CN115290772A - 一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法，涉及聚山梨酯含量检测技术领域。本发明的检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法，将高效液相色谱与蒸发光散射检测技术相结合，通过优化检测条件，大大提高了聚山梨酯80含量检测的灵敏度、准确性，且能更快速的获得检测结果。本发明的检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法稳定专属性好，特异性强，准确度高，操作简便，检测速度快，能够满足聚山梨酯80的含量测定。
Description
技术领域
本发明涉及聚山梨酯含量检测技术领域，具体涉及一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法。
背景技术
聚山梨酯80，也称吐温80，其主要成分是聚氧乙烯山梨醇酐油酸酯，此外还含有聚氧乙烯异山梨醇酐油酸酯及聚氧乙烯山梨醇酐、聚氧乙烯异山梨醇酐等，组分总数超过1500种。它作为一种非离子型表面活性剂，能抑制蛋白的变性、自动聚合与表面吸附，是生物制药领域常用的乳化剂、增溶剂、润湿剂和稳定剂。在水溶液状态，聚山梨酯80易发生降解，酯类发生水解释放出游离脂肪酸、聚氧乙烯(异)山梨醇酐；酯类在光或过渡金属的催化下发生自动氧化，生成过氧化物等氧化产物。降解引起的聚山梨酯80含量变化与水解或氧化产物的生成，将影响蛋白制剂的稳定性、药效与用药安全性，所以确定聚山梨酯80在生物制剂中的含量，对于保证药品质量、疗效及安全性是必不可少的。
现有对于聚山梨酯80含量检测的技术主要有：直接测定聚山梨酯80含量的硫氰酸铵钴显色检测法、分子排阻-蒸发光散射检测法(SEC-ELSD)、液质联用法(LC-MS)，水解后经液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)或气相色谱法(GC)间接测定聚山梨酯80含量的方法等等。以上这些方法中硫氰酸铵钴显色检测法对于蛋白制剂尤其是高浓度的单抗制剂，需先使用合适的有机溶剂沉淀去除蛋白，准确度、重复性差和灵敏度也较低，并对环境有害。TANI等发表了利用高效液相一步定量聚山梨酯80的方法，通过在流动相中加入聚山梨酯80来缩短洗脱时间，但洗脱峰仍较宽，对称性较差，而且未考查该方法的准确度是否会受蛋白浓度的影响。U等利用水解聚山梨酯80产生油酸，经RP-HPLC分离和紫外检测器检测的方法，来定量药物悬液中聚山梨酯80的含量，该方法具有较高的准确度和精密度，但因油酸稳定性较差而受到限制，而且对于蛋白制剂，该水解过程也会使蛋白水解，产物在紫外有响应，可能会影响检测。以上方法不是方法费时又费力、不适合大样本定量测定，就是不具有理想的分离度和分辨率，或是受质量光谱差和缺乏确定所有峰的影响，且大多数用于中药制剂中而在生物制剂相关研究较少。
发明内容
本发明要解决现有技术中的技术问题，提供一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法。本发明的方法将高效液相色谱与蒸发光散射检测技术相结合，通过优化检测条件，大大提高了聚山梨酯80含量检测的灵敏度、准确性，且能更快速的获得检测结果。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法，包括以下步骤：
步骤1、取聚山梨酯80对照品，加水稀释成系列浓度的对照品溶液；
步骤2、取系列浓度的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量聚山梨酯80峰面积，以聚山梨酯80浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析，计算回归线的相关系数R2，得到线性回归方程；
步骤3、取注射用重组尿酸氧化酶，加水溶解并稀释后，得到供试品溶液；
步骤4、取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液峰面积，将其代入步骤2的线性回归方程，计算得到注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80的含量；
上述方法的测试条件如下：
流动相：
流动相A：2％甲酸水溶液；
流动相B：2％甲酸乙腈溶液；
色谱条件：
流速：0.9-1.1mL/min；
漂移管温度：69-71℃；
雾化温度：69-71℃；
氮气压力：1.5-1.7SLM；
柱温：室温；
上样量：20μL；
洗脱梯度如下：
洗脱时间：0-5min，流动相A 80％、流动相B 20％；
5.01-7min，流动相A 65％、流动相B 35％；
7.01-10min，流动相A 20％、流动相B 80％；
10.01-12min，流动相A 0％、流动相B 100％；
12.01-20min，流动相A 80％、流动相B 20％。
优选的是，步骤1为取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.06mg、0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg的聚山梨酯80的对照品溶液。
优选的是，上述方法的检测范围为0.06-0.6mg/mL。
优选的是，上述方法所用色谱柱为特定型号Waters
Max 30um 3.0×20mmColumn，基质是混合型阴离子交换反相吸附剂。
优选的是，流速为1mL/min。
优选的是，漂移管温度为70℃。
优选的是，雾化温度为70℃。
优选的是，氮气压力为1.6SLM。
本发明提供的检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法的原理分三步：雾化、蒸发、检测。1)雾化：色谱柱流出物通过喷雾器针孔与氮气混合形成均匀的雾状液滴；2)蒸发：液滴通过加热的漂移管，溶剂蒸发，只有样品颗粒留下；3)检测：样品颗粒通过流动池激光“撞击”，颗粒被散射光二极管检测，散射光检测角度为90°，避免虚假信号(>90°折射/衍射光；<90°反射光)。以聚山梨酯80对照品溶液做标准曲线，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定供试品中聚山梨酯80的含量。本方法灵敏度高，测定范围为0.06-0.6mg/mL。
本发明的有益效果是：
本发明提供的检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法，将高效液相色谱与蒸发光散射检测技术相结合，通过优化检测条件，大大提高了聚山梨酯80含量检测的灵敏度、准确性，且能更快速的获得检测结果。
本发明提供的检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法，系统适用性，5次检测中，主峰计算的理论塔板数均不低于2000；专属性，对照品和供试品溶液1在聚山梨酯80主峰保留时间一致，供试品溶液2和供试品溶液3在聚山梨酯80主峰位置无吸收；线性回归方程的相关系数R2不小于0.99；重复性，6次检测注射用重组尿酸氧化酶聚山梨酯80含量的相对标准偏差不高于3％；中间精密度，两个不同试验人员、不同时间重复检测，12次检测注射用重组尿酸氧化酶聚山梨酯80主峰峰面积的相对标准偏差不高于3％；准确度，各加标样品每次检测所得的回收率在标准值的90％～108％范围内；加标样品9次检测的回收率相对标准偏差不超过5％；范围，样品中聚山梨酯80含量在常规检测含量的80％～120％范围(0.06mg/mL～0.6mg/mL)时，该分析方法的准确度、精密度以及线性均满足要求；耐用性，不同试验参数微小改变后，供试品聚山梨酯80含量检测结果的相对标准偏差不超过3％。综上，本发明的检测方法稳定专属性好，特异性强，准确度高，操作简便，检测速度快，能够满足聚山梨酯80的含量测定。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为聚山梨酯80的典型色谱图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的说明。
实施例1本发明的方法的性能验证
1、材料与方法
1.1实验参数
1.1.1仪器及耗材
高效液相色谱仪：安捷伦1260Infinity II ELSD；
色谱柱：Waters
Max 30um 3.0×20mm Column；
移液器：Eppendorf、Sartorius；
分析天平：Sartorius；
1.1.2样品准备
对照品溶液制备：取Sigma聚山梨酯80 1mg，加水溶解制成每1mL中含1mg的溶液，再稀释5倍(即0.2mg/mL)。
供试品溶液制备：取注射用重组尿酸氧化酶，加水制成每1mL含重组尿酸氧化酶约为1.5mg的溶液，再稀释5倍。
1.1.3流动相
流动相A：2％甲酸水溶液
量取水980mL，加入20mL甲酸，混匀，脱气，即得；
流动相B：2％甲酸乙腈溶液
量取乙腈980mL，加入20mL甲酸，混匀，脱气，即得。
1.1.4色谱条件
流速：1mL/min；
漂移管温度：70℃；
雾化温度：70℃；
氮气压力：1.6SLM；
柱温：室温；
上样量：20μL；
洗脱梯度：
| T(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-5 | 80 | 20 |
| 5.01-7 | 65 | 35 |
| 7.01-10 | 20 | 80 |
| 10.01-12 | 0 | 100 |
| 12.01-20 | 80 | 20 |
1.2具体步骤
1.2.1系统适用性
取注射用重组尿酸氧化酶按1.1.2处理，上样量20μL，连续进样5次，以注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80主峰计算理论塔板数。
1.2.2专属性
取对照品，加适量水稀释成每1mL中含Sigma聚山梨酯80约1.0mg的溶液，再稀释5倍。
供试品溶液1：取注射用重组尿酸氧化酶，加水溶解并稀释成每1mL中含重组尿酸氧化酶约1.5mg的溶液，再稀释5倍。
供试品溶液2：取重组尿酸氧化酶原液，加水稀释成每1mL中含重组尿酸氧化酶约1.5mg的溶液，再稀释5倍。
供试品溶液3：取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)13.6mg，磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)0.33mg，蔗糖5mg，甘氨酸25mg，加水溶解并稀释至1mL。
方法：分别取对照品溶液、供试品溶液1、供试品溶液2、供试品溶液3。
试验次数：重复三次。
1.2.3线性
取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.06mg、0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg的聚山梨酯80的溶液。依1.1.4分析方法进行测定。每个浓度平行测2次，以浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析，计算回归线的相关系数R2。
试验次数：每个浓度梯度1次。
1.2.4精密度-重复性
取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.1mg、0.4mg聚山梨酯80的溶液，每个浓度平行测3次，取平均数，以浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析。
取注射用重组尿酸氧化酶6支，分别加适量水溶解后，再加水分别稀释成每1mL约含重组尿酸氧化酶1.5mg的溶液，再稀释5倍，将所测值代入线性回归方程，计算注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80的含量。
1.2.5精密度-中间精密度
取注射用重组尿酸氧化酶6支，分别加适量水溶解后，再加水分别稀释成每1mL约含重组尿酸氧化酶1.5mg的溶液，再稀释5倍，进行测定。
两个不同试验人员、不同时间重复检测。
1.2.6准确度
取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.1mg、0.4mg聚山梨酯80的溶液，每个浓度平行测3次，取平均数，以浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析。
加标样品的制备：
三个浓度高、中、低标准品加入量与所取供试品中待测定成分之比在1.2:1，1:1，0.8:1左右，即取注射用重组尿酸氧化酶标示量的一半(约20mg)，分别按其所含聚山梨酯80的含量加入相应比例的标准品(高、中、低)，用水定容至1mL，混匀，再稀释5倍。
依1.1.4分析方法进行测定，每个浓度测定3份样品。按下式计算加标样品的回收率：
回收率(％)＝(加标样品含量实测值-供试品所含聚山梨酯80含量)/标准品含量×100％；
1.2.7范围
取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.1mg、0.4mg聚山梨酯80的溶液，每个浓度平行测3次，取平均数，以浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析。
加标样品的制备：
三个浓度高、中、低标准品加入量与所取供试品中待测定成分之比在1.2:1，1:1，0.8:1左右，即取注射用重组尿酸氧化酶标示量的一半(约20mg)，分别按其所含聚山梨酯80的含量加入相应比例的标准品(高、中、低)，用水定容至1mL，混匀，再稀释5倍。
依1.1.4分析方法进行测定，每个浓度测定3份样品。按下式计算加标样品的回收率：
回收率(％)＝(加标样品含量实测值-供试品所含聚山梨酯80含量)/标准品含量×100％；
1.2.8耐用性
取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.1mg、0.4mg聚山梨酯80的溶液，每个浓度平行测3次，取平均数，以浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析。
取供试品注射用重组尿酸氧化酶，加水制成每1mL约含重组尿酸氧化酶1.5mg的溶液，再稀释5倍。
(一)改变漂移管温度平行制备供试品溶液3份，其它条件不变，分别在漂移管温度69℃，70℃，71℃条件下进样检测。
(二)改变雾化温度平行制备供试品溶液3份，其它条件不变，分别在雾化温度69℃，70℃，71℃条件下进样检测。
(三)色谱柱平行制备供试品溶液3份，其它条件不变，使用3根色谱柱分别进样检测。
1.3实验结果与分析
1.3.1系统适用性
5次检测中，以注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80主峰计算的理论塔板数均不低于2000。
1.3.2专属性
对照品和供试品溶液1在聚山梨酯80主峰保留时间一致，供试品溶液2和供试品溶液3在聚山梨酯80主峰位置无吸收。
1.3.3线性
线性回归方程的相关系数R2不小于0.99(0.9983)。
1.3.4精密度-重复性
6次检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的相对标准偏差不高于3％(1.61％)。
1.3.5精密度-中间精密度
12次检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80主峰峰面积的相对标准偏差不高于3％(2.21％)。
1.3.6准确度
回收率(％)＝(加标样品含量实测值-供试品所含聚山梨酯80含量)/标准品含量×100％；
各加标样品每次检测所得的回收率在标准值的90％～108％范围内；加标样品9次检测的回收率相对标准偏差不超过5％(2.93％)。
1.3.7范围
回收率(％)＝(加标样品含量实测值-供试品所含聚山梨酯80含量)/标准品含量×100％；
样品中聚山梨酯80含量在常规检测含量的80％～120％范围(0.06mg/mL～0.6mg/mL)时，该分析方法的准确度、精密度以及线性均满足要求。
1.3.8耐用性
不同试验参数微小改变后，供试品聚山梨酯80含量检测结果的相对标准偏差不超过3％(1.62％)。
1.4典型色谱图
图1为聚山梨酯80的典型色谱图，色谱图峰面积用于线性回归方程的计算，色谱图平滑、无杂峰有利于峰面积的计算，进而能更准确的计算聚山梨酯80的含量。
实施例2采用本发明的方法检测本公司新产品注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量
本公司新产品注射用重组尿酸氧化酶成品成分明细：
步骤1、取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.06mg、0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg的聚山梨酯80的对照品溶液。
步骤2、取系列浓度的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量聚山梨酯80峰面积，以聚山梨酯80浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析，计算回归线的相关系数R2，得到线性回归方程(Y＝1.7125X+4.1003)；
步骤3、取本公司新产品注射用重组尿酸氧化酶原液，加水稀释成每1mL中含重组尿酸氧化酶约1.5mg的溶液，再稀释5倍，得到供试品溶液；
步骤4、取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液峰面积，将其代入步骤2的线性回归方程，即可计算得到注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80的含量(0.932-0.990mg)；
上述方法的测试条件如下：
仪器及耗材
高效液相色谱仪：安捷伦1260Infinity II ELSD；
色谱柱：Waters
Max 30um 3.0×20mm Column；
移液器：Eppendorf、Sartorius；
分析天平：Sartorius；
流动相
流动相A：2％甲酸水溶液
量取水980mL，加入20mL甲酸，混匀，脱气，即得；
流动相B：2％甲酸乙腈溶液
量取乙腈980mL，加入20mL甲酸，混匀，脱气，即得。
色谱条件
流速：1mL/min；
漂移管温度：70℃；
雾化温度：70℃；
氮气压力：1.6SLM；
柱温：室温；
上样量：20μL；
洗脱梯度：
| T(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-5 | 80 | 20 |
| 5.01-7 | 65 | 35 |
| 7.01-10 | 20 | 80 |
| 10.01-12 | 0 | 100 |
| 12.01-20 | 80 | 20 |
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (8)
1.一种检测注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取聚山梨酯80对照品，加水稀释成系列浓度的对照品溶液；
步骤2、取系列浓度的对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量聚山梨酯80峰面积，以聚山梨酯80浓度的自然对数值X为横坐标，色谱峰面积值的自然对数值Y为纵坐标，进行线性回归分析，计算回归线的相关系数R2，得到线性回归方程；
步骤3、取注射用重组尿酸氧化酶，加水溶解并稀释后，得到供试品溶液；
步骤4、取供试品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，测量供试品溶液峰面积，将其代入步骤2的线性回归方程，计算得到注射用重组尿酸氧化酶中聚山梨酯80的含量；
上述方法的测试条件如下：
流动相：
流动相A：2％甲酸水溶液；
流动相B：2％甲酸乙腈溶液；
色谱条件：
流速：0.9-1.1mL/min；
漂移管温度：69-71℃；
雾化温度：69-71℃；
氮气压力：1.5-1.7SLM；
柱温：室温；
上样量：20μL；
洗脱梯度如下：
洗脱时间：0-5min，流动相A 80％、流动相B 20％；
5.01-7min，流动相A 65％、流动相B 35％；
7.01-10min，流动相A 20％、流动相B 80％；
10.01-12min，流动相A 0％、流动相B 100％；
12.01-20min，流动相A 80％、流动相B 20％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1为取Sigma聚山梨酯80对照品，加水分别制成每1mL含0.06mg、0.1mg、0.2mg、0.4mg、0.6mg的聚山梨酯80的对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的检测范围为0.06-0.6mg/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法所用色谱柱的型号为Waters
Max 30um 3.0×20mm Column，基质是混合型阴离子交换反相吸附剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为1mL/min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，漂移管温度为70℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，雾化温度为70℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氮气压力为1.6SLM。
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