CN114441652A - 一种酶蛋白检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶蛋白检测方法，该检测方法采用液相色谱‑串联质谱技术检测待测样品中的酶蛋白，所述待测样品为抗生素残留蛋白，所述抗生素残留蛋白通过前处理酶解后形成酶蛋白。该方法可高灵敏高选择性进行蛋白含量的绝对定量。
Description
技术领域
本发明属于化学分析领域，具体涉及一种酶蛋白检测方法。
背景技术
发酵类抗生素残留蛋白的控制是发酵类抗生素过程控制的重要属性。
对于发酵类抗生素药品中残留蛋白检测的文献较少。《发酵类抗生素中残留蛋白通用性测定方法的探讨》一文中采用凝胶过滤色谱先将蛋白与抗生素分离，富集蛋白组分，再冻干、复溶，最后利用Bradford 法( 考马斯亮蓝染色法) 对残留蛋白进行测定。分别采用SephadexTMG-15( 300mm×15mm，40～120μm) 和SephadexTM G-25( 100mm×26mm，90μm)色谱柱，以水为流动相，检测波长为280nm，柱温30℃，进样量为500μL。结果: 凝胶过滤法收集蛋白组分方法平均回收率约为97.4%，Bradford 法的蛋白浓度在2～ 40μg·mL － 1 (r = 0.9996) 内线性关系良好，蛋白( BSA) 平均回收率约为95.4%，Bradford 法的精密度小于3.0%，最低检测限为0.2μg·mL－1。所建立方法的合成标准不确定度为0.001%，扩展不确定度为0.002%。结论: 该方法准确、可靠，重复性好，但是专属性和灵敏度不高。
鉴于现有的高效液相色谱法对发酵类抗生素药品中残留蛋白检测方法专属性和灵敏度不高，本发明拟采用专属性和灵敏度高的液相色谱串联质谱法进行残留蛋白的检测。
发明内容
本发明旨在提供一种准确、可靠，专属性、灵敏度、重复性好的酶蛋白检测方法。
为实现上述发明目的，本发明一种酶蛋白检测方法，具体实施方案为：
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法采用液相色谱-串联质谱技术检测待测样品中的酶蛋白，所述待测样品为抗生素残留蛋白，所述抗生素残留蛋白通过前处理酶解后形成酶蛋白。
进一步地，检测方法所述待测样品为发酵类抗生素残留蛋白，该检测方法包括色谱条件、质谱条件、抗生素残留蛋白前处理方法、酶蛋白供试品溶液制备、酶蛋白对照品溶液制备。
本发明所述液相色谱-串联质谱技术，色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱， 流动相 A：甲酸溶液； 流动相 B：乙腈；流动相 A和流动相 B比例为（0.5:1）~（1：0.5）；柱温：25~40℃ 流速：200~400µl/min 进样量：5~20µl。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术：质谱条件为：
a) 鞘气压力：35-45unit；
b) 辅助气压力：5-15unit；
c) 电喷雾电压：3200V；
d) 毛细管温度：300~350℃；
e) 源内诱导解离电压：10V；
f) Q1，Q3 分辨率：0.7；
g) 碰撞气：高纯氩气；
h) 碰撞气压力：1.2mTorr；
i） 离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)；
j）质谱扫描方式：多反应监测 (MRM)。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述抗生素残留蛋白前处理方法为：酶解溶剂为碳酸氢铵溶液，酶解固相萃取柱富集净化目标肽段。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述酶蛋白供试品溶液制备：将酶解液冷却至室温，用固相萃取柱净化酶解液，固相萃取柱依次用甲醇、水和碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液过柱，用水淋洗，抽干后用甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹，最后甲酸水定容，过滤，即得。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述酶蛋白对照品溶液制备：
1）取适量对照品溶液于离心管中，加入同位素内标溶液，加入碳酸氢铵溶液，加入胰酶溶液，涡旋混合，水浴酶解；
2）将酶解液冷却至室温，用固相萃取柱净化酶解液，固相萃取柱依次用甲醇、水和碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液过柱，用水淋洗，抽干后用甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹，最后用甲酸水定容，过滤，即得。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术：色谱条件：
色谱柱：C18色谱柱； 流动相 A：0.1%甲酸溶液； 流动相 B：乙腈；流动相 A和流动相 B比例为65:35；柱温：30℃ 流速：300µl/min 进样量：20µl。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术：质谱条件为：
a) 鞘气压力：40unit；
b) 辅助气压力：10unit；
c) 电喷雾电压：3200V；
d) 毛细管温度：320℃；
e) 源内诱导解离电压：10V；
f) Q1，Q3 分辨率：0.7；
g) 碰撞气：高纯氩气；
h) 碰撞气压力：1.2mTorr；
i） 离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)
j）质谱扫描方式：多反应监测 (MRM)。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述抗生素残留蛋白前处理方法为：称定待检测原料入离心管中，加入同位素内标溶液，加入碳酸氢铵溶液，加入胰酶溶液，涡旋混合，32±5℃水浴酶解10-20小时。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述抗生素残留蛋白前处理方法为：酶解采用100mmol/L碳酸氢铵，酶解后用C18固相萃取柱可富集净化目标肽段。
具体地，本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述酶蛋白供试品溶液制备：将酶解液冷却至室温，用C18固相萃取柱（SPE）净化酶解液。SPE柱依次用3ml甲醇、3ml水和3ml 100mmol/L碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液全部过柱，用8ml水淋洗，抽干后用2ml甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹至约0.4ml，最后用0.1%甲酸水定容至0.5ml，过0.22μm有机膜，即得。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述酶蛋白对照品溶液制备：
取适量对照品溶液于15ml离心管中，加入500ng同位素内标溶液，加入2ml 100mmol/L碳酸氢铵溶液，加入2µl胰酶溶液（1µg/µl），涡旋混合1分钟，37℃水浴酶解15小时。
将酶解液冷却至室温，用C18固相萃取柱（SPE）净化酶解液。SPE柱依次用3ml甲醇、3ml水和3ml 100mmol/L碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液全部过柱，用8ml水淋洗，抽干后用2ml甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹至约0.4ml，最后用0.1%甲酸水定容至0.5ml，过0.22μm有机膜，即得。
精密量取试剂空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各20µl，分别注入液相色谱串联质谱仪，记录色谱图。
本发明所述一种酶蛋白检测方法，该检测方法所述抗生素残留蛋白前处理方法为：称定阿莫西林原料0.25g于15ml离心管中，加入500ng同位素内标溶液，加入100mmol/L碳酸氢铵2ml，加入2µl胰酶溶液（1µg/µl），涡旋混合1分钟，37℃水浴酶解15小时。
本发明采用液相色谱串联质谱法进行残留蛋白的检测。由于蛋白分子量较大，直接测定较难，一般是将蛋白酶解后检测其特征，肽段来实现鉴定或定量。特征肽段用液相色谱-串联质谱技术（HPLC-MS/MS）可高灵敏高选择性进行蛋白含量的绝对定量。生物法合成药物所用的催化酶，是典型的蛋白大分子，要实现其在药物中的痕量检测，HPLC-MS/MS 法可作为可靠方法之一。
附图说明：
图1空白溶液；
图2酶蛋白对照品溶液；
图3系统适应性溶液；
图4供试品溶液。
具体实施方式
下面实施例只为进一步说明本发明技术方案，不以任何形式限制本发明范围。
实施例1
1、色谱条件：
色谱柱： C18（15 cm×4.6 mm，5μm） 流动相 A：0.1%甲酸溶液； 流动相 B：乙腈； 流动相A和流动相B比例为65:35；
柱温：30℃
流速：300µl/min
进样量：20µl 。
2、质谱条件：
鞘气压力：40unit；
辅助气压力：10unit；
电喷雾电压：3200V；
毛细管温度：320℃；
源内诱导解离电压：10V；
Q1，Q3 分辨率：0.7；
碰撞气：高纯氩气；
碰撞气压力：1.2mTorr；
离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)
质谱扫描方式：多反应监测 (MRM)。
3、前处理方法的建立 ：
（1）供试品溶液制备：
酶解采用100mmol/L碳酸氢铵，酶解后用C18固相萃取柱可富集净化目标肽段，其优化的前处理步骤如下：
称定阿莫西林原料0.25g于15ml离心管中，加入500ng同位素内标溶液，加入100mmol/L碳酸氢铵2ml，加入2µl胰酶溶液（1µg/µl），涡旋混合1分钟，37℃水浴酶解15小时；
将酶解液冷却至室温，用C18固相萃取柱（SPE）净化酶解液。SPE柱依次用3ml甲醇、3ml水和3ml 100mmol/L碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液全部过柱，用8ml水淋洗，抽干后用2ml甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹至约0.4ml，最后用0.1%甲酸水定容至0.5ml，过0.22μm有机膜，即得。
（2）对照品溶液制备：
取适量对照品溶液于15ml离心管中，加入500ng同位素内标溶液，加入2ml 100mmol/L碳酸氢铵溶液，加入2µl胰酶溶液（1µg/µl），涡旋混合1分钟，37℃水浴酶解15小时；
将酶解液冷却至室温，用C18固相萃取柱（SPE）净化酶解液。SPE柱依次用3ml甲醇、3ml水和3ml 100mmol/L碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液全部过柱，用8ml水淋洗，抽干后用2ml甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹至约0.4ml，最后用0.1%甲酸水定容至0.5ml，过0.22μm有机膜，即得。
精密量取试剂空白溶液、对照品溶液、供试品溶液各20µl，分别注入液相色谱串联质谱仪，记录色谱图。
实施例2
色谱条件：
色谱柱：C18，推荐Thermo Gold C18（15 cm×4.6 mm，5μm） 流动相 A：0.1%甲酸溶液；流动相 B：乙腈； 流动相A和流动相B比例为65:35；
柱温：28℃
流速：300µl/min
进样量：20µl
其他操作同实话例1。
实施例3
色谱条件：
色谱柱：C18，推荐Thermo Gold C18（15 cm×4.6 mm，5μm） 流动相 A：0.1%甲酸溶液；流动相 B：乙腈； 流动相A和流动相B比例为65:35；
柱温：32℃
流速：300µl/min
进样量：20µl
其他操作同实施例1。
为证明方法可行，对上述方法进行方法学考察，结果如下：
1.专属性：按上述色谱条件进样，结果表明空白溶液与供试品溶液中其他成分未对目标物造成干扰。
2.线性：分别配制青霉素酰化酶线性浓度点LOQ、40%、80%、100%、120%和200%的各浓度混合对照品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制一条标准曲线；
结果表明：酶蛋白在0.4ug/ml~0.8ug/ml浓度范围内，r=0.9954，线性良好。
3.精密度：将青霉素酰化酶对照品溶液连续进样6针，峰面积进样精密度RSD均小于10%，保留时间RSD均小于1.0%，说明系统适应性符合规定。
4.重复性：计算6份加标供试品溶液中各酶蛋白含量的RSD，结果表明各酶蛋白含量的RSD均小于10%，符合规定，重复性良好。
5.回收率：配制各酶蛋白对照的回收率浓度为80%、100%、120%的溶液分别3份，共9份，分别计算各酶蛋白浓度溶液的回收率，结果表明各酶蛋白各浓度的溶液回收率均在80%~120%范围内，RSD（n=9）均小于10%，符合规定，回收率良好。
6.定量限：取上述混合对照品溶液逐级稀释至信噪比S/N≥10时的溶液；
结果：酶蛋白的定量限浓度为0.3936ug/ml；为供试品浓度的0.00015%。
7.检测限：取上述定量限溶液稀释至信噪比S/N≥3时的溶液；
结果：酶蛋白的检测限浓度为0.12ug/ml；为供试品浓度的0. 00005%。
8. 耐用性：设置柱温（±2℃），流速（±0.2ml/min），pH（±0.2），波长（±2nm）
，其余色谱参数不变，每变化1个条件测定回收率。结果表明酶蛋白各浓度回收率均在80%~120%范围内，均符合要求，说明本方法具有良好的耐用性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法采用液相色谱-串联质谱技术检测待测样品中的酶蛋白，所述待测样品为抗生素残留蛋白，所述抗生素残留蛋白通过前处理酶解后形成酶蛋白。
2.根据权利要求1所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述待测样品为发酵类抗生素残留蛋白，该检测方法包括色谱条件、质谱条件、抗生素残留蛋白前处理方法、酶蛋白供试品溶液制备、酶蛋白对照品溶液制备。
3.根据权利要求2所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术，色谱条件为：
色谱柱：C18色谱柱， 流动相 A：甲酸溶液； 流动相 B：乙腈；流动相 A和流动相 B比例为（0.5:1）~（1：0.5）；柱温：25~40℃ 流速：200~400µl/min 进样量：5~20µl。
4.根据权利要求2所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术：质谱条件为：
鞘气压力：35-45unit；
b) 辅助气压力：5-15unit；
c) 电喷雾电压：3200V；
d) 毛细管温度：300~350℃；
e) 源内诱导解离电压：10V；
f) Q1，Q3 分辨率：0.7；
g) 碰撞气：高纯氩气；
h) 碰撞气压力：1.2mTorr；
i） 离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)；
j）质谱扫描方式：多反应监测 (MRM)。
5.根据权利要求2所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述抗生素残留蛋白前处理方法为：酶解溶剂为碳酸氢铵溶液，酶解固相萃取柱富集净化目标肽段。
6.根据权利要求2所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述酶蛋白供试品溶液制备：将酶解液冷却至室温，用固相萃取柱净化酶解液，固相萃取柱依次用甲醇、水和碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液过柱，用水淋洗，抽干后用甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹，最后甲酸水定容，过滤，即得。
7.根据权利要求2所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述酶蛋白对照品溶液制备：
1）取适量对照品溶液于离心管中，加入同位素内标溶液，加入碳酸氢铵溶液，加入胰酶溶液，涡旋混合，水浴酶解；
2）将酶解液冷却至室温，用固相萃取柱净化酶解液，固相萃取柱依次用甲醇、水和碳酸氢铵溶液条件化后，将酶解液过柱，用水淋洗，抽干后用甲醇洗脱并收集，将洗脱液氮吹，最后用甲酸水定容，过滤，即得。
8.根据权利要求3所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术：色谱条件具体为：
色谱柱：C18色谱柱； 流动相 A：0.1%甲酸溶液； 流动相 B：乙腈；流动相 A和流动相B比例为65:35；柱温：30℃ 流速：300µl/min 进样量：20µl。
9.根据权利要求4所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述液相色谱-串联质谱技术：质谱条件为：
鞘气压力：40unit；
b) 辅助气压力：10unit；
c) 电喷雾电压：3200V；
d) 毛细管温度：320℃；
e) 源内诱导解离电压：10V；
f) Q1，Q3 分辨率：0.7；
g) 碰撞气：高纯氩气；
h) 碰撞气压力：1.2mTorr；
i）离子化模式：电喷雾正离子模式(ESI+)；
j）质谱扫描方式：多反应监测 (MRM)。
10.根据权利要求5所述一种酶蛋白检测方法，其特征在于，该检测方法所述抗生素残留蛋白前处理方法为：称定待检测样品入离心管中，加入同位素内标溶液，加入碳酸氢铵溶液，加入胰酶溶液，涡旋混合，32±5℃水浴酶解10-20小时。
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| CN202011198107.3A CN114441652A (zh) | 2020-10-30 | 2020-10-30 | 一种酶蛋白检测方法 |
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| CN (1) | CN114441652A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115248270A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-10-28 | 葵花药业集团(衡水)得菲尔有限公司 | 一种阿莫西林中蛋白酶残留含量的检测方法 |
-
2020
- 2020-10-30 CN CN202011198107.3A patent/CN114441652A/zh active Pending
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