CN102076707A - 无卡泊芬净杂质a的卡泊芬净 - Google Patents

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Abstract

本发明提供无卡泊芬净杂质A的卡泊芬净、其制备方法和分离卡泊芬净杂质A的方法。

Description

无卡泊芬净杂质A的卡泊芬净
交叉引用
本发明要求保护以下美国临时专利申请号的权益：于2008年6月25日提交的61/133,184；于2008年6月30日提交的61/133,602；于2009年4月30日提交的61/174,289；于2008年8月7日的61/188,385；以及于2008年12月22日提交的61/139,873。通过引用将这些申请的内容结合于本文中。
发明领域
本发明涉及无卡泊芬净杂质A的卡泊芬净，其制备方法和分离卡泊芬净杂质A的方法。
发明背景
下式的卡泊芬净，1-[(4R，5S)-5-[(2-氨乙基)氨基]-N2-(10，12-二甲基-1-氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸]-5-[(3R)-3-羟基-L-鸟氨酸]-肺念定(pneumocandin)B0：
Figure BPA00001281327500011
为来自棘白菌素家族的大环脂肽，其为抑制β(1，3)-D-葡聚糖(真菌细胞壁的必要组分)的合成的新一类抗真菌剂。已知棘白菌素家族可用于治疗全身性真菌感染，尤其是由假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、组织孢浆菌属(Histoplasma)、球孢子菌属(Coccidioides)和芽酵母属(Blastomyces)引起的感染。还已发现它们可用于治疗和预防由卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)引起的感染，其常常存在于无免疫应答的患者例如患有AIDS的患者中。卡泊芬净显示与两性霉素B和三唑类的附加或协同抗真菌活性。
卡泊芬净作为双乙酸盐给予并由Merck & Co.，Inc以商品名Cancidas
Figure BPA00001281327500021
出售。
卡泊芬净为半合成产物，其可制备自下式的肺念定B0：
Figure BPA00001281327500022
其为天然产物，获得自诸如发酵反应等来源。肺念定B0的制备公开于若干公开文献中例如美国专利号5,194,377和美国专利号5,202,309。
已知根据INN(国际非专利药名，International Nonproprietary Names)的卡泊芬净及其药学上可接受盐可用于治疗真菌感染(参见Merck Index，第13版，专题号1899)。
美国专利号5,378,804描述了卡泊芬净，而美国专利号5,552,521和5,936,062描述了制备卡泊芬净的合成途径。
与任何合成化合物一样，卡泊芬净可包含无关化合物或杂质。
工业微生物和生物技术期刊(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology)第26期第216-211页(2001)描述了将被其丝氨酸类似物污染的肺念定B0转化为含卡泊芬净丝氨酸类似物的卡泊芬净。
肺念定B0的丝氨酸类似物还描述于WO 2000/08197中。然而，上述公开文献中无一提供卡泊芬净丝氨酸类似物本身的分离或表征。
在卡泊芬净或任何活性药物成分(“API”)中的杂质为不需要的，并且在极端情况下，甚至可能对正接受含API的剂型治疗的患者有害。
在制备过程中产生的API的纯度对商品化是关键的。美国食品药品监督管理局(“FDA”)要求过程杂质控制在规定界限以下。例如，在其对API制造商的ICH Q7A指南中，FDA指定了可使用的原材料的质量，以及可接受的工艺条件例如温度、压力、时间和化学计量比，包括纯化步骤例如结晶、蒸馏和液-液萃取。参见ICH关于活性药物成分的药品生产质量管理规范(ICH Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients)，Q7A，现行阶段版本4(2000年11月10日)。
化学反应的产物很少为具有足够纯度而符合药品标准的单一化合物。反应的副产品和副产物以及用于反应中的辅助试剂在大多数情况下也将存在于产物中。在加工API期间的某些阶段中，必须分析其纯度，通常通过高效液相色谱法(“HPLC”)或薄层色谱法(“TLC”)，以确定其是否适于继续加工，并最终用于药物产品中。FDA要求API尽可能无杂质，使得其在临床应用时尽可能地安全。例如，FDA推荐某些杂质的量限制在少于0.1个百分比。参见ICH关于活性药物成分的药品生产质量管理规范，Q7A，现行阶段版本4(2000年11月10日)。
一般而言，利用光谱方法和/或另一种物理方法鉴定副产品、副产物和辅助试剂(总称为“杂质”)，然后关联至例如在色谱图中的峰位或TLC板上的斑点。参见Strobel，H.A等，Chemical Instrumentation：A Systematic Approach(化学测量：系统化方法)，953，第3版.(Wiley & Sons，New York 1989)。一旦将具体杂质关联至峰位，便可通过其在色谱图中的相对位置鉴定样品中的杂质，其中以将样品注射到柱上与杂质洗脱通过检测器之间的分钟来测定色谱图中的位置。色谱图中的相对位置称为“保留时间”。
如本领域技术人员已知，通过了解杂质的化学结构和合成途径以及通过确定影响杂质在终产物中的量的参数，极大地提高过程杂质(process impurity)的控制。
发明简述
在一个实施方案中，本发明包括分离的卡泊芬净杂质A(“杂质A”)，1-((4R，5S)-5-(2-氨乙基氨基)-N2-(10，12-二甲基-1-氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸)-2-L-丝氨酸-5-((3R)-3-羟基-L-鸟氨酸)-肺念定B0，其具有下式：
Figure BPA00001281327500041
本发明的分离杂质A可通过以下一种或多种来表征：在约0.81、0.82、0.83、1.46、1.75、1.84、3.57、3.77、3.90、3.92、4.11、4.17、4.27、4.40、6.66、6.98ppm具有氢化学位移的1HNMR谱；在约11.00、19.64、20.18、23.84、25.29、29.19、29.50、31.05、33.38、34.65、35.02、37.38、45.60、49.56、54.25、54.55、55.37、61.06、61.68、62.65、68.51、68.70、69.26、69.76、73.13、73.22、75.97、114.69、128.09、132.28、156.59、166.61、169.39、170.63、170.71、171.19、173.68、174.75ppm具有碳化学位移的13CNMR谱；在约m/z＝540.319([M+2H]2+)、1079.630([M+H]+)具有峰的MS(ESI+)谱；在HPLC分析(例如下文描述的HPLC分析)中，保留时间为约18分钟；以及相对保留时间为约0.95。
在一个实施方案中，本发明包括含有少于约1.0％(HPCL面积)杂质A的纯卡泊芬净。优选所述纯卡泊芬净含有少于约0.6％、更优选少于约0.05％(HPCL面积)的杂质A。
在另一个实施方案中，本发明包括使用反相色谱法纯化卡泊芬净的方法。
在又一实施方案中，本发明包括使用装载有反相树脂的制备型HPLC纯化卡泊芬净的方法。
在一个实施方案中，本发明还提供将杂质A作为参比标记以分析卡泊芬净及其盐的纯度的应用。所述方法包括：a)提供包含卡泊芬净及其盐和杂质A的参比样品；b)通过HPLC分析参比样品，并确定杂质A相对于卡泊芬净及其盐的相对保留时间；c)通过HPLC分析卡泊芬净及其盐的样品，并确定该样品的内含物相对于卡泊芬净及其盐的相对保留时间；以及d)将步骤c)中计算的相对保留时间与步骤b)中对杂质A计算的相对保留时间进行比较，其中如果任何在步骤c)中计算的相对保留时间与杂质A的相对保留时间基本相同，则杂质A存在于卡泊芬净及其盐的样品中。
在一个实施方案中，本发明还包括使用作为参比标准的杂质A测定杂质A在卡泊芬净及其盐的样品中的量的定量法。所述方法包括：a)通过HPLC测量在含有未知量杂质A的卡泊芬净及其盐的样品中对应于杂质A的峰下面积；b)通过HPLC测量在含有已知量杂质A的参比标准中对应于卡泊芬净及其盐的峰下面积；以及c)通过将步骤a)中计算的面积与步骤b)中计算的面积进行比较，确定在卡泊芬净及其盐的样品中杂质A的量。
在一个实施方案中，本发明提供用于富集存在于含卡泊芬净的混合物中的杂质A的方法，其包括：a)将该混合物置于柱中，并向柱中加入水和乙腈；b)收集含有富集的杂质A的样品；c)任选重复步骤a)和b)；d)用水稀释该富集的样品得到溶液；e)将该溶液加至柱中；f)将含乙酸的乙醇加至柱中；g)收集含富集杂质A的样品；h)任选重复步骤a)和b)。
发明详述
因此，本发明解决了本领域的以下需求：控制在卡泊芬净及其盐中的杂质，尤其是卡泊芬净杂质A，1-((4R，5S)-5-(2-氨乙基氨基)-N2-(10，12-二甲基-1-氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸)-2-L-丝氨酸-5-((3R)-3-羟基-L-鸟氨酸)-肺念定B0及其盐，从而提供无杂质的卡泊芬净及其盐。
对商用剂型Cancidas
Figure BPA00001281327500061
的HPLC分析显示在当前应用中以高于1.0％的水平存在称为杂质A的杂质(如实施例4所表明)。
本发明涉及分离的卡泊芬净杂质A(“杂质A”)，1-((4R，5S)-5-(2-氨乙基氨基)-N2-(10，12-二甲基-1-氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸)-2-L-丝氨酸-5-((3R)-3-羟基-L-鸟氨酸)-肺念定B0。通过HPLC分析测得粗卡泊芬净包含少于约1.0％(HPLC面积)、甚至少于0.6％杂质A，而在使用中压反相柱色谱法(RP-MPLC)纯化后，杂质水平可降至少于约0.3％(HPLC面积)；并且在使用制备型HPLC方法时甚至进一步降至低于检测限。
通过中压反相柱色谱法(RP-MPLC)分离杂质A，NMR和质谱研究显示该杂质为卡泊芬净的“丝氨酸类似物”。
本发明还提供无杂质A的卡泊芬净纯净形式以及用于制备这种纯卡泊芬净的方法。还可根据本领域的已知方法通过进行离子交换转化将根据本发明得到的纯卡泊芬净转化为任何药学上可接受的盐。根据本发明得到的纯卡泊芬净优选为无双乙酸卡泊芬净杂质A的双乙酸卡泊芬净。
本文所用的“分离的”，在提及卡泊芬净杂质A时，对应于从反应混合物中物理上分离的杂质A。反应混合物通常为含卡泊芬净的混合物。例如，可通过自HPLC柱洗脱并进一步干燥杂质A进行分离。
在一个实施方案中，本发明包括分离的卡泊芬净杂质A(“杂质A”)，1-((4R，5S)-5-(2-氨乙基氨基)-N2-(10，12-二甲基-1-氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸)-2-L-丝氨酸-5-((3R)-3-羟基-L-鸟氨酸)-肺念定B0，其具有下式：
Figure BPA00001281327500071
本发明的分离杂质A可通过以下一种或多种表征：在约0.81、0.82、0.83、1.46、1.75、1.84、3.57、3.77、3.90、3.92、4.11、4.17、4.27、4.40、6.66、6.98ppm具有氢化学位移的1HNMR谱；在约11.00、19.64、20.18、23.84、25.29、29.19、29.50、31.05、33.38、34.65、35.02、37.38、45.60、49.56、54.25、54.55、55.37、61.06、61.68、62.65、68.51、68.70、69.26、69.76、73.13、73.22、75.97、114.69、128.09、132.28、156.59、166.61、169.39、170.63、170.71、171.19、173.68、174.75ppm具有碳化学位移的13CNMR谱；在约m/z＝540.319([M+2H]2+)、1079.630([M+H]+)具有峰的MS(ESI+)谱；在HPLC分析(例如下文描述的HPLC分析)中，保留时间为约18分钟；以及相对保留时间为约0.95。
在一个实施方案中，本发明包括含有少于约1.0％(HPCL面积)杂质A的纯卡泊芬净。优选所述纯卡泊芬净含有少于约0.6％、更优选少于约0.05％(HPCL面积)的杂质A。
在另一个实施方案中，本发明包括使用反相色谱法纯化卡泊芬净的方法。
优选根据上述方法得到的卡泊芬净包含少于约1.0％(HPCL面积)的杂质A。优选所述纯卡泊芬净含有少于约0.6％、更优选少于约0.3％(HPCL面积)的杂质A。
用于上述方法中的反相色谱法可采用中压反相柱(RP-MPLC)或高压反相柱(RP-HPLC)。优选所述柱为RP-MPLC。
所述卡泊芬净优选用与水不混溶的有机溶剂和水的混合物洗脱。所述与水不混溶的有机溶剂优选为乙腈或C1-C4醇。更优选其为乙腈。与水不混溶的溶剂和水之间的体积比优选为约10∶90-约40∶60(v/v)的溶剂∶水。优选比值为约20∶80(v/v)的溶剂∶水。优选将乙酸加入洗脱混合物中。
在又一实施方案中，本发明包括使用装载有反相树脂的制备型HPLC纯化卡泊芬净的方法。
优选根据上述方法得到的卡泊芬净包含少于约0.3％(HPCL面积)的杂质A。优选所述纯卡泊芬净含有少于约0.1％、更优选少于约0.05％(HPCL面积)的杂质A。
用于上述方法的反相树脂优选为RP C-18或RP C-8树脂。更优选其为RP C-18树脂。
所述卡泊芬净优选用水性缓冲溶液和有机缓冲溶液纯化。优选所述水性缓冲溶液包含乙酸，而有机缓冲溶液为乙腈。
使用冻干法进一步洗提根据上述方法得到的卡泊芬净。
卡泊芬净原材料可根据现有技术中所述的任何方法(例如描述于WO 97/47645、US5936062中的方法)或根据本申请实施例1得到。
杂质A可用作卡泊芬净及其盐的参比标记。由此，可将其用于检测杂质A在卡泊芬净及其盐样品中的存在情况。
在另一个实施方案中，本发明还提供杂质A作为参比标记以分析卡泊芬净及其盐的纯度的应用。所述方法包括：a)提供包含卡泊芬净及其盐和杂质A的参比样品；b)通过HPLC分析参比样品，并确定杂质A相对于卡泊芬净及其盐的相对保留时间；c)通过HPLC分析卡泊芬净及其盐的样品，并确定样品内含物相对于卡泊芬净及其盐的相对保留时间；以及d)将步骤c)中计算的相对保留时间与步骤b)中对杂质A计算的相对保留时间进行比较，其中如果任何在步骤c)中计算的相对保留时间与杂质A的相对保留时间基本相同，则杂质A存在于卡泊芬净及其盐的样品中。
杂质A还可用作卡泊芬净及其盐的参比标准。因此，可将其用于定量杂质A在卡泊芬净及其盐的样品中的量。
在又一个实施方案中，本发明还包括使用作为参比标准的杂质A测定杂质A在卡泊芬净及其盐的样品中的量的定量法。所述方法包括：a)通过HPLC测量在含有未知量杂质A的卡泊芬净及其盐的样品中对应于杂质A的峰下面积；b)通过HPLC测量在含有已知量杂质A的参比标准中对应于卡泊芬净及其盐的峰下面积；以及c)通过将步骤a)中计算的面积与步骤b)中计算的面积进行比较，确定在卡泊芬净及其盐的样品中杂质A的量。
优选用于上述方法(杂质A作为参比标准的应用)的HPLC方法包括以下步骤：
(a)将卡泊芬净及其盐的样品与以约1∶1比例的乙腈∶水混合物混合，以得到溶液；
(b)将步骤(a)的溶液注入Synergi Hydro-RP(或类似的)柱；
(c)将缓冲液、乙腈∶水(85∶15)与甲醇∶缓冲液混合物(80∶18)的混合物用作洗脱液，在约20分钟内从柱中洗脱样品，以及
(d)用UV检测器(优选在225nm波长下)测量杂质A在相应样品中的含量。
已根据某些优选实施方案描述了本发明，根据对说明书的考虑，其它实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。通过参考以下实施例进一步阐述本发明，该实施例详细描述了所述组合物的制备以及使用本发明的方法。对本领域技术人员而言显而易见的是，许多对材料和方法两者的修改都可实施，而不会偏离本发明的范围。
实施例
NMR分析：
在Bruker DRX 500仪器(500.13MHZ 1H和125.78MHZ 13C频率)上于300K下在DMSO-d6溶液中获得NMR谱。
质谱分析：
在Bruker micrOTOFQ质谱仪上以正电喷雾模式(positive elecrospray mode)获得质谱。
制备型HPLC法：
柱：DAISO SP-100-15-ODS-P 
Figure BPA00001281327500101
孔径C-18或DAISO SP-120-15-ODS-ap 孔径C-18
洗脱液：A：1％乙酸，2％乙腈于水中
B：乙腈
梯度程序：10分钟内从2％乙腈至15％，然后在50分钟内至21％乙腈
流速：取决于制备柱的大小
注入体积：取决于制备柱的大小
柱温：室温
检测波长：230nm
样品浓度：1％至2％
稀释液：得自反应的水溶液
通过HPLC测定卡泊芬净杂质含量
方法1-
柱：Synergy Hydro-RP 150×4.6mm，4μm
洗脱液：A：缓冲液：0.06M H3PO4 pH＝2.0/cc NH3
        B：乙腈∶水 85∶15混合物
        C：甲醇∶缓冲液 80∶18混合物
梯度表：
  t，分钟   A％   B％   C％
  0   52   29   19
  19   31   29   40
  35   12   48   40
  38   52   48   0
  47   12   88   0
  48   52   29   19
流速：1.0ml/分钟
柱温：25℃
检测波长：225nm
运行时间：54分钟
稀释液：乙腈∶水 50∶50混合物
样品浓度：2000μg/ml
方法2-
柱：Hydrosphere C18，150×4.6mm，3μm
洗脱液：’A’：0.025M H3PO4 pH＝2.0/cc.NH3
        ’B’：乙腈∶(0.025M H3PO4pH＝2.0/cc.NH3)70∶30
        ’C’：甲醇∶(0.025M H3PO4pH＝2.0/cc.NH3)50∶50
梯度洗脱
流速：1.0ml/分钟
注入体积：10μl
柱温：25℃
检测波长：225nm
样品浓度：2000μg/ml
稀释液：(0.025M NH4H2PO4 pH＝6.0/NH3缓冲液)∶乙腈 50∶50
用于分离卡泊芬净及其杂质A的制备型MPLC方法
将300g反相(SP-100-15-ODS-P；Daiso Co.Ltd.)填充至聚乙烯涂覆的中压玻璃柱(36×460mm，
Figure BPA00001281327500121
)。封闭该柱，然后用甲醇-水(95∶5v/v)的混合物以约14ml/分钟的速度顺流冲洗吸附剂。
在实施例中所述的色谱分离前，将溶剂混合物换成乙腈-水(20∶80v/v)。
在实施例中所述的色谱分离后，将柱用甲醇-水(95∶5w/v)的混合物冲洗，该混合物用于进行再生并完全去除残留在柱上的任何物质。
将
Figure BPA00001281327500122
Pump Module C-610(P max.：10巴)和
Figure BPA00001281327500123
Fraction收集器B-684用于泵送洗脱液和流分收集。
卡泊芬净杂质A的化学结构根据上述方法通过13C-和1H-NMR光谱和质谱测定。结果在以下表1和质谱图1中呈现：
表1 13C和1H化学位移
  化学位移   分配   多样性
Figure BPA00001281327500131
Figure BPA00001281327500141
*缩写：DiOHTyr(3，4-二羟基高酪氨酸)、DiAVA(α，δ-二氨基-β-羟基戊酸)、βOHPro(3-羟基-脯氨酸)、γOHPro(4-羟基-脯氨酸)、Ser(丝氨酸)、TriAVA(α，δ-二氨基-δ(β-氨乙基-氨基)-γ-羟基戊酸)、DMM(10，12-二甲基肉豆蔻酸(Dimethylmyristate))
#，$，&，β分配可相互交换
图1：
Figure BPA00001281327500142
实施例1：
具有受控含量卡泊芬净杂质A的卡泊芬净的制备
按照以下实施例，将通过硅胶柱色谱法纯化的肺念定B0的一种样品转化为卡泊芬净：
实施例1A：
4-甲氧基苯硫基-肺念定B0 的制备
在配有温度计、氮气进口和机械搅拌器的夹套反应器中，将肺念定B0(25.2g)(测定：89.3％；HPLC纯度：91.0A％)混悬于乙腈(630ml)中。
借助于恒温器将该混合物冷却至-15℃，然后将4-甲氧基苯硫酚(5.88g)一次性加入。于约20分钟内滴加三氟乙酸(117.9g)，使温度保持在-10至-15℃之间。
将该混合物于-15℃搅拌22h，然后通过在约60分钟内于低于0℃的温度下加入水(1260ml)淬灭。在约0℃下搅拌该混合物1h，随后收集沉淀的固体，用乙腈-水(1∶3v/v)洗涤两次(140和140ml)，再用乙腈洗涤两次(105和70ml)，在低于40℃下真空干燥24h后得到HPLC纯度为78.8A％而测定为72.2％的产物23.97g(85.2％)。
实施例1B：
4-甲氧基苯硫基-肺念定B0 胺的制备
将4-甲氧基苯硫基-肺念定B0(14.0g)混悬于四氢呋喃(500ml)中，然后加入苯基硼酸(2.31g)，并将该混合物在低于40℃下搅拌成溶液(4h)。
然后将
Figure BPA00001281327500151
的分子筛(50g)加入该混合物中，并在室温下静置约16h以减少含水量(LT 150ppm)。
将分子筛移出，用THF(50ml)洗涤，然后将滤液装载至配有氮气进口、温度计和恒温器的夹套反应器。
将溶液冷却至-5℃，然后在约15分钟内于0至-5℃下加入硼烷合二甲硫醚络合物(3.86g/90％纯/)，在加入后30分钟产生浓稠的凝胶状混合物，将其在约-5℃下搅拌10h。
将反应混合物冷却至-15℃，然后通过在(-10)-(-15)℃下于约15分钟内加入2N盐酸水溶液(8ml)淬灭，得到澄清溶液。
将经淬灭的混合物在冰箱中于约-15℃储藏过夜，然后用水(2200ml)稀释。
使经稀释的溶液过滤通过烧结玻璃滤器，随后以约18ml/分钟的速度装载到295g反相(LiChroprep RP-18，Merck)中压柱(36×460mm)上。用乙腈-水(20∶80v/v；1800ml；18ml/分钟)洗涤柱，然后用乙腈-水(40∶60v/v；约14ml/分钟)洗脱产物。借助于流分收集器以每份200ml收集级分，并通过TLC分析，然后通过HPLC分析显示流分中存在产物。
合并富含的流分(cut)(＞88A％)，用水稀释，随后装载至125g的反相柱(LiChroprep RP-18，Merck)。
借助于重力，用甲醇洗脱产物，收集5×120ml流分，其通过HPLC分析。合并合适的流分，并在低于30℃的温度下于旋转蒸发器上浓缩，然后通过加入乙腈沉淀产物。
将该混合物冷却至2-8℃，收集固体，用乙腈(20ml)洗涤并在室温下于真空烘箱中干燥24h，得到4.82g(35.2％)HPLC纯度为96.8A％而测定为91.9％的产物。
实施例1C：
双乙酸卡泊芬净的制备
在氮气下将4-甲氧基苯硫基-肺念定B0胺(4.34g)加至乙二胺(18.5ml)中，同时搅拌并于15-25℃下冷却。
将该混合物在室温搅拌6h，然后用甲醇(24ml)将其稀释，同时在15-25℃下用冰水冷却。将水(90ml)和乙酸(24ml)的混合物在相同的条件下加入，最后通过加入乙酸(8ml)将混合物的pH调节至6-7。
将中和的混合物用水(310ml)稀释，用甲苯(3×47ml)洗涤并过滤通过G-4烧结玻璃滤器。
根据HPLC分析，该溶液含0.30％的卡泊芬净杂质A。
将该溶液以约14ml/分钟的速度装载至300g反相(SP-100-15-ODS-P；Daiso Co.Ltd.)中压柱(36×460mm)，然后用乙腈-水(20∶80v/v+0.01％乙酸；14ml/分钟)洗脱产物。以每份100ml收集流分并通过TLC分析，然后通过HPLC分析显示流分中存在卡泊芬净。
将含2.54％杂质A的第一份流分储存备用于分离该杂质，合并剩余的富含流分(＞99.0A％对于卡泊芬净(HPLC))并冻干，得到3.19g(71.7％)为棉样白色固体的醋酸卡泊芬净。
根据HPLC分析，产物的卡泊芬净杂质A含量为0.16％。
实施例2：
无卡泊芬净杂质A的双乙酸卡泊芬净的制备
如实施例1C所述通过4-甲氧基苯硫基-肺念定B0胺与乙二胺之间的反应产生粗制品(卡泊芬净溶液)。在氮气下于室温进行反应6h，随后用甲醇稀释反应混合物，同时于15-25℃下用冰水冷却。在相同条件下加入水和乙酸的混合物，最后用水稀释反应溶液并通过加入乙酸中和至pH约4-5。
将溶液装载至制备型HPLC(装有RP C-18树脂或类似物)，然后用含乙酸和乙腈的水性缓冲液纯化。收集纯化的流分(＞99.0％纯；每种杂质＜0.1％，包括杂质A)，并装载至冷冻干燥机，得到含杂质A＜0.05％(通过HPLC分析测定)的双乙酸卡泊芬净最终干粉末。
实施例3：
卡泊芬净杂质A的富集
收集在实施例1C中所述的数次MPLC纯化的富含卡泊芬净杂质A的流分，并用等量水稀释。
将稀释液装载至与实施例1C中所述相同的柱。用乙腈和水的混合物(20∶80，v/v；约14ml/分钟)洗涤柱。借助于流分收集器以每份100ml收集流分，并通过HPLC分析。
在得到富含杂质A的流分(17-19)后，将0.1％的乙酸加至洗脱液中，并继续洗脱以得到富含卡泊芬净的流分。
选出最好的流分，并再处理较不纯的流分，以类似于上述方式进行3次额外的色谱循环。收集含杂质A(＞73％)的富含流分，并用等量的水稀释。
将稀释液装载到与上述相同的柱上，然后用含0.025％乙酸的乙醇(14ml分钟；56ml各流分)洗脱产物。
收集含杂质A的流分(5-9)，浓缩至约20ml，用50ml水稀释，以约1ml/分钟的速度装载至23g反相(SP-100-15-ODS-P；Daiso Co.Ltd.)中压柱(12×230mm)，并用乙腈-水(20∶80v/v+0.1％乙酸；2ml/分钟)洗脱产物。
以每份100ml收集流分，并通过HPLC分析。收集含产物(＞90％)的富含流分并冻干，得到120mg纯度为94.0A％(HPLC)的卡泊芬净杂质A。
实施例4：
Figure BPA00001281327500181
按照以下HPLC法分析Cancidas
Figure BPA00001281327500182
药片，发现其含1.11-1.26％(HPLC面积)的杂质A。
柱：Synergy Hydro-RP 150×4.6mm，4μm
洗脱液：A：缓冲液：0.06M H3PO4 pH＝2.0/cc NH3
        B：乙腈∶水85∶15混合物
        C：甲醇∶缓冲液80∶18混合物
梯度表：
  t，分钟   A％   B％   C％
  0   52   29   19
  19   31   29   40
  35   12   48   40
  38   52   48   0
  47   12   88   0
  48   52   29   19
流速：1.0ml/分钟
柱温：25℃
检测波长：225nm
运行时间：54min
稀释液：乙腈∶水50∶50混合物
样品浓度：2000μg/ml

Claims (34)

1.分离的卡泊芬净杂质A，1-((4R，5S)-5-(2-氨乙基氨基)-N2-(10，12-二甲基-1-氧代十四烷基)-4-羟基-L-鸟氨酸)-2-L-丝氨酸-5-((3R)-3-羟基-L-鸟氨酸)-肺念定Bo，其具有下式：
Figure FPA00001281327400011
2.权利要求1的分离卡泊芬净杂质，其特征在于选自以下的数据：在约0.81、0.82、0.83、1.46、1.75、1.84、3.57、3.77、3.90、3.92、4.11、4.17、4.27、4.40、6.66、6.98ppm具有氢化学位移的1HNMR谱；在约11.00、19.64、20.18、23.84、25.29、29.19、29.50、31.05、33.38、34.65、35.02、37.38、45.60、49.56、54.25、54.55、55.37、61.06、61.68、62.65、68.51、68.70、69.26、69.76、73.13、73.22、75.97、114.69、128.09、132.28、156.59、166.61、169.39、170.63、170.71、171.19、173.68、174.75ppm具有碳化学位移的13CNMR谱；在约m/z＝540.319([M+2H]2+)、1079.630([M+H]+)具有峰的MS(ESI+)谱；在HPLC分析中，保留时间为约18分钟；以及相对保留时间为约0.95。
3.含有少于约1.0％(HPLC面积)的杂质A的纯卡泊芬净。
4.权利要求3的纯卡泊芬净，其含有少于约0.6％的HPLC面积的杂质A。
5.权利要求4或5的纯卡泊芬净，其含有少于约0.05％HPLC面积的杂质A。
6.一种纯化卡泊芬净的方法，所述方法包括使用反相色谱法进行色谱分离。
7.权利要求6的方法，其中所述反相色谱法为中压反相柱(RP-MPLC)或高压反相柱(RP-HPLC)。
8.权利要求6的方法，其中所述反相色谱法为中压反相柱(RP-MPLC)。
9.权利要求6-8的方法，其中所述卡泊芬净用与水不混溶的有机溶剂和水的混合物洗脱。
10.权利要求9的方法，其中所述与水不混溶的有机溶剂选自乙腈和C1-C4醇。
11.权利要求9的方法，其中所述与水不混溶的有机溶剂为乙腈。
12.权利要求9-11的方法，其中与水不混溶的溶剂和水之间的体积比优选为约10∶90-约40∶60(v/v)的溶剂∶水。
13.权利要求9-11的方法，其中与水不混溶的溶剂和水之间的体积比优选为约20∶80(v/v)的溶剂∶水。
14.权利要求11的方法，其中将乙酸加入洗脱混合物中。
15.权利要求13的方法，其中加入约0.025％-约1.0％。
16.权利要求6-15的方法，其中所得到的卡泊芬净包含少于1.0％HPLC面积的杂质A。
17.权利要求6-15的方法，其中所得到的卡泊芬净包含少于0.6％HPLC面积的杂质A。
18.权利要求6-15的方法，其中所得到的卡泊芬净包含少于0.3％HPLC面积的杂质A。
19.一种用于纯化卡泊芬净的方法，所述方法包括进行装载有反相树脂的制备型HPLC。
20.权利要求19的方法，其中使用反相树脂C-18或C-8。
21.权利要求20的方法，其中反相树脂为C-18。
22.权利要求19-21的方法，其中所得到的卡泊芬净包含少于约0.3％HPLC面积的杂质A。
23.权利要求22的方法，其中所得到的卡泊芬净包含少于约0.1％HPLC面积的杂质A。
24.权利要求22的方法，其中所得到的卡泊芬净包含少于约0.05％HPLC面积的杂质A。
25.权利要求19-24的方法，其中所述卡泊芬净用水性缓冲液和有机缓冲液纯化。
26.权利要求25的方法，其中所述水性缓冲液包含乙酸，而所述有机缓冲液为乙腈。
27.一种用于富集存在于含卡泊芬净的混合物中的杂质A的方法，所述方法包括：
a)将所述混合物置于柱中，并向柱中加入水和乙腈；
b)收集含有富集的杂质A的样品；
c)任选重复步骤a)和b)，
d)将所述富集的样品用水稀释而得到溶液；
e)将所述溶液加至柱中；
f)将含乙酸的乙醇加至柱中；
g)收集含富集的杂质A的样品；
h)任选重复步骤a)和b)。
28.一种将作为参比标记的卡泊芬净杂质A用于分析卡泊芬净的纯度的方法，所述方法包括：
a)提供包含卡泊芬净和卡泊芬净杂质A的参比样品；
b)通过HPLC分析参比样品，并确定卡泊芬净杂质A相对于卡泊芬净的相对保留时间；
c)通过HPLC分析卡泊芬净的样品，并确定所述样品的内含物相对于卡泊芬净的相对保留时间；以及
d)将步骤c)中计算的相对保留时间与步骤b)中对卡泊芬净杂质A计算的相对保留时间进行比较，其中如果任何在步骤c)中计算的相对保留时间与卡泊芬净杂质A的相对保留时间基本相同，则卡泊芬净杂质A存在于卡泊芬净的样品中。
29.一种将作为参比标准的卡泊芬净杂质A用于测定卡泊芬净杂质A在卡泊芬净样品中的量的方法，所述方法包括：
a)通过HPLC测量在含有未知量卡泊芬净杂质A的卡泊芬净样品中对应于卡泊芬净杂质A的峰下面积；
b)通过HPLC测量在含有已知量卡泊芬净杂质A的参比标准中对应于卡泊芬净杂质A的峰下面积；以及
c)通过将步骤a)中计算的面积与步骤b)中计算的面积进行比较，确定在卡泊芬净样品中卡泊芬净杂质A的量。
30.一种用于测定卡泊芬净杂质A在卡泊芬净样品中的量的定量法，所述方法包括：
a)通过HPLC测量在含有未知量卡泊芬净杂质A的卡泊芬净样品中对应于卡泊芬净杂质A的峰下面积；
b)通过HPLC测量在含有已知量卡泊芬净的参比标准中对应于卡泊芬净的峰下面积；以及
c)通过将步骤a)中计算的面积与步骤b)中计算的面积进行比较，确定在卡泊芬净样品中卡泊芬净杂质A的量。
31.权利要求30的方法，其中使用的HPLC方法包括以下步骤：
(e)将卡泊芬净及其盐的样品与以约1∶1比例的乙腈∶水混合物混合，而得到溶液；
(f)将步骤(a)的溶液注入Synergi Hydro-RP(或类似的)柱；
(g)将缓冲液、乙腈∶水(85∶15)与甲醇∶缓冲液混合物(80∶18)的混合物用作洗脱液，在约20分钟内从柱中洗脱样品，以及
(h)用UV检测器(优选在225nm波长下)测量杂质A在相应样品中的含量。
32.一种药物组合物，其包含卡泊芬净或其任何药学上可接受的盐以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
33.权利要求32的药物组合物，其中所述药物组合物通过以下方法制备，所述方法包括将权利要求3-5的卡泊芬净或其任何药学上可接受的盐与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。
34.一种治疗方法，所述方法包括将包含权利要求3-5的卡泊芬净或其任何药学上可接受盐的药物组合物给予有需要的哺乳动物，用于治疗由假丝酵母属、曲霉属、组织孢浆菌属、球孢子菌属和芽酵母属引起的全身性真菌感染，以及用于治疗和预防由卡氏肺囊虫引起的感染。
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