CN105651884A - 一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品、药品或保健品分析领域，尤其涉及一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法。本发明提供的一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法：待测样品经预处理后。依次经过C18固相萃取柱纯化、季胺固相萃取柱纯化和羧酸固相萃取柱纯化，合并洗脱液后，水浴氮气吹干，甲醇定容后，微孔滤膜过滤，得待测品，待测品通过高效液相色谱-三重四级杆方法进行定性检测和/或定量检测。本发明还提供了一种根据上述检测方法在改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的定性检测和/或定量检测中的应用。
Description
技术领域
本发明属于食品、药品或保健品分析领域，尤其涉及一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法。
背景技术
随着现代社会生活压力的逐渐增大，越来越多的人面临性欲减弱、易疲劳的困扰，因此，改善阳虚、缓解疲劳类保健食品及中成药的市场需求日益增长。然而，某些不法厂商为了壮阳、缓解疲劳功效、牟取暴利，在改善阳虚、缓解疲劳的保健食品及中成药中非法添加壮阳和缓解疲劳的西药。消费者长期服用含有壮阳或缓解疲劳类药物的保健食品或中成药，会严重营养身体健康。
现有技术中，常见的检测手段主要包括：薄层色谱法、高效液相色谱(HPLC)法、高效液相色谱一质谱/质谱(HPLC—MS/MS)法、气相色谱氮磷检测法和气相色谱一质谱(GC—MS)法，但此类检测手段多见于某一类药物在尿样或血样中的分析，在未见有系统的、多类化学成分的研究方法，尤其是壮阳、缓解疲劳保健食品和中成药中的检测方法报道。由于前处理方法及分析方法的局限性，大多数研究只是检测壮阳类中的某一种或者某几种化学成分。综上所述，现有技术中，并未能对于壮阳和/或缓解疲劳类化学物质进行多指标完整的检测，且上述检测手段还具有成本高、检测时间长以及工作效率低的缺点。
因此，研发出一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的多指标快速检测方法，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，用于解决现有技术中，并未能对于改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质进行多指标完整的检测的问题。同时，本发明提供的检测方法还可以解决现有技术中且成本高、检测时间长以及工作效率低的缺点。
本发明提供的一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，为：步骤一、待测样品经C18固相萃取柱纯化，收集洗脱液A；步骤二、所述洗脱液A经季胺固相萃取柱纯化后，先用去离子水和甲醇冲洗，收集洗脱液B；继续用含1％HCl的甲醇溶液冲洗，收集洗脱液C；步骤三、所述洗脱液B经羧酸固相萃取柱纯化，先用去离子水和甲醇淋洗，弃去流出液；继续用5％的氨水甲醇溶液冲洗，收集洗脱液D；步骤四、合并所述洗脱液C和所述洗脱液D，水浴氮气吹干，甲醇定容后，微孔滤膜过滤，得待测品；步骤五、所述待测品通过高效液相色谱-三重四级杆方法进行定性检测和/或定量检测。
优选地，所述C18固相萃取柱的基质为硅胶-Si(CH3)C18H37，所述C18固相萃取柱的粒径为40-63μm，所述C18固相萃取柱的孔径为60，所述C18固相萃取柱的含碳量11％。
优选地，所述季胺固相萃取柱的基质为键合有三甲基氨丙基的高纯硅胶，所述季胺固相萃取柱的粒径为40～63nm，所述季胺固相萃取柱的孔径为60，所述季胺固相萃取柱的孔体积为0.8cm3/g，所述季胺固相萃取柱的比表面积为480m2/g，所述季胺固相萃取柱的离子交换容量为1.1meq/g。
优选地，所述羧酸固相萃取柱的基质为N-乙基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，所述羧酸固相萃取柱粒径为40～63μm，所述羧酸固相萃取柱的平均孔径为70，所述羧酸固相萃取柱的离子交换容量为1.4meq/g。
优选地，所述水浴温度为40℃，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。
优选地，所述定性检测和/或定量检测的对照品为0.1mg/ml的伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、那红地那非、那莫西地那非、盐酸育亨宾、氨基他达拉非、红地那非、西地那非、伐地那非、他达那非、巯基西地那非、去乙基伐地那非、N-去甲基西地那非、二甲基西地那非、格列齐特、二乙氨基他达拉非、羟基伐地那非和甲磺酸酚妥拉明的甲醇溶液中的一种或多种。
优选地，所述待测品的定性检测和/或定量检测采用梯度洗脱方法，所述梯度洗脱的流动相为体积浓度0.1％的甲酸水溶液和体积浓度0.1％的甲酸乙腈溶液的中的一种或二者的混合溶液；进样0～5min时，流动相1的配比为90％所述甲酸水溶液和10％所述甲酸乙腈溶液的混合溶液；进样5～7.5min时，流动相2为所述乙酸乙腈溶液；进样7.5min后，流动相3的配比为90％所述甲酸水溶液和10％所述甲酸乙腈溶液的混合溶液。
优选地，所述待测品的定性检测和/或定量检测采用电喷雾离子源，正离子模式进行检测；电喷雾电压为5.5KV，离子源温度为550℃；脱溶剂气为N2，所述脱溶剂气的气流压力为50psi；锥孔反吹气为N2，所述锥孔反吹气的气流压力为35psi；碰撞气为N2；扫描模式为多反应监测模式。
优选地，所述检测方法还包括预处理步骤，所述预处理在步骤一前进行：所述预处理的方法为：待测样品依次经粉碎、醇提后过滤，收集上清液，所述上清液减压浓缩后，静置，静置产物中滴加醇溶液，离心取上清液，减压浓缩，静置即得。
本发明还提供了包括以上任意一项所述的检测方法在改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的定性检测和/或定量检测中的应用。
综上所述，本发明提供的一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，为：步骤一、待测样品依次经粉碎、醇提后过滤，收集上清液，所述上清液减压浓缩后，第一次静置，得第一产物；步骤二、向所述第一产物中滴加醇溶液，离心取上清液，减压浓缩，第二次静置，得第二产物；步骤三、所述第二产物经C18固相萃取柱纯化，收集洗脱液A；步骤四、所述洗脱液A经季胺固相萃取柱纯化后，先用去离子水和甲醇冲洗，收集洗脱液B；继续用含1％HCl的甲醇溶液冲洗，收集洗脱液C；步骤五、所述洗脱液B经羧酸固相萃取柱纯化，先用去离子水和甲醇淋洗，弃去流出液；继续用5％的氨水甲醇溶液冲洗，收集洗脱液D；步骤六、合并所述洗脱液C和所述洗脱液D，水浴氮气吹干，甲醇定容后，微孔滤膜过滤，得待测品。步骤七、待测品通过高效液相色谱-三重四级杆方法进行定性检测和/或定量检测。从本方案可以清楚的得出，本发明提供的检测方法，可以有效地解决现有技术中，并未能对于改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质进行多指标完整的检测的问题。同时，本发明提供的检测方法，还可以解决现有技术中且成本高、检测时间长以及工作效率低的缺点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例检测对照品的总离子流图谱；
图2为本发明实施例1样品的总离子流图谱；
图3为本发明实施例2样品的总离子流图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更详细说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，进行具体地描述。
本发明提供的一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，最低检出限量达0.5ng/ml。此外，由于保健食品基质复杂，本发明提供的前处理方法，能有效提取20种目标成分，便于目标成分的高效检测。
实施例1
分别称取伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、那红地那非、那莫西地那非、盐酸育亨宾、氨基他达拉非、红地那非、西地那非、伐地那非、他达那非、巯基西地那非、去乙基伐地那非、N-去甲基西地那非、二甲基西地那非、格列齐特、二乙氨基他达拉非、羟基伐地那非和甲磺酸酚妥拉明对照品各2.5mg，分别加甲醇定溶到25ml，制成最终浓度为0.1mg/ml的对照品溶液。
利用Waters超高效液相色谱-三重四级质谱联用仪对上述制得的对照品溶液进行检测分析。监测分析具体的实验参数设定为：
高效液相色谱仪：Waters超高效液相色谱-三重四级质谱联用仪；
色谱柱：WatersBEHC18，2.1*100mm，1.8μm；
柱温：室温；
进样体积：5μL；
流速：0.3mL/min；
流动相A为含有0.1％(v/v)甲酸的水溶液,流动相B为含有0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。按照表1所述的流动相比例进行梯度洗脱：
表1：流动相比例
采用电喷雾离子(ESI)源,正离子模式进行检测。电喷雾电压(IS):5.5kV；离子源温度：550℃；脱溶剂气和锥孔反吹气为N2,脱溶剂气流压力50psi；锥孔反吹气流压力：35psi；碰撞气为N2，扫描模式为多反应监测(MRM)模式。
测定得到的20种对照品溶液的优化离子对及其检测参数见表2.
表2：20种对照品溶液的优化离子对及其检测参数
实施例2
(1)、取市售玛卡口服液A30ml，向市售玛卡口服液A中缓慢滴加甲醇至市售玛卡口服液A的体积浓度为80％，离心具体参数，取上清液，减压浓缩至市售玛卡口服液A甲醇溶液体积的5％。-20℃冰箱静置12h。
(2)、采用60mg/3mL的C18固相萃取柱(基质为硅胶-Si(CH3)C18H37，粒径40-63μm，孔径60，含碳量11％)进行样品纯化。预先用5ml甲醇和5ml去离子水活化小柱，5ml待分析样品以1滴/秒的流速过柱。用10ml的去离子水进和体积浓度为95％的甲醇溶液淋洗。最后用20ml甲醇洗脱，收集洗脱液A。
(3)、采用离子交换量为60mg/3mL的季胺(SAX)固相萃取柱(基质为三甲基氨丙基(-Si(CH2)3NCl(CH3)3，粒径40-63μm，孔径60，孔体积0.8cm3/g，比表面积480m2/g，离子交换容量1.1meq/g)进行纯化。预先用5ml的去离子水活化小柱，样品以1mL/min的流速过柱，用5mL水和5ml甲醇分别淋洗柱子，收集洗洗脱液B。再用15mL含1％HCl的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液C。
(4)、采用60mg/3mL的WCX固相萃取柱(基质为N-乙基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物基质-COOH；粒径：40-63μm；平均孔径：70；离子交换容量：1.4meq/g)进行纯化。用去离子水活化MCX固相萃取柱，加入上一步洗脱液B，依次加入3mL水和3mL甲醇淋洗，弃去流出液，最后用3mL含5％氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液D。
(5)、合并C和D洗脱液，40℃水浴氮气吹干，用甲醇溶解定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜，待上机测定。
采用实施例1中所述的液质联用优选条件，通过超高效液相色谱-三重四级杆联用方法对样品A进行筛查和鉴定。通过比对供试样品和各对照品的两离子对的色谱峰保留时间，请参阅图1和图2，发现供试样品中的460.4/151和460.4/312离子对的保留时间均在3.81分钟，与伪伐地那非对照品优化的离子对(表2)保留时间一致，因此判定对照品即判断此样品A为阳性，含有伪伐地那非。
通过定量离子的所建立的外标曲线，获得样品A中伪伐地那非的含量为45.5±0.32ng/ml。
实施例3
(1)、取市售玛卡含片B5克，碾细并过80目筛，用甲醇：水＝80：20(v/v)溶液提取20min，过滤，减压浓缩。-20℃冰箱静置12h。
下述步骤与实施例2相同，在此不再赘述。
通过超高效液相色谱-三重四级杆联用方法对样品进行筛查和鉴定。通过比对供试样品和各对照品的两离子对的色谱峰保留时间，请参阅图1和图3，未发现与表2列出的任何离子对保留时间一致，因此判定对照品即判断此样品B为阴性，不含有表2所述非法添加药物。
综上所述，本发明提供的一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，为：步骤一、待测样品依次经粉碎、醇提后过滤，收集上清液，所述上清液减压浓缩后，第一次静置，得第一产物；步骤二、向所述第一产物中滴加醇溶液，离心取上清液，减压浓缩，第二次静置，得第二产物；步骤三、所述第二产物经C18固相萃取柱纯化，收集洗脱液A；步骤四、所述洗脱液A经季胺固相萃取柱纯化后，先用去离子水和甲醇冲洗，收集洗脱液B；继续用含1％HCl的甲醇溶液冲洗，收集洗脱液C；步骤五、所述洗脱液B经羧酸固相萃取柱纯化，先用去离子水和甲醇淋洗，弃去流出液；继续用5％的氨水甲醇溶液冲洗，收集洗脱液D；步骤六、合并所述洗脱液C和所述洗脱液D，水浴氮气吹干，甲醇定容后，微孔滤膜过滤，得待测品。步骤七、待测品通过高效液相色谱-三重四级杆方法进行定性检测和/或定量检测。从本方案可以清楚的得出，本发明提供的检测方法，可以有效地解决现有技术中，并未能对于改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质进行多指标完整的检测的问题。同时，本发明提供的检测方法，还可以解决现有技术中且成本高、检测时间长以及工作效率低的缺点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法为：
步骤一、待测样品经C18固相萃取柱纯化，收集洗脱液A；
步骤二、所述洗脱液A经季胺固相萃取柱纯化后，先用去离子水和甲醇冲洗，收集洗脱液B；继续用含1％HCl的甲醇溶液冲洗，收集洗脱液C；
步骤三、所述洗脱液B经羧酸固相萃取柱纯化，先用去离子水和甲醇淋洗，弃去流出液；继续用5％的氨水甲醇溶液冲洗，收集洗脱液D；
步骤四、合并所述洗脱液C和所述洗脱液D，水浴氮气吹干，甲醇定容后，微孔滤膜过滤，得待测品。
步骤五、所述待测品通过高效液相色谱-三重四级杆方法进行定性检测和/或定量检测。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18固相萃取柱的基质为硅胶-Si(CH3)C18H37，所述C18固相萃取柱的粒径为40-63μm，所述C18固相萃取柱的孔径为所述C18固相萃取柱的含碳量11％。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述季胺固相萃取柱的基质为键合有三甲基氨丙基的高纯硅胶，所述季胺固相萃取柱的粒径为40～63nm，所述季胺固相萃取柱的孔径为所述季胺固相萃取柱的孔体积为0.8cm3/g，所述季胺固相萃取柱的比表面积为480m2/g，所述季胺固相萃取柱的离子交换容量为1.1meq/g。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述羧酸固相萃取柱的基质为N-乙基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，所述羧酸固相萃取柱粒径为40～63μm，所述羧酸固相萃取柱的平均孔径为所述羧酸固相萃取柱的离子交换容量为1.4meq/g。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述水浴温度为40℃，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定性检测和/或定量检测的对照品为0.1mg/ml的伪伐地那非、羟基豪莫西地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、那红地那非、那莫西地那非、盐酸育亨宾、氨基他达拉非、红地那非、西地那非、伐地那非、他达那非、巯基西地那非、去乙基伐地那非、N-去甲基西地那非、二甲基西地那非、格列齐特、二乙氨基他达拉非、羟基伐地那非和甲磺酸酚妥拉明的甲醇溶液中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的检测方法。其特征在于，所述待测品的定性检测和/或定量检测采用梯度洗脱方法，所述梯度洗脱的流动相为体积浓度0.1％的甲酸水溶液和体积浓度0.1％的甲酸乙腈溶液的中的一种或二者的混合溶液；
进样0～5min时，流动相1的配比为90％所述甲酸水溶液和10％所述甲酸乙腈溶液的混合溶液；
进样5～7.5min时，流动相2为所述乙酸乙腈溶液；
进样7.5min后，流动相3的配比为90％所述甲酸水溶液和10％所述甲酸乙腈溶液的混合溶液。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测品的定性检测和/或定量检测采用电喷雾离子源，正离子模式进行检测；
电喷雾电压为5.5KV，离子源温度为550℃；脱溶剂气为N2，所述脱溶剂气的气流压力为50psi；锥孔反吹气为N2，所述锥孔反吹气的气流压力为35psi；碰撞气为N2；扫描模式为多反应监测模式。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括预处理步骤，所述预处理在步骤一前进行：
所述预处理的方法为：待测样品依次经粉碎、醇提后过滤，收集上清液，所述上清液减压浓缩后，静置，静置产物中滴加醇溶液，离心取上清液，减压浓缩，静置即得。
10.一种包括权利要求1至9任意一项所述的检测方法在改善阳虚和/或缓解疲劳类化学物质的定性检测和/或定量检测中的应用。
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