CN113155991A - 一种全自动在线萃取超高效液相色谱串联质谱联用快速测定水中磺胺类抗生素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全自动在线萃取超高效液相色谱串联质谱联用快速测定水中磺胺类抗生素的方法，属于分析检测技术领域。本发明通过特定全自动在线固相萃取条件配合特定超高效液相色谱串联质谱联用条件，实现了样品富集、净化、分离和测定全自动化分析水中15种磺胺类抗生素。本发明方法方便、高效、快速，样品仅需过滤后由仪器自动完成所有分析步骤，实现了全自动化操作，全部测定时间仅需17min，检出限达到ng/L级，通过甲醇/纯水净化在线固相小柱的方式，克服了复杂基质样品分析中常见的基质效应问题，满足了水中磺胺类抗生素的超痕量检测要求。

Description

一种全自动在线萃取超高效液相色谱串联质谱联用快速测定 水中磺胺类抗生素的方法
技术领域
本发明具体涉及一种全自动在线萃取超高效液相色谱串联质谱联用快速测定水中磺胺类 抗生素的方法，属于分析检测技术领域。
背景技术
自1929年发现青霉素并用于临床以来，已有百余种抗生素被开发利用，它们对治疗感染 性疾病发挥了巨大作用，有效地保障了人类的生命和健康。另外，抗生素还被大量用于畜牧 业和水产养殖业防治感染性疾病，并用作抗菌生长促进剂加快动物的生长。根据其结构与性 质的不同，抗生素可分为磺胺类、喹诺酮类、大环内脂类、β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环 素类、多肽类、氯霉素类以及其它抗生素。抗生素类物质由于其使用量大，来源广泛且难于 降解，多数属于持久性污染物，当其进人自然环境后，就会对水环境造成持久性污染。因此， 开发水环境中抗生素含量的检测新技术，对于正确评估水体抗生素污染的程度，为环境管理 提供技术支持和数据支撑具有重要的现实意义。
目前，水环境中抗生素的测定方法主要分为微生物法、酶联免疫吸附法(ELISA)、毛细管 电泳法(CE)、高效液相色谱法(HPLC-UV)和液相色谱串联质谱联用法(LC-MS/MS)。微生物检测法所用时间较长，敏感性差，易受其他抗生素干扰。酶联免疫吸附法抗体制备不易，监测时间长，且假阳性出现概率大。毛细管电泳技术虽然具有高效、快速、分离模式多等优势，但是抗生素所带电荷的多少和正负均随环境条件而发生改变，导致了其重现性较差， 目前在抗生素类物质检测领域应用并不是很多。高效液相色谱法是目前检测抗生素常用的分 析方法之一，也是我国饲料中磺胺类抗生素检测的国家标准方法(GB/T 19542-2007)，但是 该方法灵敏度低，因此在定性定量上都存在困难，无法满足水环境中痕量测定的要求。此外， 紫外、二极管阵列和荧光质谱检测器仅能用于特定结构的抗生素类检测，局限性较大。而质 谱检测器则不存在类似问题，因此质谱检测器更适用于不同种类的抗生素检测。国内近年来 出台的抗生素标准均以液相色谱串联质谱联用法来进行测定，如《化妆品中8种磺胺类抗生 素的测定液相色谱-串联质谱法》(DB37/T 3029-2017)，《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留 量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20759-2006)、《猪粪中抗生素残留量检测方法液 相色谱-质谱/质谱法》(DB12/T 952-2020)和《口腔卫生产品中十三种抗生素药物的检测方 法液相色谱-质谱/质谱法》(SN/T 3645-2013)。美国环保署于2007年公布了高效液相色谱 质谱联用法测定水、土壤、沉积物、生物固体中的药物和个人护理品的的标准方法《Method 1694:Pharmaceuticals and Personal Care Products inWater,Soil,Sediment,and Biosolids by HPLC/MS/MS》并沿用至今。由于水环境中的抗生素含量较低，其水体浓度普遍处于痕量及 微量水平，需要高效的分析方法，以获得更高的选择性和灵敏度，从而能够准确地测定抗生 素的残留。水环境中抗生素样品预处理通常使用固相萃取法、固相微萃取和液液萃取法，纯 化和浓缩分析物，从而获得灵敏、重复性更好的结果。但是上述前处理方法，均需要人工进 行萃取实验，工作量较大，前处理及分析测试时间较长。
发明内容
为了解决上述问题，本发明构建了一种方便、高效、快速测定水中磺胺类抗生素的检测 方法。
全自动在线萃取超高效液相色谱串联质谱联用法不仅要考虑样品富集，固相萃取柱活化、 净化和清洗，同时还需要考虑到液相色谱流动相洗脱条件对富集小柱洗脱效率的影响，在开 发方法时需要同时考虑全自动在线萃取、液相色谱和串联质谱仪三种设备的条件优化，方法 开发过程比普通萃取方法和液相色谱方法更为复杂。目前全自动在线固相萃取超高效液相色 谱串联质谱联用测定水中16种磺胺类抗生素类物质，特别是处理基质较为复杂的样品在国内 外尚无报道。
本发明的目的在于提供一种快速检测水中磺胺类抗生素的方法，所述方法包括如下过程：
将样品通过在线固相萃取柱进行固相萃取富集，待固相萃取富集结束后，在通过高效液 相色谱进行洗脱分离，结合联用的质谱对磺胺类抗生素进行检测。
在本发明的一种实施方式中，所述在线固相萃取柱进行固相萃取富集时的流动相条件为：
初始流动相为A所占比例为100％；0.5min～4.5min流动相为A所占比例为99.0％，流动 相B所占比例为1.0％；4.5min～7.5min流动相C所占比例为100％；7.5min～13min流动相为A 所占比例为100％；
其中，流动相A为含1％甲酸的超纯水溶液，流动相B为含1％甲酸的甲醇，流动相C为甲醇/丙酮/正己烷(1:1:1)。
在本发明的一种实施方式中，所述在线固相萃取柱进行固相萃取富集时的流动相流速设 置为：0min～3.5min流动相流速为2.0mL/min，3.5min～4.5min流动相流速为0.01mL/min， 4.5min～7.5min流动相流速为2.0mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述高效液相色谱进行洗脱分离时的流动相条件为：
流动相A1和流动相B1按比例混合，初始流动相A1为所占比例为95％；4.5min～13.5min 流动相B1所占比例从5％升至95％；13.5min～14.5min流动相B1所占比例为95％；14.5min～16.0min流动相为A1所占比例从5％升至95％；16.0min～17.0min流动相为A1所占比 例为95％；
其中，所述流动相A1为含0.1％甲酸的超纯水溶液，流动相B1为乙腈溶液。
在本发明的一种实施方式中，所述高效液相色谱进行洗脱分离时的流动相流速设置为： 0min～4.5min流动相流速为0.1mL/min，4.5min～17.0min流动相流速为0.4mL/min。
在本发明的一种实施方式中，所述在线固相萃取柱为Oasis HLB(2.1×30mmi.d.，20μm)。
在本发明的一种实施方式中，所述在线固相萃取柱进行固相萃取富集时的上样体积 0.5～5mL。
在本发明的一种实施方式中，所述高效液相色谱进行洗脱分离时的色谱柱为Acquity BEH130(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)为液相色谱柱；色谱柱柱温为40℃。
在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括：
利用上述方法，检测一系列浓度的磺胺类抗生素标准溶液，获得峰面积值，将峰面积与 相应磺胺类抗生素标准溶液的浓度构建标准曲线。
在本发明的一种实施方式中，所述检测方法具体包括如下步骤为：
(1)水样滤膜过滤：采集水样并经滤膜过滤；
(2)调节样品pH值：过滤后样品中加入甲酸调节其pH值；
(3)样品经自动进样器注入在线固相萃取小柱，进行固相萃取富集；
(4)固相萃取富集结束后待测物经超高效液相色谱流动相洗脱和色谱柱分离，采用串联 质谱仪测定。
在本发明的所述步骤(1)中，水样经0.22μm孔径的聚偏氟乙烯滤膜过滤。
在本发明的所述步骤(2)中，加入甲酸调节其pH值，调节pH值至2～3。
在本发明的所述步骤(3)中，样品经自动进样器取样0.5mL～5.0mL注入在线固相萃取 小柱进行富集，在线萃取条件为：以Oasis HLB(2.1×30mm i.d.，20μm)为全自动在线固相萃 取小柱，上样体积0.5～5mL，流动相A、流动相B和流动相C按比例混合，初始流动相为A 所占比例为100％；0.5min～4.5min流动相为A所占比例为99.0％，流动相B所占比例为1.0％； 4.5min～7.5min流动相C所占比例为100％；7.5min～13min流动相为A所占比例为100％。0min～3.5min流动相流速为2.0mL/min，3.5min～4.5min流动相流速为0.01mL/min，4.5min～7.5min流动相流速为2.0mL/min。
所述流动相A为含1％甲酸的超纯水溶液，流动相B为含1％甲酸的甲醇，流动相C为甲醇/丙酮/正己烷(体积比1:1:1)。
在本发明的所述步骤(4)中，固相萃取富集结束后待测物经超高效液相色谱流动相洗脱 和色谱柱分离，采用串联质谱仪测定。超高效液相色谱流动相洗脱和色谱柱分离条件为：以 Acquity BEH130(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)为液相色谱柱，色谱柱柱温为40℃，流动相 A1和流动相B1按比例混合，初始流动相A1为所占比例为95％；4.5min～13.5min流动相B1所占比例从5％升至95％；13.5min～14.5min流动相B1所占比例为95％；14.5min～16.0min流 动相为A1所占比例从5％升至95％；16.0min～17.0min流动相为A1所占比例为95％。 0min～4.5min流动相流速为0.1mL/min，4.5min～17.0min流动相流速为0.4mL/min。
所述流动相A1为含0.1％甲酸的超纯水溶液，流动相B1为乙腈溶液。
本发明的优点和效果：
1.本发明提供一种方便、高效、快速测定水中磺胺类抗生素的检测方法。
2.通过在线固相萃取小柱，实现水中磺胺类抗生素的快速富集，整个富集时间仅需要4 min，并通过甲醇/水清洗固相萃取小柱，除去基质干扰，提高了检测灵敏度。
3.通过优化液相色谱条件，将不同磺胺类抗生素进行分离，满足分析监测的要求。
4.通过在线固相萃取小柱与超高效液相色谱串联质谱联用，样品仅需过滤后由仪器自动 完成所有分析步骤，实现了全自动化操作，全部测定时间仅需17min，检出限达到ng/L级， 由于自动化运行，重现性精密度均好于传统手工前处理方法，减少了人为操作所带来的误差。
5.通过自动站水泵抽水及过滤，可实现自动站实时在线监测点位监测水中磺胺类抗生素。
附图说明
图1为如下磺胺类抗生素的色谱图：磺胺类抗生素标准物质色谱图：(a)磺胺吡啶；(b)磺 胺甲基嘧啶；(c)磺胺噻唑；(d)磺胺二甲基嘧啶；(e)磺胺甲噻二唑；(f)磺胺间甲氧嘧啶。
图2为如下磺胺类抗生素的色谱图：(g)磺胺甲氧嗪；(h)磺胺对甲氧嘧啶；(i)磺胺氯 哒嗪；(j)磺胺间/邻二甲氧嘧啶；(k)磺胺甲恶唑；(l)磺胺异恶唑。
图3为如下磺胺类抗生素的色谱图：(m)磺胺喹恶啉；(n)磺胺二甲氧嘧啶；(o)磺胺苯 吡唑。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是 本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没 有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技 术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个 相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及 的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
(一)试剂配置：
甲酸：98％甲酸
流动相A：含1％甲酸的超纯水溶液
流动相B：含1％甲酸的甲醇
流动相C：甲醇/丙酮/正己烷(体积比为1:1:1)
流动相A1：含0.1％甲酸的超纯水溶液
流动相B1：乙腈溶液。
(二)样品处理：
(1)取水样经0.22μm孔径的聚偏氟乙烯滤膜过滤，如果水样颗粒物较多，可以采用先 6000rmp离心10min，取上清液后滤膜过滤方式将颗粒物去除。
(2)加入甲酸调节其pH值，调节pH值至2～3，放入样品瓶中待测。
(三)在线萃取前处理条件：
所用在线萃取前处理设备由沃特世ACQUITY UPLC四元溶剂管理器(SPE泵)、2777高 压样品管理器组成。
在线固相萃取小柱为Oasis HLB(2.1×30mm i.d.，20μm)；
流动相条件为：初始流动相为A所占比例为100％；0.5min～4.5min流动相为A所占比例 为99.0％，流动相B所占比例为1.0％；4.5min～7.5min流动相C所占比例为100％；7.5min～13min 流动相为A所占比例为100％；其中，流动相A为含1％甲酸的超纯水溶液，流动相B为甲 醇，流动相C为甲醇/丙酮/正己烷(1:1:1)。
流速设置：0min～3.5min流动相流速为2.0mL/min，3.5min～4.5min流动相流速为0.01mL/min，4.5min～7.5min流动相流速为2.0mL/min。
进样量0.5～5.0mL。
(四)超高效液相色谱条件：
所用超高效液相色谱设备包括沃特世ACQUITY UPLC二元溶剂管理器(分析泵)和ACQUITY UPLC色谱柱加热器冷却器。
色谱柱为Acquity BEH130(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)；
色谱柱柱温为40℃；
流动相条件：初始流动相A1为所占比例为95％；4.5min～13.5min流动相B1所占比例从 5％升至95％；13.5min～14.5min流动相B1所占比例为95％；14.5min～16.0min流动相为A1所 占比例从5％升至95％；16.0min～17.0min流动相为A1所占比例为95％；
流动相流速：0min～4.5min流动相流速为0.1mL/min，4.5min～17.0min流动相流速为0.4 mL/min。
(五)串联质谱条件：
所用串联质谱设备为爱博才思API4000+串联质谱仪。
采用多反应监测(MRM)模式，使用ESI+源分析，喷雾电压为5500V，气帘气(CurtainGAS) 为20Psi，雾化气(GSl)为55Psi，辅助加热气(GS2)为60Psi，喷针温度(TEM)为450℃。
特征离子经过对锥孔电压和碰撞电压等因素的优化，确定了质谱分析参数，列于表1。
表1 15种化合物的质谱分析参数
Figure BDA0002959441690000061
Figure BDA0002959441690000071
(六)检测结果：
(1)标准曲线和检出限：
用超纯水配制2ng/～100ng/L的磺胺类抗生素标准溶液，在上述仪器条件下检测，记录 峰面积，绘制峰面积-浓度标准曲线。结果见表2；
表2 15种化合物的标准曲线、相关系数和检出限(n＝7)
Figure BDA0002959441690000072
(2)精密度和准确度
在此条件下，本发明提取实际样品进行精密度和准确度实验，结果见表3。
表3 15种化合物检测的精密度和准确度(n＝7)
Figure BDA0002959441690000081
对比例1：
参照实施例1中的检测方法，仅改变步骤(三)中的在线萃取前处理的条件，其他不变：
上样体积5mL，流动相A、流动相B和流动相C按比例混合，初始流动相为A所占比 例为100％；0.5min～4.5min流动相为A所占比例为100％；4.5min～7.5min流动相C所占比例为100％；7.5min～13min流动相为A所占比例为100％。
0min～3.5min流动相流速为2.0mL/min，3.5min～4.5min流动相流速为0.01mL/min， 4.5min～7.5min流动相流速为2.0mL/min。
所述流动相A为含1％甲酸的超纯水溶液，流动相C为甲醇/丙酮/正己烷(1:1:1)。
实际样品(工业废水)加标实验(10ng/L)中发现，上述条件下，部分化合物受基质效应影响， 响应值明显偏低，导致回收率结果降低，结果见表4。可见，需要利用特定的在线萃取前处 理条件才能实现优异的分离检测效果。
表4 15种化合物的加标回收率
Figure BDA0002959441690000091
对比例2：
参照实施例1中的检测方法，仅改变步骤(四)中超高效液相色谱条件的条件，其他不 变：
以Acquity BEH130(100mm×2.1mm i.d.，1.7μm)为液相色谱柱，色谱柱柱温为40℃， 流动相A1和流动相B1按比例混合，初始流动相A1为所占比例为90％；4.5min～9.5min流动 相B1所占比例从10％升至90％；9.5min～10.5min流动相B1所占比例为90％；10.5min～12.0min 流动相为A1所占比例从10％升至90％；12.0min～13.0min流动相为A1所占比例为90％。 0min～4.5min流动相流速为0.1mL/min，4.5min～13.0min流动相流速为0.4mL/min。
对比例2中梯度洗脱条件下磺胺类抗生素分离效果不理想，特别是磺胺间甲氧嘧啶和磺 胺甲氧嗪，磺胺氯哒嗪和磺胺间/邻二甲氧嘧啶，磺胺喹恶啉和磺胺二甲氧嘧啶色谱峰保留时 间发生重叠、从而不能进行有效的分离。具体结果见表5。可见，需要配合特定的液相色谱 条件才能实现优异的分离检测效果。
表5对比例2高效液相方法检测15中化合物的保留时间
Figure BDA0002959441690000101

Claims (10)

1.一种快速检测水中磺胺类抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：
将样品通过在线固相萃取柱进行固相萃取富集，待固相萃取富集结束后，再在通过高效液相色谱进行洗脱分离，并联用质谱对磺胺类抗生素进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在线固相萃取柱进行固相萃取富集时的流动相条件为：
初始流动相为A所占比例为100％；0.5min～4.5min流动相为A所占比例为99.0％，流动相B所占比例为1.0％；4.5min～7.5min流动相C所占比例为100％；7.5min～13min流动相为A所占比例为100％；
其中，流动相A为含1％甲酸的水溶液，流动相B为含1％甲酸的甲醇溶液，流动相C为甲醇与丙酮、正己烷的混合体系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流动相C中甲醇、丙酮、正己烷的体积比为1:1:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在线固相萃取柱进行固相萃取富集时的流动相流速设置为：0min～3.5min流动相流速为2.0mL/min，3.5min～4.5min流动相流速为0.01mL/min，4.5min～7.5min流动相流速为2.0mL/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱进行洗脱分离时的流动相条件为：
流动相A1和流动相B1按比例混合，初始流动相A1为所占比例为95％；4.5min～13.5min流动相B1所占比例从5％升至95％；13.5min～14.5min流动相B1所占比例为95％；14.5min～16.0min流动相为A1所占比例从5％升至95％；16.0min～17.0min流动相为A1所占比例为95％；
其中，所述流动相A1为含0.1％甲酸的水溶液，流动相B1为乙腈溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱进行洗脱分离时的流动相流速设置为：0min～4.5min流动相流速为0.1mL/min，4.5min～17.0min流动相流速为0.4mL/min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在线固相萃取柱为Oasis HLB柱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱进行洗脱分离时的色谱柱为Acquity BEH130液相色谱柱；色谱柱的柱温为40℃。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述在线固相萃取柱进行固相萃取富集时的上样体积0.5～5mL。
10.一种定量检测水中磺胺类抗生素的方法，其特征在于，所述方法包括：
利用权利要求1-9任一项所述的方法测定得到一系列浓度的磺胺类抗生素标准溶液的峰面积值，然后将峰面积与相应磺胺类抗生素标准溶液的浓度构建标准曲线，即得定量检测模型。
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