CN114324626B - 一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段及方法。特征肽段的氨基酸序列如下：GIYQTSNFR。本发明使用蛋白酶将新冠病毒刺突蛋白酶解为若干小分子肽段后，通过酶解产生的特异性肽段对蛋白含量进行测定。酶解产生的特征肽段为新型冠状病毒刺突蛋白所特有，便于识别与检测。并且以特征肽段标准品为参考，可以直接测量样品中的新冠病毒刺突蛋白的摩尔浓度和含量。本发明报道的方法只需以特征肽段标准品为参考进行测量，检测过程简单，结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段及方法。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，severe acute respiratory syndrome coronavirus2)为单链RNA病毒，属于冠状病毒科β属，有囊膜，包含4个主要结构蛋白：刺突蛋白 (S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、囊膜蛋白(E蛋白)及核衣壳蛋白(N蛋白)。其中，刺突蛋白为最主要的表面抗原，会被宿主蛋白酶完全或部分裂解为S1及S2亚基 (Lu,R.,Zhao,X.,Li,J.,Niu,P.,Yang,B.,Wu,H.,et al.(2020).Genomic characterisation and epidemiology of2019novel coronavirus:implications for virus origins and receptorbinding.Lancet 395(10224),565-574.doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8.)。 SARS-CoV-2通过刺突蛋白的S1亚基结合血管紧张转化酶2(Angiotensin converting enzyme2，ACE2)进入人的粘膜细胞，可以感染各个年龄阶段的人群，并能通过飞沫和间接接触在人与人之间传播。SARS-CoV-2感染后病程经历潜力期、前驱期、发病期及转归期，平均潜伏期为5.2天，有的可长达14天，无症状感染者同样具备传染性，这些特征使得SARS-CoV-2具有极高的传染性。
现有的新型冠状病毒刺突蛋白检测主要依赖酶联免疫吸附法等免疫学方法，通过制备具有特异性的抗体对刺突蛋白含量进行检测。酶联免疫吸附法的检测步骤包括抗体包被，封闭，上样，检测抗体孵育等。整个过程主要依赖抗体对刺突蛋白进行识别与信号生成，其缺点主要包括：1.抗体特异性难以保证，对于序列相近的蛋白，即使单克隆抗体也难以保证特异性，特异性验证过程繁琐，所需的材料收集困难；2.抗体研制周期长，因为多克隆抗体特异性往往较差，免疫检测通常使用单克隆抗体，而单克隆抗体制备过程包括抗原制备、动物免疫、细胞融合及筛选、腹水生产等，耗时长，难以在短时间内建立稳定、准确的检测方法；3.不同厂商产品间差异大，不同厂商研制的试剂盒所使用的抗体及配方各不相同，检测范围、灵敏度以及特异性都会有一定差异；4.线性范围较窄，线性范围仅为102左右，对于未知浓度的样品不得不进行多次试验；5.浓度检测依赖蛋白标准样品，酶联免疫吸附法经过多级的信号放大，检测信号无法直接换算成样品中的浓度，检测时需要以新冠病毒刺突蛋白标准样品为参考才能计算样品中刺突蛋白浓度。
近年来，液相色谱-质谱联用技术在蛋白检测方面逐渐受到重视，质谱检测具有高通量、高特异性、高准确度等特点，适用于生物基质中的蛋白定量检测。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段及方法。
一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段，其氨基酸序列如下：GIYQTSNFR。
一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的同位素标记肽段，其氨基酸序列如下： GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个13C，1个15N。
本发明又提供了一种非医学诊断为目的的用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的方法，包括以下步骤：
(1)按照适当比例混合特征肽段标准品与同位素标记肽段，配置标准溶液，并向待测样品中加入适量的同位素标记肽段，
其中，特征肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNFR，
同位素标记肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个13C，1个15N；
(2)使用蛋白酶进行酶切处理，将新型冠状病毒刺突蛋白酶解成若干肽段；
(3)采用液相色谱-质谱联用系统进行待测样本及标准溶液分析，根据标准溶液的数据建立标准曲线，计算待测样品中酶解后特征肽段的含量，并换算得到待测样品中新冠病毒刺突蛋白的含量。
本发明方法可以用于非医学诊断为目的的检测，比如，实验室内样品的检测等。
优选的，步骤(2)酶切时，使用变性剂对待测样品中蛋白质进行变形处理，变性剂为占反应体系体积比30％的乙腈或占反应体系质量比0.1％的RapiGest SF。
优选的，步骤(2)酶切时，使用的蛋白酶为胰蛋白酶。更优选的，酶切处理使用的缓冲体系为50mM Tris-HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。更优选的，步骤(2)酶切时，每隔4～8小时补充一次胰蛋白酶，37℃条件下连续酶切48小时。
优选的，步骤(3)建立标准曲线时，以特征肽段与同位素标记肽段的峰面积比值为横坐标，特征肽段与同位素标记肽段的质量比为纵坐标，建立标准曲线。
本发明使用蛋白酶将新冠病毒刺突蛋白酶解为若干小分子肽段后，通过酶解产生的特异性肽段对蛋白含量进行测定。酶解产生的特征肽段为新型冠状病毒刺突蛋白所特有，便于识别与检测。并且以特征肽段标准品为参考，可以直接测量样品中的新冠病毒刺突蛋白的摩尔浓度和含量。本发明报道的方法无需刺突蛋白标准品，仅以特征肽段标准品为参考进行测量，检测过程简单，结果准确，特征肽段的标准品与蛋白标准品相比，价格低，制备简单，便于保存。
附图说明
图1为不同蛋白变性剂条件下酶解结果示意图，其中，A：不同变性剂条件下反应8小时后通过特征肽段T6检测的蛋白含量结果；B：不同变性剂条件下反应8小时后通过特征肽段T11检测的蛋白含量结果；图中***表示P<0.001，**表示P<0.01，* 表示P<0.05(下同)。
图2为不同缓冲条件下蛋白酶解结果示意图，其中，A：不同缓冲体系下反应8 小时后通过特征肽段T6检测的蛋白含量结果；B：不同缓冲体系下反应8小时后通过特征肽段T11检测的蛋白含量结果。体系1：50mM Tris-HCl，pH＝7.6；体系2：50mM Tris-HCl，10mMCaCl2，pH＝7.6；体系3：50mM Tris-HCl，pH＝8.0；体系4：50mM Tris-HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。
图3为不同反应时间下蛋白酶解结果示意图。
图4为不同蛋白酶条件下酶解结果示意图，其中，A：不同蛋白酶条件下反应8 小时后通过特征肽段T6检测的蛋白含量结果；B：不同蛋白酶条件下反应48小时后通过特征肽段T11检测的蛋白含量结果。
图5为特异性结果质谱图，其中，A：BSA胰蛋白酶水解产物在m/z：543.26>458.22条件下的检测结果；B：细胞提取液胰蛋白酶水解产物在m/z：543.26>458.22条件下的检测结果；C：新冠病毒刺突蛋白胰蛋白酶水解产物在m/z：543.26>458.22条件下的检测结果。
图6为特征肽段以及同位素标记肽段的线性回归示意图。
具体实施方式
实施例1：新冠病毒刺突蛋白酶解产物分析
1.材料
新冠病毒刺突蛋白标准物质由中国计量大学研制。L-亮氨酸、L-苯丙氨酸国家标准物质购自中国计量科学研究院。
胰蛋白酶购自普洛麦格生物技术有限公司。C18固相萃取柱购自沃特世生物有限公司。
特征肽段由杭州中肽生化有限公司合成。
2.方法
2.1胰蛋白酶水解：称取新型冠状病毒刺突蛋白30mg，与8M尿素溶液按1∶3 比例混合后，95℃水浴过夜。然后加入水和Tris-HCl缓冲液(pH＝7.6)，至尿素终浓度1M，Tris-HCl终浓度50mM。最后加入10μL胰蛋白酶溶液，37℃恒温孵育过夜。反应完成后加入10％甲酸至终浓度为1％终止反应。
2.2多肽纯化：取若干C18固相萃取小柱，通过重力法进行萃取。先后加入600μL 乙腈，600μL 50％乙腈水溶液，1800μL 2％乙腈、0.1％甲酸水溶液，胰蛋白酶水解液， 1800μL2％乙腈、0.1％甲酸水溶液。然后将固相萃取小柱转移至新的15mL离心管中，并加入600μL80％乙腈、0.1％甲酸水溶液进行洗脱。洗脱得到的溶液经离心真空浓缩后复溶在2％乙腈、0.1％甲酸水溶液中，使用0.22μm尼龙膜过滤后即为待上样样品。
2.3液质联用检测：通过液相色谱-质谱联用仪对待上样样品进行检测，首先通过data dependent模式对水解产物进行初步分析。然后根据筛选的特征肽段信息人工合成相应的特征肽段纯品，进行参数优化。优化参数完成后，将样品梯度稀释成若干浓度，分析各特征肽段的灵敏度。色谱条件为，色谱柱：Waters CORTECS_T3 2.7μm， 2.1×150mm。流动相：A相0.1％甲酸-乙腈；B相：0.1％甲酸-水。程序：0min，14％A∶ 86％B；1min，14％A∶86％B；4min，42％A∶58％B；5min，14％A∶86％B；8min， 14％A∶86％B。流速：0.2mL·min-1；进样量10μL。
3.结果
根据检测结果，并未发现与特征肽段SARS_CoV_2_S_T8相符的检测信号，推测可能是因为该肽段上存在N糖基化或其他修饰。其他特征肽段中，SARS_CoV_2_S_T3、 SARS_CoV_2_S_T6、SARS_CoV_2_S_T9、SARS_CoV_2_S_T11的信号较强，因此着重围绕SARS_CoV_2_S_T6(简称T6)与SARS_CoV_2_S_T11(简称T11)进行进一步研究。详细结果如下表1所示。
表1
实施例2：新冠病毒刺突蛋白水解条件优化
1.材料
新冠病毒刺突蛋白标准物质由中国计量大学研制。L-亮氨酸、L-苯丙氨酸国家标准物质购自中国计量科学研究院。
胰蛋白酶购自普洛麦格生物技术有限公司。C18固相萃取柱购自沃特世生物有限公司。
特征肽段和同位素标记肽段由杭州中肽生化有限公司合成。
同位素标记肽段分别为GIYQTSNF(13C9,15N)R和FL(13C6)PFQQFGR。前者的第8位苯丙氨酸F为同位素标记，同位素标记方式为9个13C和1个15N；后者的第2位亮氨酸L为同位素标记，同位素标记方式为6个13C。
2.方法
2.1蛋白质变性剂选择：在胰蛋白酶酶解体系中分别加入1M尿素，0.1％RapiGestSF(终浓度，质量比，下同)或30％乙腈(终浓度，体积比，下同)作为蛋白变性剂，然后立即在50mM Tris-HCl，pH＝7.6缓冲条件下37℃反应8小时后进行检测。反应完成后立即加入10％甲酸(体积比，下同)至终浓度为1％。多肽纯化步骤及液相条件与实施例1所述相同。质谱检测采用多反应检测扫描(Multi reaction monitoring)模式，SARS_CoV_2_S_T6定量离子对信息：543.261>458.223，SARS_CoV_2_S_T6同位素内标定量离子对信息：548.261>463.223，SARS_CoV_2_S_T11定量离子对信息： 570.330>879.492，SARS_CoV_2_S_T11同位素内标定量离子对信息：573.330>879.492。
2.2缓冲条件优化：以30％乙腈作为变性剂，分别在以下缓冲条件下进行酶解反应：(1)50mM Tris-HCl，pH＝7.6；(2)50mM Tris-HCl，10mM CaCl2，pH＝7.6；(3) 50mMTris-HCl，pH＝8.0；(4)50mM Tris-HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。37℃反应8小时后进行检测。反应完成后加入10％甲酸至终浓度为1％。多肽纯化及液质联用检测方法与2.1所述相同。
2.3反应时间优化：以30％乙腈作为变性剂，缓冲条件为50mM Tris-HCl，10mMCaCl2，pH＝8.0。37℃恒温反应，并每隔4～8小时补充5μL胰蛋白酶。分别反应2、8、 16、24、48、72、168小时后，加10％甲酸适量至终浓度约为1％。多肽纯化及液质联用检测方法与2.1所述相同。
2.4蛋白酶选择：以30％乙腈作为变性剂，缓冲条件为50mM Tris-HCl，10mMCaCl2，pH＝8.0，反应时间48小时。分别选择胰蛋白酶(测序级)、胰蛋白酶与赖氨酰内切酶混合物(测序级)用于蛋白酶切。反应完成后，加10％甲酸适量至终浓度约为 1％。多肽纯化及液质联用检测方法与2.1所述相同。
3.结果
3.1蛋白质变性剂选择
蛋白变性剂可以促进蛋白将酶切位点暴露，从而加快蛋白酶酶切反应。检测结果如图1所示。结果表明，0.1％RapiGest SF或30％乙腈作为变性剂时，酶切效率较好，显著高于1M尿素作为变性剂时的酶切效率。考虑到RapiGest SF为沃特世公司产品，价格较贵，推荐使用30％乙腈作为变性剂。
3.2缓冲条件优化
pH及CaCl2的存在都会影响胰蛋白酶的酶切效率及稳定性，本实验目的为筛选30％乙腈条件下的最佳缓冲液体系。检测结果如图2所示。结果表明，pH变化对胰蛋白酶的酶切效率影响不大，CaCl2存在条件下大大提高了胰蛋白的酶切效率。最后选择缓冲液条件为50mM Tris-HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。
3.3反应时间优化
对反应时间进行优化，不同时间下蛋白酶解结果如图3所示。在0到8小时内，新冠病毒刺突蛋白的酶解产物快速上升。8到48小时上升趋势逐渐变缓，在48小时达到最高值。48到168小时检测结果基本不变。综上所述，选择48小时作为最佳反应时间。
3.4蛋白酶选择
对于部分序列较为特殊的切割位点(如赖氨酸后出现脯氨酸或碱性氨基酸)，胰蛋白酶会出现漏切的现象，导致定量结果不准确。赖氨酰内切酶Lys-C也可以在赖氨酸的C端进行切割，加入赖氨酰内切酶可以更好的避免漏切出现。
结果表明，是否添加赖氨酰内切酶对检测结果没有影响，说明胰蛋白酶可以在特征肽段两端进行高效切割，不需要额外添加赖氨酰内切酶。检测结果见图4。
实施例3：新冠病毒刺突蛋白定量
1.材料
新冠病毒刺突蛋白标准物质由中国计量大学研制。L-亮氨酸、L-苯丙氨酸国家标准物质购自中国计量科学研究院。
胰蛋白酶购自普洛麦格生物技术有限公司。C18固相萃取柱购自沃特世生物有限公司。
特征肽段和同位素标记肽段由杭州中肽生化有限公司合成。
2.方法
2.1母液准备：将氨基酸标准样品在105℃烘箱中敞口烘干4小时，取出后立即盖上盖子并在干燥盒中冷却。将氨基酸内标、特征肽段与同位素标记肽段在相对湿度为 50％，气温为25℃的环境下敞口平衡2小时。然后在天平上各准确称量约20mg样品，溶于20mL水中，作为母液4℃保存。
2.2氨基酸标准曲线配制：精密称取亮氨酸与苯丙氨酸标准品及内标母液适量，按质量比配成一系列浓度的标准曲线工作液，混匀待用。
2.3基于氨基酸分析的同位素稀释质谱法分析：精密称量特征肽段溶液约30mg，氨基酸混合内标工作液约100mg，加入安瓿瓶中。离心真空干燥后加入8mol/L盐酸，氮吹1分钟去除安瓿瓶中的空气后焰封封口。在120℃恒温反应48小时后取出，氮吹吹干，复溶于1mL的2％乙腈溶液中。
2.4氨基酸分析的同位素稀释质谱法检测条件：色谱条件：色谱柱：WatersCORTECS_T3 2.7μm，2.1x150mm。流动相：A相0.1％甲酸-乙腈；B相：0.8％甲酸- 水。程序：0～8min，2％A∶98％B。流速：0.2mL·min-1进样量10μL。质谱条件：电喷雾离子源；检测方式：正离子；毛细管电压：3500V；锥孔电压：50V；去溶剂温度： 350℃；离子源温度：150℃；锥孔气：150L·hour-1；去溶剂气：800L·hour-1；母离子质量扫描范围m/z 500～4000；分辨率：1000；亮氨酸/异亮氨酸定量离子对：m/z 131.95>85.92；亮氨酸内标定量离子对：m/z138.96>91.93；苯丙氨酸定量离子对：m/z 165.93>119.93；苯丙氨酸内标定量离子对：m/z175.94>128.93。
2.5特征肽段标准曲线配置：精密称取特征肽段与同位素标记肽段母液适量，按质量比配成一系列标准曲线工作液，混匀待用。
2.6新冠病毒刺突蛋白检测：精密称量刺突蛋白样品30mg，内标工作液45mg，加入酶解缓冲液(500mmol/L Tris-HCl+100mmol/L CaCl2，pH＝8.0)20μL，乙腈60μL，最后加入10μL反应酶，用水补足体系到200μL，于37℃，转速200r·min-1的摇床上反应48小时。反应完成后，加10％甲酸适量至终浓度约为1.0％。多肽纯化步骤及液相条件与实施例1所述相同。质谱检测采用多反应检测扫描(Multireaction monitoring) 模式，SARS_CoV_2_S_T3定量离子对信息：612.823＞868.412，SARS_CoV_2_S_T5定量离子对信息：549.873＞722.481，SARS_CoV_2_S_T6定量离子对信息： 543.261＞458.223，SARS_CoV_2_S_T6同位素内标定量离子对信息：548.261＞463.223， SARS_CoV_2_S_T9定量离子对信息：450.236＞587.338，SARS_CoV_2_S_T11定量离子对信息：570.330＞879.492，SARS_CoV_2_S_T11同位素内标定量离子对信息： 573.330＞879.492。
3.结果
3.1特征肽段标准品纯度检测
首先计算特征肽段标准品中的肽段纯度Ppeptide，计算公式如下：
式中：
Ppeptide——特征肽段标准品中的肽段纯度；
Raa——氨基酸与其同位素内标的峰面积比值；
aaa——峰面积比值与质量比值的回归曲线的截距；
baa——峰面积比值与质量比值的回归曲线的斜率；
miso——检测样品中加入的同位素内标混合液的质量；
mpeptide——检测样品中加入的特征肽段标准品的质量；
cstd——氨基酸标准物质的母液浓度；
Paa——氨基酸标准物质的纯度；
Mrpeptide——特征肽段的分子量；
MTaa——氨基酸的分子量；
Zaa——特征肽段中目标氨基酸的数量。
根据计算结果，SARS_CoV_2_S_T3特征肽段标准品的纯度为754mg/g， SARS_CoV_2_S_T5特征肽段标准品的纯度为829mg/g，SARS_CoV_2_S_T6特征肽段标准品的纯度为847mg/g，SARS_CoV_2_S_T10特征肽段标准品的纯度为816mg/g，SARS_CoV_2_S_T11特征肽段标准品的纯度为783mg/g。
3.2新冠病毒刺突蛋白含量检测
将特征肽段标准品配置成若干浓度溶液，然后加入适量同位素标记肽段，配置成标准曲线。使用高效液相色谱-质谱联用仪对待测样品及标准曲线进行检测。结果计算公式如下：
式中：
ws——新冠病毒刺突蛋白在待测样品中的质量分数；
Rpeptide——特征肽段与同位素标记肽段的峰面积比值；
apeptide——峰面积比值与质量比值的回归曲线的截距；
bpeptide——峰面积比值与质量比值的回归曲线的斜率；
miso——制备样品中加入的同位素标记肽段溶液的质量；
mS——制备样品中加入的待测样品的质量；
cstd——特征肽段标准品的母液浓度；
Ppeptide——特征肽段标准品中的肽段纯度；
Mrpeptide——特征肽段的分子量；
MrS——新冠病毒刺突蛋白的分子量；
根据计算，使用不同特征肽段检测样品中新冠病毒刺突蛋白含量的结果如表2所示。根据新冠病毒刺突蛋白标准物质定值结果，其含量应为0.987±0.062mg/g。等效度小于1表示两者的结果相符。SARS_CoV_2_S_T6特征肽段检测结果与标准物质相符，但是SARS_CoV_2_S_T11以及其他特征肽段的检测结果显著高于标准物质的标称值，推测可能因为出现非特异的降解导致的。因此，综上所述，SARS_CoV_2_S_T6更加适合用于新冠病毒刺突蛋白含量鉴定。
表2 不同特征肽段检测结果
实施例4：线性、精密度及特异性考察
1.材料
新冠病毒刺突蛋白标准物质由中国计量大学研制。
特征肽段和同位素标记肽段由杭州中肽生化有限公司合成。
HAEC细胞由中国计量大学保存，蛋白提取液购自赛默飞世尔生物技术有限公司M-PERTM Mammalian Protein Extraction Reagent。
BSA标准物质购自中国计量科学研究院。
胰蛋白酶购自普洛麦格生物技术有限公司。C18固相萃取柱购自沃特世生物有限公司。
2.方法
2.1BSA标准物质母液：将标准样品在105℃烘箱中敞口烘干4小时，取出后立即盖上盖子并在干燥盒中冷却。在天平上准确称量约20mg样品，溶于20mL水中，作为母液4℃保存。
2.2细胞中可溶蛋白提取：取正常生长HAEC细胞，弃去细胞培养基后用PBS缓冲液清洗1次。然后加入适量的M-PER蛋白提取液，室温处理15分钟后将蛋白提取液转移至离心管中，12 000rpm离心10分钟，取上清得细胞提取液。
2.3特异性分析：分别精密称量BSA标准物质母液、新冠病毒刺突蛋白标准物质与细胞提取液各30mg，每份样品中加入特征肽段内标工作液45mg，加入酶解缓冲液(500mmol/L Tris-HCl+100mmol/L CaCl2，pH＝8.0)20μL，乙腈60μL，最后加入10μL 反应酶，用水补足体系到200μL，于37℃，转速200r·min-1；的摇床上反应48小时。反应完成后，加10％甲酸适量至终浓度约为1.0％。
2.4线性分析：精密称取特征肽段及其内标母液适量，按质量比配成一系列标准曲线工作液，混匀待用。根据建立的检测方法进行分析，以特征肽段与同位素标记肽段的峰面积比值为横坐标，特征肽段与同位素标记肽段的质量比为纵坐标，建立标准曲线。
2.5精密度分析：配置高(1mg/g)、中(0.1mg/g)、低(0.01mg/g)三种浓度的新冠病毒刺突蛋白样品，每个浓度制作5个反应样品，连续操作三天，计算每个浓度的日内与日间精密度。
2.6基质效应分析：配置高(1mg/g)、中(0.1mg/g)、低(0.01mg/g)三种浓度的新冠病毒刺突蛋白样品。每个浓度反应样品制备如下：精密称量新冠病毒刺突蛋白样品30mg，内标工作液45mg，细胞提取液15mg，加入酶解缓冲液(500mmol/L Tris-HCl+100mmol/LCaCl2，pH＝8.0)30μL，乙腈90μL，最后加入15μL反应酶，用水补足体系到300μL，于37℃，转速200r·min-1的摇床上反应48小时。
2.7多肽纯化步骤及液相条件与实施例1所述相同。质谱检测采用多反应检测扫描(Multi reaction monitoring)模式，SARS_CoV_2_S_T6定量离子对信息： 543.261>458.223，SARS_CoV_2_S_T6同位素内标定量离子对信息：548.261>463.223。
3.结果
3.1特异性图谱显示此方法特异性良好。结果见图5。
3.2线性特征肽段在0.47ng/g～1mg/g范围内，回归相关系数R2＞0.9999，线性良好。回归曲线见图6。
3.3精密度高、中、低三个浓度样品的日内、日间精密度均小于5％，数据见表3、表4。
表3 日内精密度数据表
表4 日间精密度数据表
表5 基质效应数据表
3.4基质效应高、中、低三个浓度基质效应结果分别为101.07％、98.93％、86.90％，数据见表5。
序列表
<110> 中国计量大学
杭州博度计量科技有限公司
<120> 一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段及方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 1
Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 2
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 3
Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 4
Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 5
Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 6
Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 7
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 8
Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg
1 5
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)
<400> 9
Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg
1 5 10
Claims (8)
1.一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的特征肽段，其氨基酸序列如下：GIYQTSNFR。
2.一种用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的同位素标记肽段，其氨基酸序列如下：GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个13C，1个15N。
3.一种非医学诊断为目的的用于新型冠状病毒刺突蛋白含量检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照适当比例混合特征肽段标准品与同位素标记肽段，配置标准溶液，并向待测样品中加入适量的同位素标记肽段，
其中，特征肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNFR，
同位素标记肽段氨基酸序列如下：GIYQTSNF*R，其中F*为同位素标记的苯丙氨酸，同位素标记方式为9个13C，1个15N；
(2)使用蛋白酶进行酶切处理，将新型冠状病毒刺突蛋白酶解成若干肽段；
(3)采用液相色谱-质谱联用系统进行待测样本及标准溶液分析，根据标准溶液的数据建立标准曲线，计算待测样品中酶解后特征肽段的含量，并换算得到待测样品中新冠病毒刺突蛋白的含量。
4.如权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)酶切时，使用变性剂对待测样品中蛋白质进行变形处理，变性剂为占反应体系体积比30％的乙腈或占反应体系质量比0.1％的RapiGest SF。
5.如权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(2)酶切时，使用的蛋白酶为胰蛋白酶。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，酶切处理使用的缓冲体系为50mM Tris-HCl，10mM CaCl2，pH＝8.0。
7.如权利要求5所述方法，其特征在于，步骤(2)酶切时，每隔4～8小时补充一次胰蛋白酶，37℃条件下连续酶切48小时。
8.如权利要求3所述方法，其特征在于，步骤(3)建立标准曲线时，以特征肽段与同位素标记肽段的峰面积比值为横坐标，特征肽段与同位素标记肽段的质量比为纵坐标，建立标准曲线。
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