CN108760937A - 醋酸卡泊芬净中残留乙二胺的测定及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种醋酸卡泊芬净中残留乙二胺的检测方法。将乙二胺与硫酸铜络合后，进行液相色谱法检测。解决了醋酸卡泊芬净中残留乙二胺不适于气相色谱法检测，而在液相色谱法中乙二胺无紫外吸收的问题，同时避免了醋酸卡泊芬净降解产生的乙二胺对残留乙二胺测定的影响，为提高醋酸卡泊芬净的质量及用药安全提供了保证。本发明提供的检测方法，也为其他类似酸性化合物中乙二胺、三乙胺等胺类残留溶剂的检测提供了很好的借鉴。

Description

醋酸卡泊芬净中残留乙二胺的测定及其应用

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，特别涉及一种测定醋酸卡泊芬净中残留乙二胺含量的检测方法。

背景技术

醋酸卡泊芬净(Caspofungin acetate)，可有效预防和/或治疗因丝状真菌和酵母导致的感染，及用于预防和/或控制和/或治疗诸如因杰氏肺囊虫(Pneumocystisjiroveci)(以前分类为卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii))导致的肺炎。其CAS号为：179463-17-3，结构如下：

乙二胺，沸点116～117.2℃，是醋酸卡泊芬净的合成原料之一，醋酸卡泊芬净成品中可能存在乙二胺残留。由于乙二胺化学性能活泼，溶于水，具有较强的挥发性、毒性和腐蚀性。为保证药品质量，建立合适的醋酸卡泊芬净中乙二胺残留含量检测方法，并对其进行严格控制十分必要。

胺类残留通常采用气相色谱法测定，但由于醋酸卡泊芬净中含有醋酸及酸性基团，易与乙二胺成盐而难于汽化检测，所以卡泊芬净中残留乙二胺的含量检测不适宜用气相色谱法。另一方面，由于乙二胺无紫外吸收，且极性强难以在色谱柱上保留，也不适合一般的液相色谱法检测。

此外，醋酸卡泊芬净极为不稳定，需于-70℃以下保存。在常规检测条件下，醋酸卡泊芬净会降解产生新的乙二胺，从而干扰残留乙二胺的测定，影响检测的准确性。

目前尚未有文献报道醋酸卡泊芬净中残留乙二胺含量的测定。根据药品审评中心指导原则要求，需要建立一种醋酸卡泊芬净中残留乙二胺含量的测定方法，并规定合理的限定，对确保醋酸卡泊芬净的安全用药具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决醋酸卡泊芬净中残留乙二胺不适宜气相色谱法检测，而液相色谱法无紫外吸收以及醋酸卡泊芬净会分解产生乙二胺干扰检测结果等技术缺陷，提供一种操作简单，检测灵敏度高，适合醋酸卡泊芬净中乙二胺残留含量的检测方法。

具体地，本发明的目的通过下述技术方案得以实现：

一种醋酸卡泊芬净中残留乙二胺的测定方法，包括如下步骤：

A、供试品溶液制备：

配制0.001mol/L～0.05mol/L硫酸铜溶液，备用；

临用新制。取醋酸卡泊芬净适量，精密称定，按质量体积比1∶25～300加入上述硫酸铜溶液，摇匀，作为供试品溶液；

B、对照品溶液制备：精密称取乙二胺适量，加入步骤A中硫酸铜溶液，定量稀释，制成乙二胺浓度约为10μg/ml的溶液，作为对照品溶液；

C、检测方法：分别取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

D、含量计算：按外标法以峰面积计算残留溶剂的含量。

其中所述的硫酸铜为分析纯和/或色谱纯。

在一种实施方式中，步骤A中配制的硫酸铜溶液浓度为0.004mol/L。

在一种实施方式中，步骤A中配制的硫酸铜溶液用磷酸调节pH值3～5，优选为4.2。

步骤A中配制的供试品溶液需临用新制，溶解样品的硫酸铜溶液预先配制好后可以常温下放置，也可于2-8℃冷藏备用。使用常温下放置的硫酸铜溶液配制的供试品溶液，需在短时间内，如0.5小时内完成进样；使用预先2-8℃冷藏的硫酸铜溶液配制供试品溶液，于2-8℃冷盘保存，可提高样品溶液稳定性，在2小时内进样，不影响检测结果。

配制供试品溶液时，醋酸卡泊芬净和硫酸铜溶液的质量体积比优选为1∶100。

本发明可以采用各种高效液相色谱仪，比如型号为Agilent 1260。所用的色谱柱可以是以阳离子交换键合硅胶为填充剂的色谱柱，如色谱柱Repromer SCX 10μm RM10.scx和色谱柱Repromer CAT 7μm RM17.cat.；也可以是以磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂的色谱柱，如色谱柱HAMILTON PRP-X200、Hypersil BioBasic SCX、Polysulfonix-SCX或ZORBAX 300SCX，优选为色谱柱ZORBAX 300SCX。该色谱柱的柱长150mm、内径4.6mm、粒径5μm。

本发明所用液相色谱条件为：

流动相：0.001～0.05mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH值为3～5；

柱温：20℃～55℃；

检测波长：236nm；

流速：0.5～3.0ml/min；

进样体积为5～50μl。

作为优选，液相色谱柱条件为：

流动相：0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH为4.2；

柱温：45℃；

检测波长：236nm

流速：2.0ml/min；

进样体积为20μl。

本发明巧妙地利用硫酸铜与乙二胺络合，所得络合物产生紫外吸收可进行液相色谱法检测，解决了醋酸卡泊芬净中残留乙二胺不适于气相色谱法检测，而在液相色谱法中乙二胺无紫外吸收的问题，增强了检测的灵敏度，也提高了其专属性。

本发明临用新制供试品溶液，避免了样品降解产生的乙二胺对残留乙二胺测定的干扰；对溶解样品的溶剂进行预先冷藏，增加了样品在溶液中的稳定性，保证了测定结果的可靠性和准确性。

本发明采用磺酸基阳离子交换键合硅胶柱，解决了强极性物质在普通色谱柱上几乎无保留的难题，操作简单。

本发明对提供的醋酸卡泊芬净中残留乙二胺的测定方法进行了方法学验证，包括空白试验、精密度试验、检出限与定量限、线性试验和回收试验。

所述测定方法的验证线性试验，包括如下步骤：

1)、配制0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2，作为流动相溶液备用。

2)、精密称取乙二胺100mg，置100ml量瓶中，加入步骤1)中所述硫酸铜溶液定容，摇匀，备用。

3)、分别移取0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0ml步骤2)制备的乙二胺溶液于100ml量瓶中，用步骤1)中所述硫酸铜溶液稀释定容，摇匀，作为待测溶液，备用。

4)、分别精密量取步骤3)中待测溶液各20μl进样，记录色谱图。

5)、以浓度为x轴，峰面积为y轴，作线性回归曲线。

其中所述测定方法的验证回收试验步骤如下：

1)、配制0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2，备用；

2)、用步骤1)中所述硫酸铜溶液分别配制乙二胺的浓度为8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml的硫酸铜溶溶液作为对照品溶液；

3)、精密称取醋酸卡泊芬净0.25g于25ml容量瓶中，用步骤2)中对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液。量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；

4)、另取乙二胺对照品溶液，同法测定，记录色谱图，按外标法计算回收率。

结果表明，试验平均回收率为102％，RSD为0.78％(n＝9)，回收率在90％～110％之间，RSD小于5％，方法回收率好，故能准确定量检出醋酸卡泊芬净中可能残留的乙二胺。

本发明所提供的方法可用于酸性化合物中胺类残留溶剂的检测。其中，酸性化合物包括酸根盐类化合物或含有酸性基团的化合物；酸根盐可以但不限于是：醋酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐等。胺类残留溶剂包括乙二胺、三乙胺、二乙胺、3-二甲氨基丙胺或其他胺类溶剂。

本发明带来的有益效果有：

1、本发明解决了现有技术无法检测醋酸卡泊芬净中残留乙二胺含量的技术问题；

2、本发明提供的测定方法，检测灵敏度高、回收率高，最低检出浓度达0.4225μg/ml甚至更低，回收率达102％；

3、本发明提供的检测方法可规避醋酸卡泊芬净降解产生的乙二胺对残留乙二胺测定的影响；

4、本发明提供的残留乙二胺的检测方法，可提高醋酸卡泊芬净的质量及用药安全；

5、本发明提供的检测方法，对其他类似酸性化合物中乙二胺、三乙胺等胺类残留溶剂的检测提供了很好的借鉴。

附图说明

图1实施例1中乙二胺对照品溶液色谱图。

图2实施例1供试品溶液2中170602-KB批醋酸卡泊芬净样品的检测色谱图。

图3实施例3中空白溶液色谱图。

图4实施例3中乙二胺检测限色谱图。

图5实施例3中乙二胺定量限色谱图。

图6实施例3中乙二胺的线性关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

1、仪器：

分析天平，型号：METTLER TOLEDO ABS135-S；

高效液相色谱仪型号为Agilent 1260、色谱柱型号为ZORBAX 300SCX，150×4.6mm，5μm：以磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂。

2、试剂：

乙二胺(试剂纯)，硫酸铜(分析纯)，磷酸(分析纯)。

3、样品：

醋酸卡泊芬净，批号：170602-KB、170701-KB、170702-KB。

实施例1

色谱条件：

流动相：0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2；

柱温：45℃；

检测波长：236nm；

流速：2.0ml/min。

1、溶液配制及检测

A、供试品溶液的制备：

配制0.004mol/l的硫酸铜溶液，用磷酸调节pH为4.2。将该溶液分为两份，一份于室温下保存，一份于2-8℃保存，备用；

临用新制。取醋酸卡泊芬净约0.25g，精密称定，置25ml容量瓶中，加入室温保存的硫酸铜溶液使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液1；加入2-8℃保存的硫酸铜溶液使其溶解，并稀释至刻度，摇匀，于2-8℃冷盘保存，作为供试品溶液2；

B、对照品溶液的制备：精密称取乙二胺适量，加入室温或2-8℃保存的硫酸铜溶液，定量稀释制成乙二胺浓度约为10μg/ml的溶液，作为对照品溶液。

C、检测方法：参照中国药典2015年版四部通则0512高效液相色谱法测定。分别取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

2、测定结果

按照上述测定方法对三批醋酸卡泊芬净供试品进行检测，结果见表1。

表1

实施例2溶液稳定性

1、乙二胺对照品溶液的稳定性

取实施例1中乙二胺对照品溶液(用室温保存的硫酸铜溶液配制)，按实施例1检测方法，分别在0、1、4、10、14小时进样，检测结果见表2。

表2

结果表明，乙二胺对照品溶液在14小时内基本稳定。

2、供试品溶液的稳定性

(1)、供试品溶液1的稳定性

按照实施例1中制备方法，新配制供试品溶液1，加入乙二胺，使其浓度约为10μg/ml，按实施例1检测方法，分别在0、0.25、0.5、1、2、3.5、6.5小时进样，检测其中乙二胺的含量，结果见表3。

表3

时间(h)	0	0.25	0.5	1	2	3.5	6.5
								峰面积	250.04	252.52	255.13	263.33	272.51	289.52	322.08

结果表明，供试品溶液1稳定性较差，溶液中的醋酸卡泊芬净随存放时间延长有降解产生乙二胺的趋势，但在0.5小时内检测不影响测定结果。

(2)、供试品溶液2的稳定性

按照实施例1中制备方法，新配制供试品溶液2，加入乙二胺，使其浓度约为10μg/ml，配制好的溶液于2-8℃冷盘保存。按实施例1检测方法，分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3.0小时进样，检测其中乙二胺的含量，结果见表4。

表4

结果表明，供试品溶液2在2小时内较为稳定，进样测定可在2小时内完成。

实施例3方法学验证

1、空白试验

精密量取实施例1中室温下保存的硫酸铜溶液作为空白溶液，注入液相色谱仪，色谱条件同实施例1，空白溶液色谱图如图3所示。结果表明空白溶液对乙二胺测定无干扰。

2、精密度试验

(1)、重复性

称取乙二胺适量，精密称定，加入实施例1中室温下保存的0.004mol/l的硫酸铜溶液，定量稀释，制成乙二胺浓度约为10μg/ml的溶液，作为待测溶液。按实施例1色谱条件进行测定，连续进样6针，测定结果见表5。

表5

进样6针，峰面积的RSD为0.70％，表明该检测方法重复性好。

(2)、重现性

精密称取醋酸卡泊芬净0.25g于25ml容量瓶中，加入实施例1中用室温保存的硫酸铜溶液配制的乙二胺对照品溶液使其完全溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液。按实施例1液相色谱条件进样6针，记录色谱图。

另取上述乙二胺对照品溶液，同法测定，按外标法计算待测溶液中乙二胺相对于醋酸卡泊芬净的含量。结果见表6。

表6

结果乙二胺含量的RSD为0.60％，表明该检测方法重现性好。

3、检出限与定量限

方法：精密称取乙二胺100mg，加入实施例1中室温保存的0.004mol/L硫酸铜溶液，稀释成7个不同浓度的溶液，见表7。

按实施例1色谱条件试验，精密量取各待测溶液20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

表7

编号	浓度(μg/ml)
		1#	0.507
2#	1.014
		3#	2.028
4#	3.042
		5#	5.070
6#	8.112
		7#	10.14

实验结果：

通过逐级降低浓度法测定，按照S/N＝3计算，测得乙二胺的检出限为0.4225μg/ml，相当于样品0.0042％的量；检测限色谱图如图4所示。

通过逐级降低浓度法测定，按照S/N＝10计算，测得乙二胺的定量限为0.9218μg/ml，相当于样品0.0092％的量；定量限色谱图如图5所示。

4、线性试验

配制0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2，作为流动相溶液备用；

精密称取乙二胺100mg，置于100ml量瓶中，用配制好的流动相溶液溶解并稀释定容，摇匀，备用。

分别移取上述乙二胺溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0ml于100ml量瓶中，用配制好的流动相溶液稀释定容，摇匀，作为待测溶液。

分别量取20μl待测溶液进样，记录色谱图。检测结果见表8。

表8

编号	溶液浓度(μg/ml)	峰面积
			1#	1.014	23.89
2#	2.028	45.92
			3#	3.042	70.88
4#	5.070	128.85
			5#	8.112	199.82
6#	10.14	249.38
			7#	12.17	306.19
8#	15.21	374.96
			9#	20.28	503.12

以浓度为x轴，峰面积为y轴，作线性回归曲线。得到线性方程为Y＝24.955X-2.2402，相关系数R＝0.9998。表明乙二胺在1.014～20.28μg/ml浓度范围内线性关系良好。线性关系曲线图如图6所示。

5、回收试验

1)、配制0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2，备用；

2)、用步骤1)中所述硫酸铜溶液分别配制乙二胺的浓度为8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml的硫酸铜溶溶液作为对照品溶液；

3)、精密称取醋酸卡泊芬净0.25g于25ml容量瓶中，用步骤2)中对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为待测溶液。按实施例1液相色谱条件进样，记录色谱图。

4)、另取乙二胺对照品溶液，同法测定，记录色谱图，按外标法计算回收率。结果见表9。

表9

即，试验平均回收率为102％，RSD为0.78％(n＝9)，表明检测方法回收率好。

实施例4

供试品溶液、对照品溶液参照实施例1中供试品溶液1和对照品溶液(用室温保存的硫酸铜溶液配制)的制备方法配制。区别为本实施例的流动相为0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2，流速为1.0mL/min。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX 300SCX，150×4.6mm，5μm；

流动相：0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2；

流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：236nm；

进样体积为10μl。

按照上述条件，检测三批供试品溶液，结果见表10。

表10

批号	乙二胺含量(％)
		170602-KB	0.014
170701-KB	未检出
		170702-KB	0.016

实施例5

供试品溶液、对照品溶液参照实施例1中供试品溶液2和对照品溶液(用2-8℃保存的硫酸铜溶液配制)的制备方法制备。其区别为本实施例的流动相为0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.6。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX 300SCX，150×4.6mm，5μm；

流动相：0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.9；

流速：2.0ml/min；

柱温：45℃；

检测波长：236nm；

进样体积为50μl。

按照上述条件，检测三批供试品溶液，结果见表11。

表11

批号	乙二胺含量(％)
		170602-KB	0.012
170701-KB	未检出
		170702-KB	0.018

实施例6

供试品溶液、对照品溶液参照实施例1中供试品溶液2和对照品溶液(用2-8℃保存的硫酸铜溶液配制)的制备方法制备。其区别为本实施例的色谱柱为Repromer CAT 7μmRM17.cat.，流动相为0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2。

色谱条件：

色谱柱：Repromer CAT 7μm RM17.cat.；

流动相：0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2；

流速：2.0ml/min；

柱温：45℃；

检测波长：236nm；

进样体积为20μl。

按照上述条件，检测三批供试品溶液，结果见表12。

表12

批号	乙二胺含量(％)
		170602-KB	0.013
170701-KB	未检出
		170702-KB	0.016

实施例7

供试品溶液、对照品溶液参照实施例1中供试品溶液1和对照品溶液(用室温保存的硫酸铜溶液配制)的制备方法制备。其区别为溶解样品和乙二胺的硫酸铜溶液不经磷酸调节pH。

色谱条件：

色谱柱：ZORBAX 300SCX，150×4.6mm，5μm；

流动相：0.008mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH至4.2；

流速：2.0ml/min；

柱温：45℃；

检测波长：236nm；

进样体积为20μl。

按照上述条件，检测三批供试品溶液，结果见表13。

表13

需要指出的是，上述几个较佳实施例是对本发明技术方案作的进一步非限制的详细说明，仅为说明本发明的技术构思和特点。其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种醋酸卡泊芬净中残留乙二胺的测定方法，包括如下步骤：

A、配制0.001～0.05mol/L的硫酸铜溶液，备用；

临用新制。取醋酸卡泊芬净，精密称定，按质量体积比1∶25～300加入上述硫酸铜溶液，摇匀，作为供试品溶液；

B、对照品溶液制备：精密称取乙二胺适量，精密称定，加入步骤A中硫酸铜溶液，定量稀释，制成乙二胺浓度约为10μg/ml的溶液，作为对照品溶液；

C、检测方法：分别取供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

D、含量计算：按外标法以峰面积计算残留乙二胺的含量。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤A中配制的硫酸铜溶液浓度为0.004mol/L。

3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤A中配制的硫酸铜溶液用磷酸调节其pH值3～5，优选为4.2。

4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤A中配制的硫酸铜溶液和供试品溶液在使用前均于2-8℃保存。

5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤A中所述醋酸卡泊芬净和硫酸铜溶液的质量体积比为1∶100。

6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤C中所述的高效液相色谱仪包括现有技术中所用的各种型号，优选型号为Agilent 1260；所用的色谱柱为阳离子交换键合硅胶为填充剂的色谱柱，如Repromer SCX 10μm RM10.scx、Repromer CAT 7μm RM17.cat.。

7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤C中所述的高效液相色谱仪所用的色谱柱为磺酸基阳离子交换键合硅胶为填充剂的色谱柱，型号为HAMILTON PRP-X200、Hypersil BioBasic SCX、Polysulfonix-SCX或ZORBAX 300SCX，优选ZORBAX300SCX，该色谱柱的柱长150mm、内径4.6mm、粒径5μm。

8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：液相色谱条件为：

流动相：0.001～0.05mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH值为3～5；

柱温：20℃～55℃；

检测波长：236nm；

流速：0.5～3.0ml/min；

进样体积为5～50μl。

9.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于：液相色谱条件为：

流动相：0.004mol/L硫酸铜溶液，磷酸调节pH为4.2；

流速：2.0ml/min；

柱温：45℃；

检测波长：236nm；

进样体积为20μl。

10.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：该方法可用于酸性化合物中胺类残留溶剂的检测；所述酸性化合物包括酸根盐类化合物或含有酸性基团的化合物；所述胺类残留溶剂包括乙二胺、三乙胺、二乙胺或3-二甲氨基丙胺。