CN103226138A - 快速检测水中苯氧羧酸类除草剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境中有机物分析领域，具体涉及一种快速检测水中苯氧羧酸类除草剂的全自动在线固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱(Online-SPE/UPLC-MS/MS)法。该方法包括下述的步骤：a.准备试剂、b.确定在线固相萃取条件、c.确定色谱分析条件、d.确定质谱分析条件、e.定性定量分析。本发明的有益效果在于，实现了水样全自动分析过程。水样采集后，经过滤处理，即可上样分析，直至数据处理，完全无需人工操作。相比较人工前处理方式，该方法所得数据具有更高的精密度和稳定性，极大的消除了人为误差的因素。实现了快速和绿色分析。

Description

快速检测水中苯氧羧酸类除草剂的方法

技术领域

本发明属于环境中有机物分析领域，具体涉及一种快速检测水中苯氧羧酸类除草剂的方法。 

背景技术

苯氧羧酸类除草剂是第一类投入商业生产的选择性除草剂。苯氧基醇类除草剂主要用作茎叶处理剂，施用于禾谷类作物田、针叶树林、非耕地、牧草场、草坪等，防除一年生和多年生的阔叶杂草，如苋、藜、苍耳、田旋花、马齿苋、大巢菜、波斯婆婆纳、播娘蒿等。大多数阔叶作物，特别是棉花和葡萄等对这类除草剂很敏感。

此类除草剂是在α-C上带有取代基的羧酸除草剂。其基本的化学结构分别是：一氯（2甲4氯）系列、二氯（2,4-滴）系列、三氯（2,4,5-涕）系列，具体结构式见图1。由于在苯环上取代基和取代位不同，以及羧酸的碳原子数目不同，形成了不同苯氧羧酸类除草剂品种，取代基主要有苯氧基、芳氧基、杂环氧基苯氧基等，脂肪酸主要有乙酸、丙酸、丁酸等。目前世界上大约有100 种以上的农药配方中含有苯氧羧酸类活性成分，广泛应用的产品有2,4-滴酸、2-甲基-4-氯酸（MCPA）等。苯氧羧酸类具体结构式如下：

                                                 

一氯（2甲4氯）系列二氯（2,4-滴）系列三氯（2,4,5-涕）系列

污染物项目的环境危害

1941年合成了第一个苯氧羧酸类除草剂的品种2,4-D，1942年发现了该化合物具有植物激素的作用，1944年发现2,4-D和2,4,5-T对田旋花具有除草活性，1945年发现除草剂MCPA。迄今为止,苯氧羧酸类除草剂仍然是重要的除草剂品种。

随着化学工业的发展，苯氧羧酸类除草剂的品种也逐渐增多。在我国研制和投产的除草剂也已达数十种。这类除草剂易被植物的根、叶吸收，通过木质部或韧皮部在植物体内上下传导，在分生组织积累。这类除草剂具有植物生长素的作用，植物吸收这类除草剂后，体内的生长素的浓度高于正常值，从而打破了植物体内的激素平衡，影响到植物的正常代谢，导致敏感杂草的一系列生理变化，组织异常和损伤。其选择性主要是由植物的形态结构、吸收运转、降解方式等差异决定的。

大多数除草剂对人畜的急性毒性较低，极少有急性中毒发生。但从发展的观点来看，该除草剂的安全性逐渐引起人们的关注，它对环境污染和人畜毒性都存在潜在危险。该除草剂能在蔬菜中残留，通过食物链而使人畜发生慢性危害作用。苯氧羧酸类除草剂很容易溶于水中，因此在农田生态系统中会迁移，引起土壤、地下水、大气等污染。这类除草剂本身中等毒性，但是其代谢产物(特别是一些卤化物) 对人类和生物体都会造成危害，研究表明它可以引起人类软组织恶性肿瘤，对动物体也表现出胎盘毒性。经它处理过的植物死前会在其体内蓄积很高浓度的硝酸盐或氰化物。同时因被杀死的有毒杂草和有害植物固有的毒性没有改变，因而容易引起动物中毒。

现行污染物分析方法标准的局限性

国内标准方法体系中，涉及苯氧羧酸类除草剂的标准方法很少，所涵盖的组分也相当少，仅卫生部的《生活饮用水卫生规范》（GB/T5479-2006）中有针对2，4-D的分析方法。国内外标准方法测定水质中苯氧羧酸类除草剂大多采用衍生化前处理、结合气相色谱法进行测定分析。该方法前处理复杂，步骤繁多，费时费力，且衍生化反应容易带来较多的副产物，干扰目标化合物的测定。

污染物分析仪器、设备、方法等的最新进展

目前美国EPA方法中已有标准采用HPLC/UV法对水质中苯氧羧酸类除草剂进行测定，该方法无需衍生化前处理，可采用液液萃取或固相萃取技术提取水样中的目标化合物，但是该方法的灵敏度比气相色谱法略低。国内外已有少量文献报道采用液质联用技术测定不同介质中的苯氧羧酸类除草剂，前处理方法简单易行，而且测定灵敏度也很高。

主要国家、地区及国际组织相关分析方法研究

国内外主要国家、地区及国际组织关于苯氧羧酸类除草剂的标准方法见下表，检出限在0.02μg/L-1.3μg/L。

 各国标准方法

 目前在国内还没有对水中的苯氧基醇类除草剂一大类物质测定的标准方法，仅卫生部的《生活饮用水规范》GB/T5479-2006有对2,4—二氯苯氧乙酸的测定方法，采用的是衍生/气相色谱法，该方法的原理是水样在酸性条件下经乙酸乙酯萃取后，在碱性条件下用碘甲烷溶液酯化，生成较易挥发的甲基化衍生物，用毛细管柱气相色谱-电子捕获检测器进行分析。该方法存在的较大问题是酯化的前处理过程一方面不容易控制，往往会产生较多副产物干扰测定，另一方面人为误差更大，并且也是非常耗时。

目前，对苯氧羧酸类除草剂多残留分析的报道多采用气相色谱法或气质联用法测定，由于此类化合物极性较强、稳定性较差、不易气化，需衍生后才能用气相色谱法或气质联用法测定，整个操作过程步骤繁琐，费时费力，且衍生化反应容易带来较多的副产物，会干扰目标化合物的测定。也有文献报道采用毛细管电泳法进行苯氧羧酸类的分离测定，毛细管电泳法具有很高的分离度，对这类农药可以实现手性分离，但灵敏度不高。而采用液相色谱或液相色谱-串联质谱法测定苯氧羧酸类除草剂多残留，前处理方法相对简单，无需衍生化，可直接萃取。目前国内相关文献均针对食品和农产品。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种快速检测苯氧羧酸类除草剂的方法。

本发明针对环境水质样品，通过实验条件选择优化，首次建立水样全自动在线固相萃取-液质联用方法测定苯氧羧酸类农药，可在10min内完成8种组分的定性定量分析，实现了快速自动化检测分析。

一种快速检测水中苯氧羧酸类除草剂的方法，包括下述的步骤：

a.准备试剂：2-甲-4-氯丙酸(MCPP)、2 -甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)、2 -甲-4-氯丁酸(MCPB)、2,4-滴丙酸(2,4-DP)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、4-（2,4-二氯苯氧）-丁酸(2,4-DB)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)，2,4,5-涕丙酸（2,4,5-TP），2,4-二氯苯氧乙酸-13C6（2,4-D-13C6），纯度在98.5%-99.5%之间，浓度均为100μg/mL，甲醇、乙腈，甲醇、乙腈均为色谱纯，乙酸铵,所述的乙酸铵为色谱纯，纯化水（Millipore）；

 

b.确定在线固相萃取条件

HLB 在线固相萃取柱(2.1×30mm, 20μm)；固相萃取所用试剂：载样液，0.5%甲酸-水溶液（A）；淋洗液，水(B)；淋洗液，乙腈：甲醇=9：1(C)；固相萃取柱再生液，甲醇：丙酮：正己烷=1：1：1(D)，萃取条件如下：

在线固相萃取上样及清洗梯度

c. 确定色谱分析条件

BEH C18色谱柱 (100mm×2.1mm×1.7μm)；流动相为水-2%氨水（A）和乙腈（B），采用梯度洗脱模式如下表：进样量10μL，色谱柱温为40℃，内标法定量，

在线固相萃取系统样品洗脱及色谱分离梯度程序

d. 确定质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI），负离子扫描方式，多反应监测，毛细管电压2.8kV，离子源温度120℃，雾化温度350℃，雾化气流速800L/hr，反吹气流速10 L/hr，碰撞气流速0.10mL/min，监测驻留时间0.02s,多反应监测条件如下：

目标化合物的多离子反应监测条件

e.定性定量分析

(1)标准曲线绘制

配制浓度依次为0.008μg/L、0.01μg/L、0.02μg/L、0.05μg/L和0.1μg/L的苯氧羧酸类除草剂空白水加标样； 

（2）根据HJ/T 168-2010空白实验中未检出目标物质的检出限测定方法，以1.0ng/L的水样浓度作为检出限测定的浓度，配制7份平行水样，经全过程分析，计算其浓度的标准偏差S，以3S为检出限，4倍检出限为定量。

本方法扩大了苯氧羧酸类除草剂的组分范围，同时采用固相萃取/液质联用技术替代衍生/气相色谱法，极大地简化了分析步骤，提高了分析灵敏度，是对以前标准很好的改进和补充。

本发明的方法优点如下：

实现了水样全自动分析过程。水样采集后，经过滤处理，即可上样分析，直至数据处理，完全无需人工操作。相比较人工前处理方式，该方法所得数据具有更高的精密度和稳定性，极大的消除了人为误差的因素。

实现了快速和绿色分析。离线前处理方式一般均需要对水样进行萃取后，进一步浓缩富集（一般通过氮气吹干）以提高方法灵敏度，浓缩过程中挥发的有机试剂对环境的污染比较严重，耗时也较长。本方法采用在线固相萃取富集，流动相反向快速冲洗的方式，可将水样中目标化合物直接冲入液相色谱系统进行分离分析，无需任何有机溶剂浓缩，极大的节约了时间，实现了真正的快速分析。

本发明的方法所需水样量很小，仅需5-20mL，但其富集倍数与离线固相萃取法相比，完全相当甚至是更优。该方法通过在线洗脱，可将5-20mL水样中的目标化合物全部冲入色谱系统分析。而离线固相萃取法，虽然通过大体积上样获得较高富集倍数（如从1000mL富集到1mL）,但最终仅取小体积进样（一般为5-20uL），真正富集倍数并不高。

附图说明

图1为8种苯氧羧酸类除草剂和内标物的总离子流质谱图（浓度：1.0μg/L，进样量5mL）；

图中，1为：2 -甲基-4-氯苯氧乙酸；

2,3为：2,4—二氯苯氧乙酸, 2,4—二氯苯氧乙酸-13C6；

4，5为：2 -甲-4-氯丙酸，2,4-滴丙酸；

6为：2,4,5—三氯苯氧乙酸；

7为：2,4,5-涕丙酸；

8，9为：4—（2,4—二氯苯氧）—丁酸，2 -甲-4-氯丁酸；

图2为MCPA的总离子流质谱图；

图3为Mecoprop的总离子流质谱图；

图4为2,4-D的总离子流质谱图；

图5为MCPB的总离子流质谱图；

图6为Dichlorprop的总离子流质谱图；

图7为2,4-DB的总离子流质谱图；

图8为2,4,5-T的总离子流质谱图；

图9为Fenoprop的总离子流质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

采用全自动在线固相萃取-超高效液相色谱／串联质谱系统作为分析设备。

2 -甲-4-氯丙酸(MCPP)、2 -甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)、2 -甲-4-氯丁酸(MCPB)、2,4-滴丙酸(2,4-DP)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、4-（2,4-二氯苯氧）-丁酸(2,4-DB)、2,4,5-三氯苯氧乙酸(2,4,5-T)，2,4,5-涕丙酸（2,4,5-TP），2,4-二氯苯氧乙酸-13C6（2,4-D-13C6），纯度在98.5%-99.5%之间，浓度均为100μg/mL，购于Dr. Ehrenstorfer公司，甲醇、乙腈 (色谱纯，Merck公司)，乙酸铵（色谱纯），纯化水（Millipore）。

确定在线固相萃取条件

HLB 在线固相萃取柱(2.1×30mm, 20μm)；固相萃取所用试剂：载样液，0.5%甲酸-水溶液（A）；淋洗液，水(B)；淋洗液，乙腈：甲醇=9：1(C)；固相萃取柱再生液，甲醇：丙酮：正己烷=1：1：1(D)，萃取条件见下表。

在线固相萃取上样及清洗梯度

 色谱分析条件

BEH C18色谱柱 (100mm×2.1mm×1.7μm)；流动相为水-2%氨水（A）和乙腈（B），采用梯度洗脱模式，见下表。进样量10μL，色谱柱温为40℃，内标法定量。

  在线固相萃取系统样品洗脱及色谱分离梯度程序

本方法采用超高效液相色谱系统（UPLC)，具备的优势如下：

1、色谱柱的填料粒径达到1.7μm，可以实现更好的分离度，达到更高的峰容量；

2、极大的缩短了分析时间。相对于普通高效液相而言，本系统仅用10分钟的获得了8种物质的基本分离，这是普通高效液相(HPLC)无法实现的。

质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI），负离子扫描方式，多反应监测，毛细管电压2.8kV，离子源温度120℃，雾化温度350℃，雾化气流速800L/hr，反吹气流速10 L/hr，碰撞气流速0.10mL/min，监测驻留时间0.02s，多反应监测条件见下表：

  目标化合物的多离子反应监测条件

 

 定性定量分析

标准曲线绘制

配制浓度依次为0.008μg/L、0.01μg/L、0.02μg/L、0.05μg/L和0.1μg/L的苯氧羧酸类除草剂空白水加标样（此为参考浓度序列）。在该浓度范围内8种组分的相关系数均大于0.998（见下表）。质谱图如附图1。

8种苯氧羧酸类化合物的线性方程

检出限

根据HJ/T 168-2010空白实验中未检出目标物质的检出限测定方法，本实验以1.0ng/L的水样浓度作为检出限测定的浓度，配制7份平行水样，经全过程分析，计算其浓度的标准偏差S。以3S为检出限，4倍检出限为定量下限，结果见下表。由下表可知，在线固相萃取法的检出限（0.4-0.6ng/L）比离线固相萃取法的检出限(1.0-1.7ng/L)更优。

添加浓度(0.001mg/L)— 方法检出限计算结果（进样体积20ml，n=7）

 

本发明的方法的精密度、准确度和适用性研究

对两个浓度水平分别为0.02μg/L、0.20μg/L的地表水和废水加标样进行回收率测定，每个添加水平平行配制6份样，其加标回收率及精密度分析结果见下表。

添加浓度(0.02mg/L)—低浓度地表水加标样测定准确度数据

 

添加浓度(0.20mg/L)—高浓度地表水加标样测定准确度数据

添加浓度(0.02mg/L)—低浓度废水加标样测定准确度数据

添加浓度(0.20mg/L)—高浓度废水加标样品测定准确度数据

与衍生化-气相色谱法比较

取太湖地区实际水样1份，按照本方法和《生活饮用水卫生规范》中的衍生化-气相色谱法，分别进行加标实验测试（平行配制6份样品）测定2,4—二氯苯氧乙酸。实际水样经两种方法测试，2,4—二氯苯氧乙酸均未检出。结果显示，本发明的方法不管是回收率还是精密度均更优。

实测数据

数据分析如下

与离线固相萃取法比较

由以上数据可知，本方法与离线固相萃取相比，在线性系数、精密度、回收率及检出限等方面均具有更大优势。由于本方法采用的是工作曲线，相对离线方法采用的标准曲线而言，本方法最终定量结果更加准确可靠。

    本发明的方法建立了在线分析水中苯氧羧酸类除草剂的方法(Online-SPE-UPLC-ESI/MS/MS)，该法具有操作简便，灵敏度高、准确、重现性好的特点，实现了更快速、更环保的样品全过程分析，适合大批量复杂水样的分析。

与离线固相萃取法相比，该方法仅需取样20mL，即可达到离线固相萃取1L样品量富集所达到的检出限，甚至更优。且由于该方法自动化程度较高，其定量的精密度和准确度也更优，十分适合水质环境快速监测。

在线固相萃取与离线固相萃取相比，具有如下的优点：

1．具备很好的重复性和稳定性。离线固相萃取对技术人员要求较高，会存在较大人为误差，而实现在线则很好的解决了这一问题；

2．在线固相萃取实现了与分析仪器的无缝对接。离线固相萃取作为实验预处理的步骤，为满足分析仪器的灵敏度和适应性要求，往往需要进行浓缩步骤，这一过程会产生大量的有机溶剂废气，不利于环境，并且十分耗时。而在线固相萃取是将萃取柱上富集的目标物通过流动相冲洗，直接冲入分析仪器中的色谱柱，无需浓缩，既环保又节省时间；

3．在线固相萃取所需样品量很少。一般20ml水样通过在线固相萃取后进入分析仪器，可实现20倍的富集倍数。而离线固相萃取往往需要1L的水样量，富集萃取后浓缩至1ml，最终仅能取10ul样品进样，实际富集倍数为10倍。因此在线固相萃取可以用很少的样品量获得更优的富集倍数，从而实现更高灵敏。

Claims (1)

1.快速检测水中苯氧羧酸类除草剂的方法，包括下述的步骤：

a.准备试剂：2-甲-4-氯丙酸、2 -甲基-4-氯苯氧乙酸、2 -甲-4-氯丁酸、2,4-滴丙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、4-（2,4-二氯苯氧）-丁酸、2,4,5-三氯苯氧乙酸，2,4,5-涕丙酸，2,4-二氯苯氧乙酸-13C6，纯度在98.5%-99.5%之间，浓度均为100μg/mL，甲醇、乙腈，甲醇、乙腈均为色谱纯，乙酸铵,所述的乙酸铵为色谱纯，纯化水（Millipore）；

b.确定在线固相萃取条件

HLB 在线固相萃取柱(2.1×30mm, 20μm)；固相萃取所用试剂：载样液，0.5%甲酸-水溶液（A）；淋洗液，水(B)；淋洗液，乙腈：甲醇=9：1(C)；固相萃取柱再生液，甲醇：丙酮：正己烷=1：1：1(D)，萃取条件如下：

在线固相萃取上样及清洗梯度

c. 确定色谱分析条件

BEH C18色谱柱 (100mm×2.1mm×1.7μm)；流动相为水-2%氨水（A）和乙腈（B），采用梯度洗脱模式如下表：进样量10μL，色谱柱温为40℃，内标法定量；

在线固相萃取系统样品洗脱及色谱分离梯度程序

 

d. 确定质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI），负离子扫描方式，多反应监测，毛细管电压2.8kV，离子源温度120℃，雾化温度350℃，雾化气流速800L/hr，反吹气流速10 L/hr，碰撞气流速0.10mL/min，监测驻留时间0.02s,多反应监测条件如下：

目标化合物的多离子反应监测条件

e.定性定量分析

(1)标准曲线绘制

配制浓度依次为0.008μg/L、0.01μg/L、0.02μg/L、0.05μg/L和0.1μg/L的苯氧羧酸类除草剂空白水加标样

（2）根据HJ/T 168-2010空白实验中未检出目标物质的检出限测定方法，以1.0ng/L的水样浓度作为检出限测定的浓度，配制7份平行水样，计算其浓度的标准偏差S，以3S为检出限，4倍检出限为定量下限。

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