KR20110011704A - 카스포펀진 불순물 ａ를 함유하지 않는 카스포펀진 - Google Patents

카스포펀진 불순물 ａ를 함유하지 않는 카스포펀진 Download PDF

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테바 기오기스제르갸르 자르트쾨렌 뮈쾨되 레스즈베니타르사사그
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Abstract

본 발명은 카스포펀진 불순물 A를 함유하지 않는 카스포펀진, 그 제조 방법 및 카스포펀진 불순물 A의 단리 방법을 제공한다.

Description

카스포펀진 불순물 Ａ를 함유하지 않는 카스포펀진{CASPOFUNGIN FREE OF CASPOFUNGIN IMPURITY A}
[상호 참조]
본 발명은 2008년 6월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/133,184호; 2008년 6월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/133,602호; 2009년 4월 30일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/174,289호; 2008년 8월 7일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/188,385호; 및 2008년 12월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 제61/139,873호를 기초로 우선권의 이익을 주장한다. 상기 출원들의 내용은 본원에 참조 인용된다.
[발명의 분야]
본 발명은 카스포펀진 불순물 A를 함유하지 않는 카스포펀진, 그 제조 방법 및 카스포펀진 불순물 A의 단리 방법에 관한 것이다.
하기 화학식:
Figure pct00001
의 카스포펀진, 즉 1-[(4R,5S)-5-[(2-아미노에틸)아미노]-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-하이드록시-L-오르니틴]-5-[(3R)-3-하이드록시-L-오르니틴]-뉴모칸딘 B0은 에키노칸딘류 유래의 거대환 리포펩티드로서, 진균류 세포벽의 필수 성분인 베타(1,3)-D-글루칸의 합성을 억제하는 새로운 부류의 항진균제이다. 에키노칸딘류는 진균류 전신 감염, 특히 칸디다(Candida), 아스퍼질러스(Aspergillus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 콕시디오이데스(Coccidioides) 및 블라스토마이세스(Blastomyces)에 의해 유발되는 감염의 치료에 유용한 것으로 알려져 있다. 에키노칸딘류는 또한 AIDS 환자와 같이 면역손상 환자에서 종종 발견되는 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)에 의해 유발되는 감염의 치료 및 예방에도 유용한 것으로 확인되었다. 카스포펀진은 암포테리신 B 및 트리아졸과 함께 상가적 또는 상승적 항진균 활성을 나타낸다.
카스포펀진은 디아세테이트 염으로서 투여되며 머크 앤 컴퍼니 인코포레이티드(Merck & Co., Inc.)에 의해 상표명 칸시다스(Cancidas)®로 시판된다.
카스포펀진은 하기 화학식:
Figure pct00002
의 뉴모칸딘 B0으로부터 제조될 수 있는 반합성 생성물로서, 이것은 발효 반응 등으로부터 얻어지는 천연 생성물이다. 뉴모칸딘 B0의 제조 방법은 미국 특허 제5,194,377호 및 미국 특허 제5,202,309호 등의 몇몇 공보에 개시되어 있다.
카스포펀진 및 이의 약학적으로 허용되는 염은 INN(International Nonproprietary Names; 국제 일반명) 하에 진균류 감염을 치료하는 데 유용한 것으로 알려져 있다(머크 인덱스 13판, 모노그래프 1899호 참조).
미국 특허 제5,378,804호는 카스포펀진을 개시하고, 미국 특허 제5,552,521호 및 제5,936,062호는 카스포펀진의 제조를 위한 합성법을 개시한다.
임의의 합성 화합물과 마찬가지로 카스포펀진은 외래 화합물 또는 불순물을 함유하고 있을 수 있다.
문헌[The Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 26, 216-211 (2001)]은 뉴모칸딘 B0의 세린 유사체가 혼입된 뉴모칸딘 B0을 카스포펀진의 세린 유사체를 함유하는 카스포펀진으로 전환하는 방법을 기술한다.
뉴모칸딘 B0의 세린 유사체는 WO 2000/08197에서도 개시되었다. 그러나, 카스포펀진 세린 유사체 자체의 단리 또는 특징 분석은 상기에 언급된 공보 중 어느 것에도 개시된 바 없다.
카스포펀진 또는 임의의 약리 활성 성분("API") 중의 불순물은 바람직하지 않고, 극단의 경우에는 API를 함유하는 제형으로 치료되는 환자에게 유해할 수도 있다.
제조 공정에서 생산된 API의 순도는 상업화에 있어서 중요하다. 미국 식품의약국("FDA")은 공정 불순물을 설정 한계 이하로 유지할 것을 요구한다. 예를 들어, API 제조업자를 위한 FDA의 ICH Q7A 지침에서 FDA는 결정화, 증류 및 액체-액체 추출과 같은 정제 단계를 비롯하여 온도, 압력, 시간 및 화학량론비 등의 허용 가능한 공정 조건뿐만 아니라 사용될 수 있는 원료의 품질도 명시한다[ICH Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients, Q7A, Current Step 4 Version (2000년 11월 10일) 참조].
화학 반응의 생성물이 제약 표준에 부합할 수 있을 정도의 충분한 순도를 갖는 단일 화합물인 경우는 거의 없다. 대부분의 경우 반응의 부생성물 및 부산물과 반응에서 사용되는 부가 반응물이 생성물 중에도 존재할 수 있다. API의 가공 과정의 특정 단계에서, API는, 후속 가공에 적합한지, 궁극적으로 약학 제품에 사용하기에 적합한지를 결정하기 위해, 일반적으로 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC") 또는 박막 크로마토그래피("TLC")에 의해 순도가 분석되어야 한다. FDA는, API가 가능한 한 불순물을 함유하지 않음으로써 임상 사용에 가능한 한 안전할 것을 요구한다. 예를 들어, FDA는 일부 불순물의 양을 0.1% 미만으로 제한할 것을 권고한다[ICH Good Manufacturing Practice Guide for Active Pharmaceutical Ingredients, Q7A, Current Step 4 Version (2000년 11월 10일) 참조].
일반적으로, 부산물, 부생성물 및 부가 반응물(총칭하여 "불순물")은 분광학적 방법 및/또는 다른 물리적 방법에 의해 확인되고, 그 후 크로마토그램 등에서의 피크 위치 또는 TLC 플레이트에서의 스팟과 연관시켜진다(문헌[Strobel, H.A., et al., CHEMICAL INSTRUMENTATION: A SYSTEMATIC APPROACH, 953, 3d ed. (Wiley & Sons, New York 1989)] 참조). 특정 불순물이 피크 위치와 연관시켜지면, 그 불순물은 크로마토그램에서의 그 상대 위치에 의해 샘플에서 확인될 수 있으며, 이때 크로마토그램에서의 위치는 컬럼으로의 샘플의 주입과 검출기를 통과하는 불순물의 용리 사이의 시간(min)으로서 측정된다. 크로마토그램에서의 상대 위치를 "체류 시간"이라고 한다.
당업자가 알고 있는 바와 같이, 공정 불순물의 처리는 그 화학 구조 및 합성 경로를 이해하고 최종 생성물 중의 불순물의 양에 영향을 미치는 파라미터를 확인하는 것에 의해 크게 향상된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기 화학식:
Figure pct00003
으로 표시되는 단리된 카스포펀진 불순물 A("불순물 A"), 즉 1-((4R,5S)-5-(2-아미노에틸아미노)-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-하이드록시-L-오르니틴)-2-L-세린-5-((3R)-3-하이드록시-L-오르니틴)-뉴모칸딘 B0을 포함한다.
본 발명의 단리된 불순물 A는 약 0.81, 0.82, 0.83, 1.46, 1.75, 1.84, 3.57, 3.77, 3.90, 3.92, 4.11, 4.17, 4.27, 4.40, 6.66, 6.98 ppm에서 수소 화학 이동을 갖는 1H NMR 스펙트럼; 약 11.00, 19.64, 20.18, 23.84, 25.29, 29.19, 29.50, 31.05, 33.38, 34.65, 35.02, 37.38, 45.60, 49.56, 54.25, 54.55, 55.37, 61.06, 61.68, 62.65, 68.51, 68.70, 69.26, 69.76, 73.13, 73.22, 75.97, 114.69, 128.09, 132.28, 156.59, 166.61, 169.39, 170.63, 170.71, 171.19, 173.68, 174.75 ppm에서 탄소 화학 이동을 갖는 13C NMR 스펙트럼; 약 m/z=540.319([M+2H]2+), 1079.630([M+H]+)에서 피크를 갖는 MS(ESI+) 스펙트럼; 본원에서 후술하는 것과 같은 HPLC 분석에서의 약 18분의 체류 시간; 및 약 0.95의 상대 체류 시간 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 HPLC에 의하면 약 1.0 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 순수한 카스포펀진을 포함한다. 바람직하게는, 순수한 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 0.6 면적% 미만, 더 바람직하게는 약 0.05 면적% 미만의 불순물 A를 함유한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 역상 크로마토그래피를 이용하여 카스포펀진을 정제하는 방법을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 역상 수지가 로딩된 분취용 HPLC를 이용하여 카스포펀진을 정제하는 방법을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 카스포펀진 및 그 염의 순도를 분석하기 위해 참조 마커로서 불순물 A를 사용하는 용도를 추가로 제공한다. 이 방법은 a) 카스포펀진 및 그 염과 불순물 A를 포함하는 참조 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 참조 샘플을 HPLC로 분석하여, 카스포펀진 및 그 염과 비교한 불순물 A의 상대 체류 시간을 측정하는 단계; c) 카스포펀진 및 그 염의 샘플을 HPLC로 분석하여, 카스포펀진 및 그 염과 비교한 샘플 내용물의 상대 체류 시간을 측정하는 단계; d) 단계 c)에서 계산된 상대 체류 시간을 불순물 A에 대해 단계 b)에서 계산된 상대 체류 시간과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 c)에서 계산된 상대 체류 시간 중 어느 것이 불순물 A의 상대 체류 시간과 실질적으로 동일할 경우, 불순물 A가 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중에 존재하는 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 불순물 A를 참조 표준으로서 사용하여 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A의 양을 측정하는 정량 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 a) 미지량의 불순물 A를 함유하는 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계; b) 기지량의 불순물 A를 함유하는 참조 표준 중의 카스포펀진 및 그 염에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계; 및 c) 단계 a)에서 계산된 면적을 단계 b)에서 계산된 면적과 비교함으로써 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 카스포펀진을 갖는 혼합물에서 불순물 A의 존재를 농축시키는 방법으로서, a) 상기 혼합물을 컬럼에 주입하고 이 컬럼에 물과 아세토니트릴을 첨가하는 단계; b) 불순물 A가 농축된 샘플을 수집하는 단계; 경우에 따라 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계; d) 농축된 샘플을 물로 희석하여 용액을 얻는 단계; e) 상기 용액을 상기 컬럼에 첨가하는 단계; f) 아세트산 함유 에탄올을 상기 컬럼에 첨가하는 단계; g) 불순물 A가 농축된 샘플을 수집하는 단계; h) 경우에 따라 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 카스포펀진 및 그 염 중의 불순물, 특히 카스포펀진 불순물 A, 즉 1-((4R,5S)-5-(2-아미노에틸아미노)-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-하이드록시-L-오르니틴)-2-L-세린-5-((3R)-3-하이드록시-L-오르니틴)-뉴모칸딘 B0 및 그 염을 처리함으로써 불순물을 함유하지 않는 카스포펀진 및 그 염을 제공하고자 하는 당업계의 요구에 대처하는 것이다.
시판되는 제형 칸시다스®의 HPLC 분석에 의하면, 본 출원에서 불순물 A라 지칭되는 불순물이 1.0%를 초과하는 수준으로 존재함이 확인된다(실시예 4에서 임증됨).
본 발명은 단리된 카스포펀진 불순물 A("불순물 A"), 즉 1-((4R,5S)-5-(2-아미노에틸아미노)-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-하이드록시-L-오르니틴)-2-L-세린-5-((3R)-3-하이드록시-L-오르니틴)-뉴모칸딘 B0에 관한 것이다. HPLC 분석에 의해, 미정제 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 1.0 면적% 미만, 심지어 0.6 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것으로 측정되었으며, 중압 역상 컬럼 크로마토그래피(RP-MPLC)를 이용한 정제 후, 분취용 HPLC법을 이용하여 측정 시, 불순물 수준이 HPLC에 의하면 약 0.3 면적% 미만으로, 나아가 검출 한계 이하로 감소될 수 있다.
중압 역상 컬럼 크로마토그래피(RP-MPLC), NMR 및 질량 분광분석 조사에 의해 불순물 A를 단리한 바에 의하면 이 불순물은 카스포펀진의 "세린 유사체"인 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 또한 불순물 A를 함유하지 않는 카스포펀진의 순수한 형태 및 이같은 순수한 카스포펀진을 제조하기 위한 수단을 제공한다. 본 발명에 따라 얻은 순수한 카스포펀진은 당업계에 공지된 방법에 따라 이온 교환 전환을 수행함으로써 임의의 약학적으로 허용되는 염으로 추가로 전환시킬 수 있다. 본 발명에 따라 얻은 순수한 카스포펀진은 바람직하게는 카스포펀진 불순물 A 디아세테이트를 함유하지 않는 카스포펀진 디아세테이트이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 카스포펀진 불순물 A와 관련하여 "단리된"이란 불순물 A가 반응 혼합물로부터 물리적으로 분리되어 있음을 의미한다. 반응 혼합물은 일반적으로 카스포펀진을 함유하고 있는 것이다. 예를 들어, 분리는 HPLC 컬럼으로부터의 용리와 불순물 A의 추가 건조에 의해 수행할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기 화학식:
Figure pct00004
으로 표시되는 단리된 카스포펀진 불순물 A("불순물 A"), 즉 1-((4R,5S)-5-(2-아미노에틸아미노]-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-하이드록시-L-오르니틴)-2-L-세린-5-((3R)-3-하이드록시-L-오르니틴)-뉴모칸딘 B0을 포함한다.
본 발명의 단리된 불순물 A는 약 0.81, 0.82, 0.83, 1.46, 1.75, 1.84, 3.57, 3.77, 3.90, 3.92, 4.11, 4.17, 4.27, 4.40, 6.66, 6.98 ppm에서 수소 화학 이동을 갖는 1H NMR 스펙트럼; 약 11.00, 19.64, 20.18, 23.84, 25.29, 29.19, 29.50, 31.05, 33.38, 34.65, 35.02, 37.38, 45.60, 49.56, 54.25, 54.55, 55.37, 61.06, 61.68, 62.65, 68.51, 68.70, 69.26, 69.76, 73.13, 73.22, 75.97, 114.69, 128.09, 132.28, 156.59, 166.61, 169.39, 170.63, 170.71, 171.19, 173.68, 174.75 ppm에서 탄소 화학 이동을 갖는 13C NMR 스펙트럼; 약 m/z=540.319([M+2H]2+), 1079.630([M+H]+)에서 피크를 갖는 MS(ESI+) 스펙트럼; 본원에서 후술하는 것과 같은 HPLC 분석에서의 약 18분의 체류 시간; 및 약 0.95의 상대 체류 시간 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 HPLC에 의하면 약 1.0 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 순수한 카스포펀진을 포함한다. 바람직하게는, 순수한 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 0.6 면적% 미만, 더 바람직하게는 약 0.05 면적% 미만의 불순물 A를 함유한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 역상 크로마토그래피를 이용하여 카스포펀진을 정제하는 방법을 포함한다.
바람직하게는, 상기에 기재된 방법에 따라 얻은 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 1.0 면적% 미만의 불순물 A를 함유한다. 바람직하게는, 순수한 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 0.6 면적% 미만, 더 바람직하게는 약 0.3 면적% 미만의 불순물 A를 함유한다.
상기에 기재된 방법에 사용되는 역상 크로마토그래피는 중압 역상 컬럼(RP-MPLC) 또는 고압 역상 컬럼(RP-HPLC)을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 컬럼은 RP-MPLC이다.
카스포펀진은 바람직하게는 수비혼화성 유기 용매와 물의 혼합물로 용리시킨다. 상기 수비혼화성 유기 용매는 바람직하게는 아세토니트릴 또는 C1-C4 알코올이다. 더 바람직하게는, 상기 용매는 아세토니트릴이다. 수비혼화성 용매와 물의 부피비는 바람직하게는 약 10:90∼약 40:60(v/v)의 용매:물이다. 바람직하게는, 이 비는 약 20:80(v/v)의 용매:물이다. 바람직하게는, 용리 혼합물에 아세트산을 첨가한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 역상 수지가 로딩된 분취용 HPLC를 이용하여 카스포펀진을 정제하는 방법을 포함한다.
바람직하게는, 상기에 기재된 방법에 따라 얻은 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 0.3 면적% 미만의 불순물 A를 함유한다. 바람직하게는, 순수한 카스포펀진은 HPLC에 의하면 약 0.1 면적% 미만, 더 바람직하게는 약 0.05 면적% 미만의 불순물 A를 함유한다.
상기에 기재된 방법에 사용되는 역상 수지는 바람직하게는 RP C-18 또는 RP C-8 수지이다. 더 바람직하게는, 이것은 RP C-18 수지이다.
카스포펀진은 바람직하게는 수성 완충액 및 유기 완충액으로 정제한다. 바람직하게는, 수성 완충액은 아세트산을 포함하고, 유기 완충액은 아세토니트릴이다.
상기 방법에 따라 얻은 카스포펀진은 동결건조를 이용하여 추가로 용리시킨다.
카스포펀진 출발 물질은 WO 97/47645, US 5936062에 기재된 방법과 같은 선행 기술에 기재된 임의의 방법에 따라 또는 본 출원의 실시예 1에 따라 얻을 수 있다.
불순물 A는 카스포펀진 및 그 염에 대한 참조 마커로서 유용하다. 따라서, 불순물 A는 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 카스포펀진 및 그 염의 순도를 분석하기 위해 참조 마커로서 불순물 A를 사용하는 용도를 추가로 제공한다. 이 방법은 a) 카스포펀진 및 그 염과 불순물 A를 포함하는 참조 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 참조 샘플을 HPLC로 분석하여, 카스포펀진 및 그 염과 비교한 불순물 A의 상대 체류 시간을 측정하는 단계; c) 카스포펀진 및 그 염의 샘플을 HPLC로 분석하여, 카스포펀진 및 그 염과 비교한 샘플 내용물의 상대 체류 시간을 측정하는 단계; 및 d) 단계 c)에서 계산된 상대 체류 시간을 불순물 A에 대해 단계 b)에서 계산된 상대 체류 시간과 비교하는 단계를 포함하며, 여기서 단계 c)에서 계산된 상대 체류 시간 중 어느 것이 불순물 A의 상대 체류 시간과 실질적으로 동일할 경우, 불순물 A가 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중에 존재하는 것이다.
불순물 A는 또한 카스포펀진 및 그 염에 대한 참조 표준으로서 유용하다. 따라서, 불순물 A는 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A의 양을 정량하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 불순물 A를 참조 표준으로서 사용하여 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A의 양을 측정하는 정량 방법을 추가로 포함한다. 이 방법은 a) 미지량의 불순물 A를 함유하는 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계; b) 기지량의 불순물 A를 함유하는 참조 표준 중의 카스포펀진 및 그 염에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계; 및 c) 단계 a)에서 계산된 면적을 단계 b)에서 계산된 면적과 비교함으로써 카스포펀진 및 그 염의 샘플 중의 불순물 A의 양을 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, (참조 표준으로서 불순물 A를 사용하기 위해) 상기 방법에 사용되는 HPLC법은
(a) 카스포펀진 및 그 염의 샘플을 약 1:1의 비의 아세토니트릴:물의 혼합물과 혼합하여 용액을 얻는 단계;
(b) 단계 (a)의 용액을 시너지 하이드로-RP(Synergi Hydro-RP)(또는 유사한) 컬럼에 주입하는 단계;
(c) 약 20분째 용리제로서 완충액 혼합물, 아세토니트릴:물(85:15) 및 메탄올:완충액 혼합물(80:18)을 사용하여 컬럼으로부터 샘플을 용리시키는 단계; 및
(d) (바람직하게는 225 nm 파장에서) UV 검출기를 사용하여 해당 샘플 중의 불순물 A의 함량을 측정하는 단계
를 포함한다.
지금까지 바람직한 특정 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나, 명세서를 참조할 때 당업자에게는 다른 실시형태도 명백할 것이다. 본 발명은 본 발명의 조성물의 제조 및 사용 방법을 상세히 설명하는 하기 실시예와 관련하여 추가로 정의된다. 당업자에게는 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 재료 및 방법 둘 다에 대한 다수의 변경이 이루어질 수 있다는 것이 명백할 것이다.
[실시예]
NMR 분석:
300 K에서 DMSO-d6 용액 중에서 브루커(Bruker) DRX 500 장치(500.13 MHZ 1H 및 125.78 MHZ 13C 주파수)로 NMR 스펙트럼을 측정하였다.
질량 분광분석:
양성 전기분무 모드로 브루커 micrOTOFQ 질량 분광광도계로 질량 스펙트럼을 측정하였다.
분취용 HPLC법:
컬럼: DAISO SP-100-15-ODS-P 100 Å 공극 크기 C-18 또는 DAISO SP-120-15-ODS-ap 120 Å 공극 크기 C-18
용리제: A: 1% 아세트산, 2% 아세토니트릴 수용액
B: 아세토니트릴
구배 프로그램: 2% 아세토니트릴에서 10분 후 15% 아세토니트릴로, 50분 후 21% 아세토니트릴로.
유속: 분취용 컬럼의 크기에 따라 다름
주입 용량: 분취용 컬럼의 크기에 따라 다름
컬럼 온도: 실온
검출 파장: 230 nm
샘플 농도: 1%∼2%
희석제: 반응으로부터 얻은 수용액
HPLC에 의한 카스포펀진의 불순물 함량 측정
방법 1
컬럼: 시너지 하이드로-RP 150×4.6 mm, 4 ㎛
용리제: A: 완충액: 0.06 M H3PO4, pH=2.0/cc NH3
B: 아세토니트릴:물의 85:15 혼합물
C: 메탄올:완충액의 80:18 혼합물
구배표:
Figure pct00005
유속: 1.0 ml/min
컬럼 온도: 25℃
검출 파장: 225 nm
러닝 타임: 54 min
희석제: 아세토니트릴:물의 50:50 혼합물
샘플 농도: 2,000 ㎍/ml
방법 2
컬럼: 하이드로스피어(Hydrosphere) C18, 150×4.6 mm, 3 ㎛
용리제: 'A': 0.025 M H3PO4, pH=2.0/cc.NH3
'B': 아세토니트릴:(0.025 M H3PO4, pH=2.0/cc.NH3) 70:30
'C': 메탄올:(0.025 M H3PO4, pH=2.0/cc.NH3) 50:50
구배 용리
유속: 1.0 ml/min
주입 용량: 10 ㎕
컬럼 온도: 25℃
검출 파장: 225 nm
샘플 농도: 2,000 ㎍/ml
희석제: (0.025 M NH4H2PO4, pH=6.0/NH3 완충액):아세토니트릴 50:50
카스포펀진 및 그 불순물 A의 단리에 사용되는 분취용 MPLC법
300 g의 역상 수지(SP-100-15-ODS-P; Daiso Co. Ltd.)를 폴리에틸렌 코팅 중압 유리 컬럼(36×460 mm, BUECHI)에 충전하였다. 이 컬럼을 닫고 약 14 ml/min의 속도로 메탄올-물(95:5 v/v) 혼합물을 하류로 흘려 보냈다.
실시예에 기재된 크로마토그래피 분리 전에, 용매 혼합물을 아세토니트릴-물(20:80 v/v)로 변경하였다.
실시예에 기재된 크로마토그래피 분리 후, 정화를 위해, 또 컬럼 위에 잔류한 임의의 물질을 완전히 제거하기 위해 컬럼을 메탄올-물(95:5 w/v) 혼합물로 세척하였다.
용리제 펌핑과 분획 수집에 BUECHI 펌프 모듈 C-610(Pmax.: 10바) 및 BUECHI 분획 수집기 B-684를 사용하였다.
상기에 기재된 방법에 따라 13C-NMR 및 1H-NMR 분광분석법 및 질량 분광분석법에 의해 카스포펀진 불순물 A의 화학 구조를 결정하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 질량 분광분석도 1에 나타내었다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
도 1:
Figure pct00009
실시예 1:
카스포펀진 불순물 A의 함량이 제어된 카스포펀진의 제조
실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된 뉴모칸딘 B0의 샘플 하나를 하기 실시예에 따라 카스포펀진으로 전환하였다:
실시예 1A:
4-메톡시페닐티오-뉴모칸딘 B 0 의 제조
뉴모칸딘 B0(25.2 g)(분석치: 89.3%; HPLC 순도: 91.0 A%)을 온도계, 질소 유입구 및 기계 교반기가 장착된 재킷 반응기 중의 아세토니트릴(630 ml)에 현탁시켰다.
이 혼합물을 자동 온도 조절 장치를 사용하여 -15℃로 냉각시키고, 4-메톡시티오페놀(5.88 g)을 한 번에 첨가하였다. 온도를 -10℃∼15℃로 유지하면서 약 20분 동안 트리플루오로아세트산(117.9 g)을 적가하였다. 이 혼합물을 -15℃에서 22시간 동안 교반하고, 0℃ 이하의 온도에서 약 60분 동안 물(1,260 ml)을 첨가하여 켄칭하였다. 이 혼합물을 약 0℃에서 1 시간 동안 교반한 후 침전된 고체를 수집하여 아세토니트릴-물(1:3 v/v)(140 ml 및 140 ml)로 2회 세척하고 아세토니트릴(105 ml 및 70 ml)로 2회 세척하여 진공 하에 40℃ 미만의 온도에서 24 시간 동안 건조시킨 후 생성물 23.97 g(85.2%)을 얻었으며, 이것은 HPLC 순도가 78.8 A%, 분석치가 72.2%였다.
실시예 1B:
4-메톡시페닐티오-뉴모칸딘 B 0 아민의 제조
4-메톡시페닐티오-뉴모칸딘 B0(14.0 g)을 테트라하이드로푸란(500 ml)에 현탁시킨 후 페닐보론산(2.31 g)을 첨가하고, 이 혼합물을 용액이 형성될 때까지 40℃ 미만에서 교반하였다(4 시간).
그 후, 3 Å의 분자체(50 g)를 혼합물에 첨가하여 실온에서 약 16시간 동안 정치시켜 함수량을 감소시켰다(LT 150 ppm).
분자체를 제거하고 THF(50 ml)로 세척하고 여액을 질소 유입구, 온도계 및 자동 온도 조절 장치가 장착된 재킷 반응기에 충전하였다. 용액을 -5℃까지 냉각시키고, 보란-디메틸설파이드 복합체(3.86 g/순도 90%)를 0℃∼-5℃에서 약 15분 동안 첨가하였으며, 첨가 후 30분 내에 조밀한 젤라틴성 혼합물이 얻어졌고, 이것을 약 -5℃에서 10시간 동안 교반하였다.
반응 혼합물을 -15℃까지 냉각시키고, 약 15분 동안 -10℃∼-15℃에서 2 N 염산 수용액(8 ml)을 첨가해서 켄칭하여 투명한 용액을 얻었다.
켄칭된 혼합물을 약 -15℃의 냉동고에 넣어 밤새 저장하였으며, 그 후 물물(2,200 ml)로 희석하였다.
희석된 용액을 소결 유리 필터를 통해 여과하여 295 g 역상(LiChroprep RP- 18, Merck) 중압 컬럼(36×460 mm)에 약 18 ml/min의 속도로 충전하였다. 이 컬럼을 아세토니트릴-물(20:80 v/v; 1,800 ml; 18 ml/min)로 세척하고, 생성물을 아세토니트릴-물(40:60 v/v; 약 14 ml/min)로 용리시켰다. 분획 수집기를 사용하여 각각 200 ml의 분획을 수집하여 TLC로 분석한 후, 생성물의 존재를 보이는 분획을 HPLC로 분석하였다.
농후한 분획(88 A% 초과)을 합하여 물로 희석하고 125 g 역상 컬럼(LiChroprep RP-18, Merck)에 충전하였다.
생성물을 중력에 의해 메탄올로 용리시키고 5×120 ml 분획을 수집하여 이것을 HPLC로 분석하였다. 적절한 분획을 합해서 회전식 증발기에서 30℃ 미만의 온도로 농축시키고, 아세토니트릴을 첨가하여 생성물을 침전시켰다.
혼합물을 2∼8℃로 냉각시키고, 고체를 수집하여, 아세토니트릴(20 ml)로 세척하고, 실온의 진공 오븐에서 24시간 동안 건조시켜 HPLC 순도 96.8%, 분석치 91.9%의 생성물 4.82 g(35.2%)을 얻었다.
실시예 1C:
카스포펀진 디아세테이트의 제조
15∼25℃에서 교반 및 냉각시키면서 질소 하에 4-메톡시페닐티오-뉴모칸딘 B0 아민(4.34 g)을 에틸렌디아민(18.5 ml)에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 이것을 15∼25℃에서 빙수로 냉각시키면서 메탄올(24 ml)로 희석하였다. 동일 조건에서 물(90 ml)과 아세트산(24 ml)의 혼합물을 첨가하고, 마지막으로 아세트산(8 ml)을 첨가하여 혼합물의 pH를 6∼7로 조절하였다.
중화된 혼합물을 물(310 ml)로 희석하고, 톨루엔(3×47 ml)으로 세척하고, G-4 소결 유리 필터를 통해 여과하였다.
HPLC 분석에 기초할 때 이 용액은 0.30%의 카스포펀진 불순물 A를 함유하였다.
이 용액을 300 g 역상(SP-100-15-ODS-P; Daiso Co. Ltd.) 중압 컬럼(36×460 mm)에 약 14 ml/min의 속도로 충전하고, 생성물을 아세토니트릴-물(20:80 v/v + 0.01% 아세트산; 14 ml/min)로 용리시켰다. 각각 100 ml의 분획을 수집하여 TLC로 분석한 후, 카스포펀진의 존재를 보이는 분획을 HPLC로 분석하였다.
2.54%의 불순물 A를 함유한 제1 분획을 불순물 단리를 위해 따로 보관하고, 나머지 농후 분획(카스포펀진에 대해 99.0 A% 초과(HPLC))을 합해서 동결건조시켜 3.19 g(71.7%)의 카스포펀진 아세테이트를 솜과 같은 백색 고체로서 얻었다.
HPLC 분석에 기초할 때 이 생성물의 카스포펀진 불순물 A 함량은 0.16%였다.
실시예 2:
카스포펀진 불순물 A를 함유하지 않는 카스포펀진 디아세테이트의 제조
실시예 1C에 기재된 바와 같이 4-메톡시페닐티오-뉴모칸딘 B0 아민과 에틸렌디아민 간의 반응을 통해 미정제 생성물(카스포펀진 용액)을 제조하였다. 반응은 실온에서 질소 하에 6시간 동안 수행하였으며, 그 후 반응 혼합물을 빙수로 15∼25℃로 냉각시키면서 메탄올로 희석하였다. 동일 조건 하에 물과 아세트산의 혼합물을 첨가하고, 마지막으로 반응 혼합물을 물로 희석하고 아세트산을 첨가하여 혼합물의 pH를 약 4∼5로 중화시켰다.
이 용액을 분취용 HPLC(RP C-18 수지 또는 유사한 수지가 로딩됨)에 로딩하고, 아세트산 및 아세토니트릴을 함유하는 수성 완충액을 사용하여 정제하였다. 정제된 분획(순도 99.0% 초과; 각각 0.1% 미만의 불순물 A를 함유함)을 수집해서 동결건조기에 로딩하여, HPLC 분석으로 측정 시 0.05% 미만의 불순물 A를 함유하는 카스포펀진 디아세테이트의 최종 건조 분말을 얻었다.
실시예 3:
카스포펀진 불순물 A의 농축
카스포펀진 불순물 A가 농축된 실시예 1C에 기재된 몇 개의 MPLC 정제 분획을 수집해서 동량의 물로 희석하였다. 희석된 용액을 실시예 1C에 기재된 것과 동일한 컬럼에 충전하였다. 이 컬럼을 아세토니트릴과 물의 혼합물(20:80, v/v; 약 14 ml/min)로 세척하였다. 분획 수집기를 사용하여 각각 100 ml의 분획을 수집하여 HPLC로 분석하였다.
불순물 A(17∼19)가 농후한 분획을 얻은 후, 용리제에 0.1% 아세트산을 첨가해서 계속 용리하여 카스포펀진이 농후한 분획을 얻었다.
최상의 분획을 선택하여 순도가 떨어지는 것을 재처리하고, 상기에 기재된 것과 유사한 방식으로 크로마토그래피를 3회 더 수행하였다. 불순물 A(73% 초과)를 함유하는 농후 분획을 수집하여 동량의 물로 희석하였다.
희석된 용액을 상기에 기재된 것과 동일한 컬럼에 충전하고, 생성물을 0.025% 아세트산 함유 에탄올로 용리시켰다(14 ml/min; 각각 56 ml 분획).
불순물 A를 함유하는 분획(5∼9)을 수집하여 약 20 ml로 농축시키고 50 ml의 물로 희석한 후 23 g 역상(SP-100-15-ODS-P; Daiso Co. Ltd.) 중압 컬럼(12×230 mm)에 약 1 ml/min의 속도로 충전하였으며, 생성물을 아세토니트릴-물(20:80 v/v + 0.1% 아세트산; 2 ml/min)로 용리시켰다.
각각 100 ml의 분획을 수집하여 HPLC로 분석하였다. 생성물(90% 초과)을 함유하는 농후 분획을 수집하여 동결건조시켜 순도 94.0 A%(HPLC)의 카스포펀진 불순물 A 120 mg을 얻었다.
실시예 4:
칸시다스 ® 동결건조 분말의 분석:
칸시다스® 정제를 하기 HPLC법에 따라 분석하였으며, HPLC에 의하면 1.11∼1.26 면적%의 불순물 A를 함유하는 것으로 확인되었다.
컬럼: 시너지 하이드로-RP 150×4.6 mm, 4 ㎛
용리제: A: 완충액: 0.06 M H3PO4, pH=2.0/cc NH3
B: 아세토니트릴:물의 85:15 혼합물
C: 메탄올:완충액의 80:18 혼합물
구배표:
Figure pct00010
유속: 1.0 ml/min
컬럼 온도: 25℃
검출 파장: 225 nm
러닝 타임: 54분
희석제: 아세토니트릴:물의 50:50 혼합물
샘플 농도: 2,000 ㎍/ml

Claims (34)

  1. 하기 화학식으로 표시되는 1-((4R,5S)-5-(2-아미노에틸아미노)-N2-(10,12-디메틸-1-옥소테트라데실)-4-하이드록시-L-오르니틴)-2-L-세린-5-((3R)-3-하이드록시-L-오르니틴)-뉴모칸딘 B0인 단리된 카스포펀진 불순물 A:
    Figure pct00011
  2. 제1항에 있어서, 약 0.81, 0.82, 0.83, 1.46, 1.75, 1.84, 3.57, 3.77, 3.90, 3.92, 4.11, 4.17, 4.27, 4.40, 6.66, 6.98 ppm에서 수소 화학 이동을 갖는 1H NMR 스펙트럼; 약 11.00, 19.64, 20.18, 23.84, 25.29, 29.19, 29.50, 31.05, 33.38, 34.65, 35.02, 37.38, 45.60, 49.56, 54.25, 54.55, 55.37, 61.06, 61.68, 62.65, 68.51, 68.70, 69.26, 69.76, 73.13, 73.22, 75.97, 114.69, 128.09, 132.28, 156.59, 166.61, 169.39, 170.63, 170.71, 171.19, 173.68, 174.75 ppm에서 탄소 화학 이동을 갖는 13C NMR 스펙트럼; 약 m/z=540.319([M+2H]2+), 1079.630([M+H]+)에서 피크를 갖는 MS(ESI+) 스펙트럼; HPLC 분석에서의 약 18분의 체류 시간; 및 약 0.95의 상대 체류 시간으로부터 선택되는 데이터를 특징으로 하는 단리된 카스포펀진 불순물.
  3. HPLC에 의하면 약 1.0 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 순수한 카스포펀진.
  4. 제3항에 있어서, HPLC에 의하면 약 0.6 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 순수한 카스포펀진.
  5. 제4항 또는 제5항에 있어서, HPLC에 의하면 약 0.05 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 순수한 카스포펀진.
  6. 역상 크로마토그래피로 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 카스포펀진의 정제 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피가 중압 역상 컬럼(RP-MPLC) 또는 고압 역상 컬럼(RP-HPLC)인 정제 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 역상 크로마토그래피가 중압 역상 컬럼(RP-MPLC)인 정제 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카스포펀진을 수비혼화성 유기 용매와 물의 혼합물로 용리시키는 것인 정제 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 수비혼화성 유기 용매가 아세토니트릴 및 C1-C4 알코올로 구성된 군에서 선택되는 것인 정제 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 수비혼화성 유기 용매가 아세토니트릴인 정제 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 수비혼화성 용매와 물의 부피비가 바람직하게는 약 10:90∼약 40:60(v/v)의 용매:물인 정제 방법.
  13. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 수비혼화성 용매와 물의 부피비가 바람직하게는 약 20:80(v/v)의 용매:물인 정제 방법.
  14. 제11항에 있어서, 용리 혼합물에 아세트산을 첨가하는 것인 정제 방법.
  15. 제13항에 있어서, 약 0.025%∼약 1.0%를 첨가하는 것인 정제 방법.
  16. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 카스포펀진이 HPLC에 의하면 1.0 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것인 정제 방법.
  17. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 카스포펀진이 HPLC에 의하면 0.6 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것인 정제 방법.
  18. 제6항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 카스포펀진이 HPLC에 의하면 0.3 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것인 정제 방법.
  19. 역상 수지가 로딩된 분취용 HPLC를 수행하는 것을 포함하는 카스포펀진의 정제 방법.
  20. 제19항에 있어서, 역상 수지 C-18 또는 C-8을 사용하는 것인 정제 방법.
  21. 제20항에 있어서, 역상 수지가 C-18인 정제 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 카스포펀진이 HPLC에 의하면 약 0.3 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것인 정제 방법.
  23. 제22항에 있어서, 수득된 카스포펀진이 HPLC에 의하면 약 0.1 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것인 정제 방법.
  24. 제22항에 있어서, 수득된 카스포펀진이 HPLC에 의하면 약 0.05 면적% 미만의 불순물 A를 함유하는 것인 정제 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 카스포펀진을 수성 완충액과 유기 완충액으로 정제하는 것인 정제 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 수성 완충액이 아세트산을 포함하고, 상기 유기 완충액이 아세토니트릴인 정제 방법.
  27. 카스포펀진을 갖는 혼합물에서 불순물 A의 존재를 농축시키는 방법으로서,
    a) 상기 혼합물을 컬럼에 주입하고 이 컬럼에 물과 아세토니트릴을 첨가하는 단계;
    b) 불순물 A가 농축된 샘플을 수집하는 단계;
    c) 경우에 따라 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계;
    d) 농축된 샘플을 물로 희석하여 용액을 얻는 단계;
    e) 상기 용액을 상기 컬럼에 첨가하는 단계;
    f) 아세트산 함유 에탄올을 상기 컬럼에 첨가하는 단계;
    g) 불순물 A가 농축된 샘플을 수집하는 단계;
    h) 경우에 따라 단계 a) 및 b)를 반복하는 단계
    를 포함하는 농축 방법.
  28. 카스포펀진의 순도를 분석하기 위해 카스포펀진 불순물 A를 참조 마커로서 사용하는 방법으로서,
    a) 카스포펀진 및 카스포펀진 불순물 A를 포함하는 참조 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 참조 샘플을 HPLC로 분석하여, 카스포펀진과 비교한 카스포펀진 불순물 A의 상대 체류 시간을 측정하는 단계;
    c) 카스포펀진 샘플을 HPLC로 분석하여, 카스포펀진과 비교한 샘플 내용물의 상대 체류 시간을 측정하는 단계; 및
    d) 단계 c)에서 계산된 상대 체류 시간을 카스포펀진 불순물 A에 대해 단계 b)에서 계산된 상대 체류 시간과 비교하는 단계
    를 포함하며, 여기서 단계 c)에서 계산된 상대 체류 시간 중 어느 것이 카스포펀진 불순물 A의 상대 체류 시간과 실질적으로 동일할 경우, 카스포펀진 불순물 A가 카스포펀진 샘플 중에 존재하는 것인 사용 방법.
  29. 카스포펀진 샘플 중의 카스포펀진 불순물 A의 양을 측정하기 위해 카스포펀진 불순물 A를 참조 표준으로서 사용하는 방법으로서,
    a) 미지량의 카스포펀진 불순물 A를 함유하는 카스포펀진 샘플 중의 카스포펀진 불순물 A에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계;
    b) 기지량의 카스포펀진 불순물 A를 함유하는 참조 표준 중의 카스포펀진 불순물 A에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계; 및
    c) 단계 a)에서 계산된 면적을 단계 b)에서 계산된 면적과 비교함으로써 카스포펀진 샘플 중의 카스포펀진 불순물 A의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는 사용 방법.
  30. 카스포펀진 샘플 중의 카스포펀진 불순물 A의 양을 측정하는 정량 방법으로서,
    a) 미지량의 카스포펀진 불순물 A를 함유하는 카스포펀진 샘플 중의 카스포펀진 불순물 A에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계;
    b) 기지량의 카스포펀진을 함유하는 참조 표준 중의 카스포펀진에 해당하는 피크 아래 면적을 HPLC로 측정하는 단계; 및
    c) 단계 a)에서 계산된 면적을 단계 b)에서 계산된 면적과 비교함으로써 카스포펀진 샘플 중의 카스포펀진 불순물 A의 양을 측정하는 단계
    를 포함하는 정량 방법.
  31. 제30항에 있어서, 사용되는 HPLC법이
    (e) 카스포펀진 및 그 염의 샘플을 약 1:1의 비의 아세토니트릴:물의 혼합물과 혼합하여 용액을 얻는 단계;
    (f) 단계 (a)의 용액을 시너지 하이드로-RP(Synergi Hydro-RP)(또는 유사한) 컬럼에 주입하는 단계;
    (g) 약 20분째 용리제로서 완충액 혼합물, 아세토니트릴:물(85:15) 및 메탄올:완충액 혼합물(80:18)을 사용하여 컬럼으로부터 샘플을 용리시키는 단계; 및
    (h) (바람직하게는 225 nm 파장에서) UV 검출기를 사용하여 해당 샘플 중의 불순물 A 함량을 측정하는 단계
    를 포함하는 정량 방법.
  32. 카스포펀진 또는 이의 임의의 약학적으로 허용되는 염과 1종 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  33. 제32항에 있어서, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 카스포펀진 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 1종 이상의 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조되는 것인 약학 조성물.
  34. 칸디다(Candida), 아스퍼질러스(Aspergillus), 히스토플라즈마(Histoplasma), 콕시디오이데스(Coccidioides) 및 블라스토마이세스(Blastomyces)에 의해 유발되는 진균류 전신 감염의 치료 및 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii)에 의해 유발되는 감염의 치료 및 예방을 위해, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 카스포펀진 또는 이의 임의의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 치료가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
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