧基荚果蕨素等多种黄酮苷元和山柰苷(即山柰素-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷)等多种黄酮糖苷[Chem Pharm Bull,2008,56(5):711-714]，该文献只完成了化合物结构确证，未进行上述成分的含量测定。柳芳等公开了绵马贯众中一种黄酮苷元的高效液相色谱含量测定方法[中国实验方剂学杂志,2012,18(10):130-132]，但一方面该方法提取溶剂为纯甲醇，无法完全提取药材中大极性的黄酮糖苷，另一方面使用的紫外检测器不够灵敏，不能测定微量、痕量成分。

上述已公开的含量测定方法中，所用提取溶剂包括苯、乙醚、甲醇、95％乙醇等，因而测定的目标成分多为极性相对较小的间苯三酚、黄酮苷元类成分。而绵马贯众的中药制剂多以水为提取溶剂，例如《中国药典》2015年版一部收载的抗感系列制剂(颗粒、口服液)和连花清瘟系列制剂(片、胶囊、颗粒)，这类制剂中绵马贯众的药效物质应为黄酮糖苷等大极性成分，如山柰苷等。目前，国内外尚无能够准确测定绵马贯众中黄酮糖苷类成分含量的方法。《中国药典》2015年版一部收载的绵马贯众药材，以及处方中含有该药材的6个中药制剂品种项下，均没有绵马贯众指标成分的含量测定项目。

周莉等公开了一种测定罗汉果茎、叶及其提取物中山柰苷的HPLC含量测定方法，以紫外检测器在345nm进行检测，山柰苷线性范围为进样量0.209～1.045μg[中国现代中药,2010,12(11):24-25,31]。马秉智等公开了一种测定单芽狗脊中山柰苷的HPLC含量测定方法，以紫外检测器在265nm进行检测，山柰苷线性范围为进样量0.0844～0.4220μg[中国实验方剂学杂志,2012,18(12):130-131]。上述文献方法检测限相对较高，以上述文献方法对绵马贯众药材进行测定，样品中未能检出山柰苷色谱峰。

闫利华等将扶芳藤药材中山柰苷进行水解，以紫外检测器测定其苷元山柰素的含量[中国中药杂志,2015,40(10):1877-1886]。按照文献方法，药材中其他山柰素的糖苷也会被水解，因而测定结果不能反映原药材山柰苷单体的含量。另外，该文献利用WatersACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF液质联用仪(负离子模式)对扶芳藤药材中山柰苷等成分进行了定性分析，但未能进行定量测定。文献采用的Q-TOF质谱检测器在定量分析方面具有局限性，难以准确定量。

综上所述，现有技术中无能够准确测定绵马贯众中黄酮糖苷类成分含量的方法，而对其他药材中山柰苷的含量测定方法也并不适用于绵马贯众药材。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种灵敏、准确地测定绵马贯众药材中黄酮糖苷单体—山柰苷含量的方法，具体地提供一种利用液相色谱-串联三重四级杆质谱测定绵马贯众药材中山柰苷含量的方法。

发明概述

本发明使用液相色谱-三重四级杆质谱联用技术，对中药材绵马贯众中山柰苷进行了含量测定，该方法操作简便，分析数据准确。

本发明的技术方案如下：

一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法，步骤如下：

对照品溶液的制备：取山柰苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积份数40％～70％的甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理15～60分钟，放冷，再称定重量，用体积份数40％～70％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数0.01％～0.5％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.01％～0.5％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速为0.8～1.0mL/min；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z 579.2→287.1，433.1作为检测离子对，质谱分流比2:1～5:1；进样量10μL时，对照品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中山柰苷色谱峰信噪比应大于10:1；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液m/z579.2→287.1或m/z 579.2→433.1提取离子流图中相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。

所述的梯度洗脱方式为梯度性地改变洗脱液的组分(成分、离子强度等)或pH，以期将层析柱上不同的组分在合理的时间内洗脱出来的方法。所述的体积份数0.01％～0.5％的甲酸乙腈溶液是指甲酸在乙腈中的体积浓度。

根据本发明优选的，所述的供试品溶液的制备中提取溶剂甲醇溶液的体积分数为50％。

根据本发明优选的，所述的供试品溶液的制备中超声处理时间为30分钟。

根据本发明优选的，所述的色谱条件与系统适用性试验中流动相A为体积份数0.02％的甲酸乙腈溶液，流动相B为体积份数0.02％的甲酸溶液。

根据本发明优选的，所述的色谱条件与系统适用性试验中流动相流速为1.0mL/min。

根据本发明优选的，所述的色谱条件与系统适用性试验中质谱分流比为3:1。

根据本发明优选的，所述的测定法中测定m/z 579.2→287.1提取离子流图中相应色谱峰面积。

根据本发明优选的，一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法，步骤如下：

对照品溶液的制备：取山柰苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积份数50％的甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用体积份数50％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数0.02％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.02％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速为1.0mL/min；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z 579.2→287.1，433.1作为检测离子对，质谱分流比3:1；进样量10μL时，对照品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中山柰苷色谱峰信噪比应大于10:1；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液m/z579.2→287.1提取离子流图中相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。

本发明采用灵敏的液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，山柰苷的检测限和定量限达到pg级，即10^-12g，达到了文献报道紫外检测器检测限(μg级)的百万分之一。根据本实验结果，收集到的9批绵马贯众药材中山柰苷含量在1.91～14.30μg/g之间，平均含量为5.85μg/g。山柰苷在绵马贯众药材中含量低，因而以常规紫外检测器甚至未能检出。本发明使用灵敏、定量准确的三重四级杆质谱检测器对绵马贯众中山柰苷进行了测定，提高了药材活性成分的可控性，同时为处方中含有绵马贯众药材的中药制剂含量检测提供了技术支持。

附图说明：

图1为山柰苷对照品高效液相色谱图。A图为m/z 579.20→287.10提取离子流色谱图，B图为m/z 579.20→433.10提取离子流色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是微伏(μV)。

图2为绵马贯众样品高效液相色谱图。A图为m/z 579.20→287.10提取离子流色谱图，B图为m/z 579.20→433.10提取离子流色谱图。横坐标是时间，单位：分钟(min)，纵坐标是微伏(μV)。

具体实施方式

下面结合实验例和实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。

实验例1：含量测定实验

1.仪器、试药和供试样品

岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪LCMS-8050；Sartorius CP225D电子天平(德国赛多利斯集团)。

对照品山柰苷，美国公司提供，批号：00011142-808，含量95.3％；甲醇为色谱纯，乙腈、甲酸为质谱级，水为Millipore制备的纯化水。绵马贯众药材共9批，其中1批为中国食品药品检定研究院提供的对照药材(批号：121034-200302)，另外8批购自药材市场：3批产地为黑龙江省，2批产地为辽宁省，2批产地为吉林省，1批产地为四川省。

2.对照品与供试品溶液的制备

2.1对照品溶液的制备

精密称取山柰苷对照品9.53mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(浓度为90.82μg/mL)。

精密吸取对照品贮备液3mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液A(浓度为2.72μg/mL)；精密吸取对照品溶液A 5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液B(浓度为544.93ng/mL)；精密吸取对照品溶液A 5mL，置50mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液C(浓度为272.46ng/mL)；精密吸取对照品溶液A 1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液D(浓度为27.25ng/mL)；精密吸取对照品溶液C 1mL，置100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液E(浓度为2.72ng/mL)。

2.2供试品溶液的制备

取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，以50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.三重四级杆液相色谱质谱条件

3.1流动相

以体积份数0.02％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.02％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速：1mL/min；质谱分流比：2:1～5:1，优选3:1。

3.2质谱检测器

电喷雾正离子模式(ESI⁺)，多反应监测(MRM)模式。经过优化，选择母离子m/z579.20，子离子m/z 287.10，433.10(m/z 579.20→m/z 287.10：Q1Pre Bias-40.0V，CE-25.0，Q3Pre Bias-21.0V；m/z 579.20→m/z 433.10：Q1Pre Bias-40.0V，CE-14.0，Q3PreBias-23.0V)。以m/z 579.20→m/z 287.10进行定量。

按“3.1”和“3.2”项下确定的色谱和质谱条件，分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液B和“2.2”项下绵马贯众供试品溶液10μL，注入液质联用仪，色谱图见图1～2。对照品和供试品色谱图中，均呈现单一的色谱峰，且色谱峰对称性良好。

3.3耐用性试验

按“3.1”和“3.2”项下确定的色谱和质谱条件，选择3种不同品牌色谱柱进行耐用性考察。见表1。使用三个不同厂家的不同规格色谱柱，山柰苷色谱峰保留时间、理论塔板数、对称因子均符合液相色谱分析相关要求，表明色谱条件耐用性良好。

表1色谱柱的考察结果(m/z 579.20→287.10)

4.标准曲线和线性关系的考察

精密吸取“2.1”项下的山柰苷对照品溶液B、C、D、E，注入液相色谱仪。以进样量X(pg)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标进行线性回归，见表2。

表2山柰苷线性关系考察结果(m/z 579.20→287.10)

试验结果表明，山柰苷进样量在27.25～5449.25pg之间，进样量与峰面积呈良好的线性关系，回归方程：Y＝139.4083X-1313.90，相关系数r＝0.9998。

5.精密度试验

精密吸取“2.1”项下对照品溶液B(山柰苷浓度为544.93ng/mL)10μL，注入液相色谱仪，连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差(RSD)，结果见表3。表明仪器精密度良好。

表3山柰苷精密度试验结果(m/z 579.20→287.10)

6.检测限和定量限

分别配制一个较低浓度的对照品溶液，注入液质联用仪，观察其峰高与基线噪音的比值(即信噪比S/N)，当S/N等于3时，此时的进样量为检测限(LOD)，当S/N等于10时，此时的进样量为定量限(LOQ)。山柰苷(m/z 579.20→m/z 287.10)的LOD为0.82pg，LOQ为2.72pg。

7.稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液(产地辽宁)，在0、5、10、15、20、25(单位h)分别进样10μl，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果见表4。表明供试品溶液中山柰苷在室温放置25h内基本稳定。

表4山柰苷稳定性试验结果(m/z 579.20→287.10)

8.重复性试验

取同一绵马贯众样品(产地辽宁)，平行制备6份供试品溶液。分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液B和上述供试品溶液各10μL，注入液质联用仪，以外标法计算样品中山柰苷含量，结果见表5。表明分析方法重复性良好。

表5山柰苷含量测定重复性考察结果

9.回收率试验

取“8”项下已测知含量的样品(产地辽宁，山柰苷含量为9.14μg/g)6份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入“2.1”项下山柰苷对照品溶液A(山柰苷浓度为2.72μg/mL)1mL以及50％甲醇溶液49mL，按“2.2”项下方法，自“密塞，称定重量”开始，制备供试品溶液。分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液B和上述供试品溶液各10μL，注入液质联用仪，计算回收率，结果见表6。表明该方法的回收率良好。

表6回收率实验结果

10.样品测定

取收集到的9批绵马贯众药材，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液B和上述供试品溶液各10μL，注入液质联用仪，以外标法计算样品中山柰苷的含量，结果见表7。

表7绵马贯众药材中山柰苷含量测定结果

以下实施例1中所检测的绵马贯众药材购自安徽亳州药材市场，产地为黑龙江。实施例2中所检测的绵马贯众药材购自山东菏泽药材市场，产地为辽宁。

实施例1、绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法

一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法，步骤如下：

对照品溶液的制备：取山柰苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积份数50％的甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用体积份数50％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数0.02％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.02％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速为1.0mL/min；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z 579.2→287.1，433.1作为检测离子对，质谱分流比3:1；进样量10μL时，对照品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中山柰苷色谱峰信噪比应大于10:1；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。

实施例2、绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法

一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法，步骤如下：

对照品溶液的制备：取山柰苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积份数60％的甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理60分钟，放冷，再称定重量，用体积份数60％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数0.5％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.5％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速为0.8mL/min；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z 579.2→287.1，433.1作为检测离子对，质谱分流比5:1；进样量10μL时，对照品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中山柰苷色谱峰信噪比应大于10:1；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液m/z579.2→433.1提取离子流图中相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。

Claims (7)

1.一种绵马贯众药材中山柰苷的含量测定方法，其特征在于，步骤如下：

对照品溶液的制备：取山柰苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积份数40％～70％的甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理15～60分钟，放冷，再称定重量，用体积份数40％～70％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数0.02％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.02％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速为0.8～1.0mL/min；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z 579.2→287.1，433.1作为检测离子对，质谱分流比2:1～5:1；进样量10μL时，对照品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中山柰苷色谱峰信噪比应大于10:1；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液m/z579.2→287.1或m/z 579.2→433.1提取离子流图中相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。

2.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述的供试品溶液的制备中提取溶剂甲醇溶液的体积分数为50％。

3.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述的供试品溶液的制备中超声处理时间为30分钟。

4.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述的色谱条件与系统适用性试验中流动相流速为1.0mL/min。

5.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述的色谱条件与系统适用性试验中质谱分流比为3:1。

6.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，所述的测定法中测定m/z579.2→287.1提取离子流图中相应色谱峰面积。

7.根据权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤如下：

对照品溶液的制备：取山柰苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.5μg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取绵马贯众药材，粉碎成细粉，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入体积份数50％的甲醇溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用体积份数50％的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积份数0.02％的甲酸乙腈溶液为流动相A，体积份数0.02％的甲酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱方式：0min→40min→41min→46min，流动相A：10％→30％→90％→90％，流动相B：90％→70％→10％→10％；流速为1.0mL/min；采用三重四级杆质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，选择m/z 579.2→287.1，433.1作为检测离子对，质谱分流比3:1；进样量10μL时，对照品溶液m/z 579.2→287.1提取离子流图中山柰苷色谱峰信噪比应大于10:1；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，以对照品溶液m/z 579.2→287.1，433.1离子对定位山柰苷色谱峰，测定对照品溶液和供试品溶液m/z579.2→287.1提取离子流图中相应色谱峰面积，以外标法进行计算，即得供试品中的山柰苷含量。