CN111896652A - 一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学分析定量检测技术领域，特别涉及一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法。上述蛇毒类凝血酶的定量检测方法为：取氨基酸序列为LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR的白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽对照品，制成系列浓度对照品溶液；分别加入上述供试品溶液，酶解，取酶解后的上清液作为系列待测溶液；待测溶液分别注入液相色谱‑质谱仪，选择定性离子对和定量离子对对待测溶液中的特征多肽含量进行检测。本发明采用标准加入法测定白眉蝮蛇蛇毒及其提取物中类凝血酶的含量，方法简便快捷，基质干扰少，灵敏度高，定量准确，填补了白眉蝮蛇蛇毒及其提取物质量标准的空白，提高了质量控制水平。

Description

一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法
技术领域
本发明涉及化学分析定量检测技术领域，特别涉及一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法。
背景技术
蛇毒类凝血酶是从蛇的毒液中提取分离得到的糖蛋白，具有降低血浆纤维蛋白原和血液黏度等作用，其作为药物用于治疗血栓性疾病已有50多年的历史，在临床上除用于脑栓塞、血栓闭塞性脉管炎、股动脉栓塞、肺栓塞等血栓性疾病以及预防术后血栓再发等治疗外，对肾病、红斑狼疮、病毒性肝炎及雷诺氏病等有一定疗效。
白眉蝮蛇是我国一种特有蝮蛇，主要分布在我国东北长白山山区。白眉蝮蛇蛇毒成分复杂，含有多种蛋白质、多肽、核苷、酶类、金属离子和其它小分子物质。以白眉蝮蛇蛇毒为原料可提取得到蛇毒血凝酶，主要活性成分为类凝血酶，还有含有少量的类凝血激酶及L-氨基氧化酶、磷酸酶和透明质酸酶等，临床广泛应用于治疗各种出血和出血性疾病。目前报道的测定蛇毒中类凝血酶含量的方法主要为凝胶电泳法和效价测定法，测定方法繁琐且准确性差，无法准确表征蛇毒的质量。因此建立一种方便快捷，定量准确的类凝血酶检测方法，以表征白眉蝮蛇蛇毒及其提取物的质量具有广泛的社会效益和经济效应。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种检测白眉蝮蛇蛇毒及其提取物中类凝血酶含量的方法，该方法利用液相色谱-质谱仪，采用标准加入法测定白眉蝮蛇蛇毒及其提取物中类凝血酶的含量，方法简便快捷，基质干扰少，灵敏度高，定量准确，填补了白眉蝮蛇蛇毒及其提取物质量标准的空白，提高了质量控制水平。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法，采用步骤如下：
（1）取氨基酸序列为LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR的白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽对照品，溶解并稀释制成系列浓度对照品溶液；
（2）取待测样品适量，溶解制成供试品溶液；
（3）取步骤（1）所述系列浓度对照品溶液，分别加入步骤（2）所述供试品溶液，混匀，使用胰蛋白酶酶解，取酶解后的上清液作为系列待测溶液；
（4）取步骤（3）所述待测溶液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以三电荷935.8→602.3作为定性离子对，以三电荷935.8→861.4和作为定量离子对，进行检测；
（5）提取离子三电荷935.8→861.4色谱图，以系列待测溶液中特征多肽加入量为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程y=ax+b，r>0.99，根据回归方程，计算y=0时的x值，即为待测溶液中的特征多肽的量，进而计算待测样品中白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽的含量。
进一步地，所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽检出限为3 ng/mL，定量限为9ng/mL。
优选地，步骤（1）的具体操作为：称取白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽对照品10mg，用25 mmol/L 碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10 mL，取适量体积用25 mmol/L碳酸氢铵溶液稀释制成浓度为0、0.05 μg/mL、0.15 μg/mL、0.3 μg/mL、0.45 μg/mL系列浓度对照品溶液。
优选地，步骤（2）所述具体操作为：称取白眉蝮蛇蛇毒干粉20mg或白眉蝮蛇蛇毒提取物500 μL，用25 mmol/L 碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10 mL制成供试品溶液；
优选地，步骤（3）所述具体操作为：量取供试品溶液5份，每份100 μL，分别加入浓度为0、0.05 μg/mL、0.15 μg/mL、0.3 μg/mL、0.45 μg/mL的系列浓度对照品溶液各100 μL，混匀，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1 h，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20μL，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/ mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃反应90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液作为系列待测溶液。
优选地，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱50 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A10%→10%。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10 V，去簇电压DP 为135 V；以质荷比m/z三电荷935. 8→602.3作为定性离子对，碰撞能量40 V；以三电荷935.8→861.4作为定量离子对，碰撞能量45 V。
本发明的有益效果：
（1）本发明利用NCBI和UniProt对已有蛇种蛋白库和毒液蛋白库进行整合后搜库比对，结合大量实验研究，寻找到了白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的特征多肽LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR，由于已知其他蛇种如矛头蝮蛇、蝰蛇和尖吻蝮蛇等蛇毒类凝血酶氨基酸序列中不含该段氨基酸序列，因此该特征多肽可用于专属性表征白眉蝮蛇蛇毒中的类凝血酶。
（2）本发明通过酶解处理样品，采用液相色谱-质谱联用建立了一种检测白眉蝮蛇蛇毒及其提取物中类凝血酶含量的方法，该方法采用标准加入法可以有效降低基质干扰，方便快捷，定量准确，填补了白眉蝮蛇蛇毒及其提取物质量标准的空白，提高了质量控制水平。
附图说明
图1白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽一级质谱图；
图2白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽二级质谱图；
图3专属性考察图谱-空白溶液质谱图；
图4专属性考察图谱-特征多肽对照品质谱图；
图5专属性考察图谱-白眉蝮蛇蛇毒提取物1质谱图；
图6专属性考察图谱-白眉蝮蛇蛇毒质谱图；
图7检出限与定量限质谱图；
图8线性及范围图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
下述实施例中相关试剂试药及溶液的制备方法如下：
（1）试剂：胰蛋白酶（Sigma，批号SLBS8956）、白眉蝮蛇蛇毒类血凝（锦州奥鸿药业，纯度为98.5%）、盐酸胍（VETEC，批号WXBC4261V）、三羟基氨基甲烷（沪市，批号20181206）、二硫苏糖醇（BBI Life Sciences，批号D911BA0011）、碘乙酰胺（BBI Life Sciences，批号B326BA1943），其它试剂均为分析纯。
（2）25 mmol/L碳酸氢铵溶液：称取79.06 mg 碳酸氢铵，加40 mL水溶解，即得。
（3）二硫苏糖醇（DTT）溶液：称取15.42 mg 二硫苏糖醇，加500 μL水溶解，即得。
（4）碘乙酰胺（IA）溶液（临用新制）：称取18.5 mg碘乙酰胺，加500μL水溶解，即得。
（5）0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）：称取胰蛋白酶8.0 mg，加20 mL水溶解，即得。
实施例1
白眉蝮蛇类凝血酶特征多肽的筛选和确定
1 仪器设备
Thermo Fusion高分辨质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），EASY-nLC 1000纳升液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国），CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma 3-30 K冷冻离心机(Sigma, 德国)，密理博Milli-QAdvantage A10超纯水仪（Millipore，美国）。
2 色谱质谱条件
色谱柱：实验室自制0.2 mm × 3.5 cm（5 μm粒径）的 ReproSil-Pur C18-AQ Trapcolumn脱盐富集，采用实验室自制75 μm × 25 cm（3 μm粒径）的 ReproSil-Pur C18-AQ纳升分析柱分离。流动相A为2% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液；流动相B为98% 乙腈的0.1% 甲酸水溶液。纳升分离泵流速为300 nL/min，梯度洗脱设置见下表1。
Figure 76290DEST_PATH_IMAGE002
质谱条件：采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.0 kV，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60,000，采集范围为350-1650。二级质谱采用IT作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用HCD模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。
3.数据采集
取白眉蝮蛇蛇毒类血凝5 mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并定容；精密量取200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1小时，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20μL，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液作为供试品溶液，采用纳升液相分离进样，利用高分辨质谱采集一级和二级质谱图。
4.搜库筛选及确定
使用NCBI和UniProt，对相关蛇蛋白库和毒液蛋白库进行整合，建立蛇及毒液数据库。通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种蛇毒类凝血酶蛋白的结果，并通过将白眉蝮蛇类凝血酶蛋白序列与其他物种的序列比对获得白眉蝮蛇相对于其他物种的特征性多肽序列，并使用Proteome Discoverer软件（2.2版）对质谱数据搜库，参照(1)8~25氨基酸、(2)尽量避免易发生人为修饰的肽段、(3)酶切时无漏切位点等原则，结合质谱响应和分离情况，确定“LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR”可作为白眉蝮蛇类凝血酶的特征多肽。检测结果显示特征多肽的分子量和二级质谱都与理论值相符，见图1和图2。
实施例2
多反应监测（MRM）定量分析样品中的白眉蝮蛇类凝血酶。
1.仪器设备
SCIEX Triple Quad 6500三重四级杆质谱仪，CP225D电子天平（Sartorius，德国），Sigma 3-30 K冷冻离心机(Sigma，德国)，密理博Milli-QAdvantage A10超纯水仪（Millipore，美国）。
2.色谱质谱条件
液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A10%→10%。
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压（EP）10 V，去簇电压（DP）为135 V；以质荷比m/z三电荷935.8→602.3作为定性离子对，碰撞能量40 V；以三电荷935.8→861.4作为定量离子对，碰撞能量45 V。
3.溶液制备
3.1 系列浓度对照品溶液制备
精密称取实施例1筛选的特征多肽对照品10 mg，置10 mL量瓶中，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，混匀，分别精密量取0、5、15、30、45、60 μL置100 mL量瓶中，用25mmol/L碳酸氢铵溶液稀释制成浓度为0、0.05、0.15、0.30、0.45 μg/mL系列浓度对照品溶液。
3.2供试品溶液制备
精密称取待测样品（白眉蝮蛇蛇毒干粉20mg或白眉蝮蛇蛇毒提取物500μL），置10 mL量瓶中，用25 mmol/L 碳酸氢铵溶液溶解并定容至刻度，混匀，得供试品溶液。
3.3系列待测溶液制备
精密量取3.2项下供试品溶液5份，每份100 μL，分别加入3.1项下的系列浓度对照品溶液各100 μL，混匀，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1 h，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/ mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液作为系列待测溶液。
] 3.4待测空白溶液制备
精密量取25 mmol/L碳酸氢铵溶液200 μL，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1 h，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/mL 胰蛋白酶溶液（临用新制）10 μL，37℃反应90 min，90℃灭活10min，放冷至室温，1200 rpm离心10 min，取上清液作为空白溶液。
4.测定法
取上述系列待测溶液各2 μL，按照2项下色谱质谱条件检测，提取离子三电荷935.8→861.4色谱图，以系列待测溶液中特征多肽加入量为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程y=ax+b，r>0.99，根据回归方程，计算y=0时的x值，即为待测溶液中的特征多肽的含量，进而计算待测样品中类凝血酶特征多肽的含量。
5.专属性考察
取供试品溶液、空白溶液和对照品溶液各2 μL，进行液质分析，结果空白溶液在对照品溶液出峰位置没有干扰峰出现，供试品溶液在对照品溶液出峰位置有响应色谱峰出现，表明该方法专属性良好，见图1-图3。
6.检出限与定量限
取0.15 μg/mL的对照品溶液按3.3项下酶解处理，分别稀释至浓度为3 ng/mL和9 ng/mL进样2 μL，以特征多肽三电荷935.8→861.4作为定量离子对进行检测。信噪比分别为3.1和9.8。因此检出限为3 ng/mL，定量限为9 ng/mL，见图4。
7.线性及重复性
按照3.2项下，取白眉蝮蛇蛇毒提取物（批号20190201）500 μL，制备6份供试品溶液，分别按照3.3项下制备系列待测溶液，进行检测，结果显示在特征多肽加入量0 ng～450 ng范围内，特征多肽的浓度与色谱峰面积成线性关系，相关系数均大于0.99；6次重复试验，样品中特征多肽平均含量为31.5 μg/mL，RSD%为3.7%，重复性良好。
Figure 55748DEST_PATH_IMAGE003
8. 精密度实验
取3.3项下的待测溶液（对照品加入量300ng），连续重复进样6次，提取三电荷936.3→861.4离子对色谱图，6次进样的峰面积RSD为1.8%，仪器精密度良好。
9.稳定性实验
取3.3项下的待测溶液（对照品加入量150ng），处理后置于8℃，分别于0、2、4、8、16及24h后进样测定，提取三电荷935.8→861.4离子对色谱图，峰面积RSD为0.9%，表明待测溶液在8 ℃下24 h内稳定。
Figure 428960DEST_PATH_IMAGE004
10.样品检测
按照3项下方法，分别对白眉蝮蛇蛇毒、白眉蝮蛇蛇毒提取物、矛头蝮蛇蛇毒及未知蛇种的蛇毒干粉进行处理，按照4项下方法进行检测，结果见表4，不同批次含量相似。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
以上实施例为本发明较佳的实施方式，单本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何为背离本发明的精神实质于原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 山东省食品药品检验研究院，山东大学，锦州奥鸿药业有限责任公司
<120> 一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 白眉蝮蛇(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Leu Asp Ser Pro Val Ser Asn Ser Ala His Pro Leu Ser Leu Pro Ser
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ser Val Gly Ser Val Cys Arg
20 25

Claims (6)

1.一种蛇毒类凝血酶的定量检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）取氨基酸序列为LDSPVSNSAHPLSLPSSAPSVGSVCR的白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽对照品，溶解并稀释制成系列浓度对照品溶液；
（2）取待测样品，溶解制成供试品溶液；
（3）取步骤（1）所述系列浓度对照品溶液，分别加入步骤（2）所述供试品溶液，混匀，使用胰蛋白酶酶解，取酶解后的上清液作为系列待测溶液；
（4）取步骤（3）所述待测溶液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式，进行多反应监测，以三电荷935.8→602.3作为定性离子对，以三电荷935.8→861.4作为定量离子对，进行检测；
（5）提取离子对三电荷935.8→861.4色谱图，以系列待测溶液中特征多肽加入量为横坐标，以对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程y=ax+b，r>0.99，根据回归方程，计算y=0时的x值，即为待测溶液中的特征多肽的量，进而计算待测样品中白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽检出限为3 ng/mL，定量限为9 ng/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）的具体操作为：称取白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶特征多肽对照品10 mg，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10 mL，用上述碳酸氢铵溶液将对照品溶液稀释制成浓度为0、0.05 μg/mL、0.15 μg/mL、0.3 μg/mL、0.45 μg/mL系列浓度对照品溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述具体操作为：称取白眉蝮蛇蛇毒干粉20mg或白眉蝮蛇蛇毒提取物500 μL，用25 mmol/L碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10 mL制成供试品溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述具体操作为：量取供试品溶液5份，每份100 μL，分别加入浓度为0、0.05 μg/mL、0.15 μg/mL、0.3 μg/mL、0.45 μg/mL的系列浓度对照品溶液各100 μL，混匀，加0.2 mol/L二硫苏糖醇溶液10 μL，混匀，60℃反应1h，加0.2 mol/L碘乙酰胺溶液20 μL，避光放置30 min，加25 mmol/L碳酸氢铵溶液760 μL和0.4 mg/ mL 胰蛋白酶溶液10 μL，37℃反应90 min，90℃灭活10 min，放冷至室温，1200rpm离心10 min，取上清液作为系列待测溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件如下：
液相条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱50 mm×2.1 mm，1.7 μm；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.2 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→1 min，流动相A 80%；1→5 min，流动相A 80%→10%；5→7 min，流动相A10%→10%；
质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500℃；离子化电压：5.5 kV；碰撞室出口电压10 V；入口电压EP 10 V，去簇电压DP 为135 V；以质荷比m/z三电荷935. 8→602.3作为定性离子对，碰撞能量40 V；以三电荷935.8→861.4作为定量离子对，碰撞能量45 V。
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