CN115248270B - 一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，该检测方法旨在解决现有技术下仅通过液相色谱法进行检测，检测的精度低，不能选择性进行蛋白含量的绝对定量，且没有对样品进行预处理，样品溶液内含有杂质，会影响检测的结果，且容易造成设备损坏的技术问题。其步骤如下：S1：样品的预处理；S2：样品工作溶液的酶解；S3：溶液的配制；S4：调整液相色谱‑质谱操作条件，将标准工作溶液和待测液分别注入液相色谱‑质谱联用仪中，得到质谱图；S5：筛选数据库里的多肽；S6：输出蛋白酶残留含量的数据。该检测方法采用液相色谱‑串联质谱联用技术，可以选择性进行蛋白含量的绝对定量分析，提高检测的精度，降低检测的难度和成本。

Description

一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法
技术领域
本发明属于口服固体制剂工艺领域，具体涉及一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法。
背景技术
阿莫西林是一种最常用的抗生素，阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强，是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一，其制剂有胶囊、片剂、颗粒剂、分散片等等，现在常与克拉维酸合用制成分散片，目前市场上的阿莫西林原料以酶法合成的占大多数，蛋白酶又具有一定的生物活性，对产品质量安全有一定影响，且不同厂家的蛋白酶有所差别，因此有必要对残留蛋白酶含量进行检测。
目前，专利号为CN201210135326.6的发明专利公开了一种酶法制备阿莫西林产品中残留酶蛋白的检测方法，本发明方法包括：对照品溶液制备：取青霉素G 酰基转移酶蛋白标准品，用pH 值7.0 的0.05mol/L磷酸盐缓冲液稀释得对照品溶液；供试品溶液的制备：取供试品，精密称定并置于量瓶中，加入pH 值7.0 的0.05mol/L 的磷酸盐缓冲液，加入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，使供试品完全溶解至溶液澄清，再用pH 值7.0 的0.05mol/L 磷酸盐缓冲溶液稀释得供试品溶液；分别精密量取上述溶液各100μL 注入高效液相色谱仪中，记录峰面积，以外标法测量残留蛋白的含量；其中，所述高效液相色谱的条件为：色谱柱：TSK gel Octadecyl 4 PW(7)、4.6×150mm ；色谱柱温度：30℃ ；流动相：水- 乙腈- 三氟醋酸体系，线性梯度洗脱。其采用的是通过色谱法，但该方法仅通过液相色谱法进行检测，检测的精度低，不能选择性进行蛋白含量的绝对定量，且没有对样品进行预处理，样品溶液内含有杂质，会影响检测的结果，且容易造成设备损坏。
因此，针对上述检测精度低的问题，亟需得到解决，以改善检测方法的使用场景。
发明内容
（1）要解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，该检测方法旨在解决现有技术下仅通过液相色谱法进行检测，检测的精度低，不能选择性进行蛋白含量的绝对定量，且没有对样品进行预处理，样品溶液内含有杂质，会影响检测的结果，且容易造成设备损坏的技术问题。
（2）技术方案
为了解决上述技术问题，本发明提供了这样一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其步骤如下：
S1：样品的预处理：
S11：阿莫西林原料药称取5mg放入离心管中，加入5mL去离子水，置沸水浴中加热变性30min，冷却至室温，往变性后的溶液中加0.10mol/L的碳酸氢铵溶液定容至10mL，然后摇匀，得到样品工作溶液；
S12：通过微米膜对样品工作溶液进行过滤，去除样品工作溶液中颗粒物；
S13：将样品工作溶液放入离心机中，以10000g离心15分钟；
S14：取出离心后的样品工作溶液，并加入核酸酶，去除样品工作溶液中核酸；
S15：往样品工作溶液中加入蛋白酶抑制剂，抑制样品工作溶液中蛋白水解酶；
S2：样品工作溶液的酶解：
S21：将配制好的样品工作溶液加入酶解瓶中，放入恒温振荡反应器中，设定温度和振荡频率，反应至特征多肽丰度不再变化；
S22：沸水浴加热5min，冷却至室温后离心，取上清液，得到待测液；
S3：溶液的配制：
S31：液相色谱流动相A的配制：取200mL水置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤；
S32：液相色谱流动相B的配制：将200mL乙腈水溶液置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤，乙腈水溶液包含乙腈和水，其中乙腈和水的体积比为6:4；
S33：特征多肽标准工作溶液的配制：称取5mg的胶原蛋白特征多肽，用1ml0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢钠溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S34：同位素标记特征多肽内标储备液的配制：称取5mg的同位素标记胶原蛋白特征多肽，用1mL0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢铵溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S4：调整液相色谱-质谱操作条件，色谱条件为：流速0.2mL/min、柱温为25℃、进样量为2pL、色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，质谱条件为：质谱仪的电力电压为1.6kV、裂解参数为0.22、活化时间为50ms、碰撞能量为45%、离子源蒸发温度为300℃、离子源为电喷雾离子源、扫描方式为正离子扫描、检测方式为连续3次扫描，第一次为全质谱扫描，第二次变焦扫描两个最高分辨率的离子，第三次扫描这两个离子的MS/MS，采用梯度洗脱的方式，将标准工作溶液和待测液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，得到质谱图；
S5：筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱图匹配的多肽；
S6：用挑选出的多肽与质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSM，从而输出蛋白酶残留含量的数据。
优选地，所述S11中0.10mol/L的碳酸氢铵溶液的配制方法为：称取0.790g的碳酸氢铵，加水定容至100mL。
优选地，所述S12中微米膜的孔径为0.22-0.45um。
优选地，所述S21中恒温振荡反应器的温度为37℃、振荡频率为150次/分钟-200次/分钟。
优选地，所述S33中0.05mol/L碳酸氢铵溶液的配制：用0.395g碳酸氢钠加水定容至100mL。
优选地，所述S4中梯度洗脱的程序为：初始时，流动相A95%、流动相B5%，第3分钟时，流动相A90%、流动相B10%，第7分钟时，流动相A5%、流动相B95%，第10分钟时，流动相A95%、流动相B5%。
（3）有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的检测方法采用液相色谱-串联质谱联用技术，可以选择性进行蛋白含量的绝对定量分析，提高检测的精度，且通过对样品的预处理，减少样品中的杂质，降低对检测结果的影响，并且避免造成设备损坏，操作简单，需要用到的设备少，降低检测的难度和成本，并且通过对蛋白酶残留含量的精确测量，提高了阿莫西林的安全性。
具体实施方式
实施例1
本具体实施方式是阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其步骤如下：
S1：样品的预处理：
S11：阿莫西林原料药称取5mg放入离心管中，加入5mL去离子水，置沸水浴中加热变性30min，冷却至室温，往变性后的溶液中加0.10mol/L的碳酸氢铵溶液定容至10mL，然后摇匀，得到样品工作溶液；
S12：通过微米膜对样品工作溶液进行过滤，去除样品工作溶液中颗粒物；
S13：将样品工作溶液放入离心机中，以10000g离心15分钟；
S14：取出离心后的样品工作溶液，并加入核酸酶，去除样品工作溶液中核酸；
S15：往样品工作溶液中加入蛋白酶抑制剂，抑制样品工作溶液中蛋白水解酶；
S2：样品工作溶液的酶解：
S21：将配制好的样品工作溶液加入酶解瓶中，放入恒温振荡反应器中，设定温度和振荡频率，反应至特征多肽丰度不再变化；
S22：沸水浴加热5min，冷却至室温后离心，取上清液，得到待测液；
S3：溶液的配制：
S31：液相色谱流动相A的配制：取200mL水置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤；
S32：液相色谱流动相B的配制：将200mL乙腈水溶液置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤，乙腈水溶液包含乙腈和水，其中乙腈和水的体积比为6:4；
S33：特征多肽标准工作溶液的配制：称取5mg的胶原蛋白特征多肽，用1ml0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢钠溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S34：同位素标记特征多肽内标储备液的配制：称取5mg的同位素标记胶原蛋白特征多肽，用1mL0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢铵溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S4：调整液相色谱-质谱操作条件，色谱条件为：流速0.2mL/min、柱温为25℃、进样量为2pL、色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，质谱条件为：质谱仪的电力电压为1.6kV、裂解参数为0.22、活化时间为50ms、碰撞能量为45%、离子源蒸发温度为300℃、离子源为电喷雾离子源、扫描方式为正离子扫描、检测方式为连续3次扫描，第一次为全质谱扫描，第二次变焦扫描两个最高分辨率的离子，第三次扫描这两个离子的MS/MS，采用梯度洗脱的方式，将标准工作溶液和待测液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，得到质谱图；
S5：筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱图匹配的多肽；
S6：用挑选出的多肽与质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSM，从而输出蛋白酶残留含量的数据。
其中，所述S11中0.10mol/L的碳酸氢铵溶液的配制方法为：称取0.790g的碳酸氢铵，加水定容至100mL，所述S12中微米膜的孔径为0.22-0.45um。
同时，所述S21中恒温振荡反应器的温度为37℃、振荡频率为150次/分钟-200次/分钟。
另外，所述S33中0.05mol/L碳酸氢铵溶液的配制：用0.395g碳酸氢钠加水定容至100mL。
此外，所述S4中梯度洗脱的程序为：初始时，流动相A95%、流动相B5%，第3分钟时，流动相A90%、流动相B10%，第7分钟时，流动相A5%、流动相B95%，第10分钟时，流动相A95%、流动相B5%。
使用本技术方案的检测方法时，其步骤如下：
S1：样品的预处理：
S11：阿莫西林原料药称取5mg放入离心管中，加入5mL去离子水，置沸水浴中加热变性30min，冷却至室温，往变性后的溶液中加0.10mol/L的碳酸氢铵溶液定容至10mL，然后摇匀，得到样品工作溶液，0.10mol/L的碳酸氢铵溶液的配制方法为：称取0.790g的碳酸氢铵，加水定容至100mL；
S12：通过微米膜对样品工作溶液进行过滤，去除样品工作溶液中颗粒物，微米膜的孔径为0.22um；
S13：将样品工作溶液放入离心机中，以10000g离心15分钟；
S14：取出离心后的样品工作溶液，并加入核酸酶，去除样品工作溶液中核酸；
S15：往样品工作溶液中加入蛋白酶抑制剂，抑制样品工作溶液中蛋白水解酶；
S2：样品工作溶液的酶解：
S21：将配制好的样品工作溶液加入酶解瓶中，放入恒温振荡反应器中，设定温度为37℃、振荡频率为150次/分钟，反应至特征多肽丰度不再变化；
S22：沸水浴加热5min，冷却至室温后离心，取上清液，得到待测液；
S3：溶液的配制：
S31：液相色谱流动相A的配制：取200mL水置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤；
S32：液相色谱流动相B的配制：将200mL乙腈水溶液置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤，乙腈水溶液包含乙腈和水，其中乙腈和水的体积比为6:4；
S33：特征多肽标准工作溶液的配制：称取5mg的胶原蛋白特征多肽，用1ml0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢钠溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液，0.05mol/L碳酸氢铵溶液的配制：用0.395g碳酸氢钠加水定容至100mL；
S34：同位素标记特征多肽内标储备液的配制：称取5mg的同位素标记胶原蛋白特征多肽，用1mL0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢铵溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S4：调整液相色谱-质谱操作条件，采用梯度洗脱的方式，将标准工作溶液和待测液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，得到质谱图，色谱条件为：流速0.2mL/min、柱温为25℃、进样量为2pL、色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，所述S4中质谱条件为：质谱仪的电力电压为1.6kV、裂解参数为0.22、活化时间为50ms、碰撞能量为45%、离子源蒸发温度为300℃、离子源为电喷雾离子源、扫描方式为正离子扫描、检测方式为连续3次扫描，第一次为全质谱扫描，第二次变焦扫描两个最高分辨率的离子，第三次扫描这两个离子的MS/MS，所述S4中梯度洗脱的程序为：初始时，流动相A95%、流动相B5%，第3分钟时，流动相A90%、流动相B10%，第7分钟时，流动相A5%、流动相B95%，第10分钟时，流动相A95%、流动相B5%；
S5：筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱图匹配的多肽；
S6：用挑选出的多肽与质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSM，从而输出蛋白酶残留含量的数据。

Claims (6)

1.一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其特征在于，其步骤如下：
S1：样品的预处理：
S11：阿莫西林原料药称取5mg放入离心管中，加入5mL去离子水，置沸水浴中加热变性30min，冷却至室温，往变性后的溶液中加0.10mol/L的碳酸氢铵溶液定容至10mL，然后摇匀，得到样品工作溶液；
S12：通过微米膜对样品工作溶液进行过滤，去除样品工作溶液中颗粒物；
S13：将样品工作溶液放入离心机中，以10000g离心15分钟；
S14：取出离心后的样品工作溶液，并加入核酸酶，去除样品工作溶液中核酸；
S15：往样品工作溶液中加入蛋白酶抑制剂，抑制样品工作溶液中蛋白水解酶；
S2：样品工作溶液的酶解：
S21：将配制好的样品工作溶液加入酶解瓶中，放入恒温振荡反应器中，设定温度和振荡频率，反应至特征多肽丰度不再变化；
S22：沸水浴加热5min，冷却至室温后离心，取上清液，得到待测液；
S3：溶液的配制：
S31：液相色谱流动相A的配制：取200mL水置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤；
S32：液相色谱流动相B的配制：将200mL乙腈水溶液置于不小于1000mL的容量瓶中，加入1mL甲酸，并加水定容至1000mL，然后用0.22μm滤膜过滤，乙腈水溶液包含乙腈和水，其中乙腈和水的体积比为6:4；
S33：特征多肽标准工作溶液的配制：称取5mg的胶原蛋白特征多肽，用1ml0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢钠溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S34：同位素标记特征多肽内标储备液的配制：称取5mg的同位素标记胶原蛋白特征多肽，用1mL0.05mol/L碳酸氢铵溶液溶解，用0.05mol/L碳酸氢铵溶液定容至10mL，配制成浓度为2mg/mL的标准溶液；
S4：调整液相色谱-质谱操作条件，色谱条件为：流速0.2mL/min、柱温为25℃、进样量为2pL、色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，质谱条件为：质谱仪的电力电压为1.6kV、裂解参数为0.22、活化时间为50ms、碰撞能量为45%、离子源蒸发温度为300℃、离子源为电喷雾离子源、扫描方式为正离子扫描、检测方式为连续3次扫描，第一次为全质谱扫描，第二次变焦扫描两个最高分辨率的离子，第三次扫描这两个离子的MS/MS，采用梯度洗脱的方式，将标准工作溶液和待测液分别注入液相色谱-质谱联用仪中，得到质谱图；
S5：筛选数据库里的多肽，找出所有可能与质谱图匹配的多肽；
S6：用挑选出的多肽与质谱图进行比对，并输出最高分值的多肽作为一个PSM，从而输出蛋白酶残留含量的数据。
2.根据权利要求1所述的一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其特征在于，所述S11中0.10mol/L的碳酸氢铵溶液的配制方法为：称取0.790g的碳酸氢铵，加水定容至100mL。
3.根据权利要求1所述的一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其特征在于，所述S12中微米膜的孔径为0.22-0.45um。
4.根据权利要求1所述的一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其特征在于，所述S21中恒温振荡反应器的温度为37℃、振荡频率为150次/分钟-200次/分钟。
5.根据权利要求1所述的一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其特征在于，所述S33中0.05mol/L碳酸氢铵溶液的配制：用0.395g碳酸氢钠加水定容至100mL。
6.根据权利要求1所述的一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法，其特征在于，所述S4中梯度洗脱的程序为：初始时，流动相A95%、流动相B5%，第3分钟时，流动相A90%、流动相B10%，第7分钟时，流动相A5%、流动相B95%，第10分钟时，流动相A95%、流动相B5%。
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