CN103822995A

CN103822995A - 食品中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的测定方法

Info

Publication number: CN103822995A
Application number: CN201410096311.2A
Authority: CN
Inventors: 刘靖靖; 孙忠松; 崔淑华
Original assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Inspection and Quarantine Technology Center of Shandong Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2014-03-16
Filing date: 2014-03-16
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-03-16
Also published as: CN103822995B

Abstract

本发明公开了一种食品中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的测定方法。本发明的样品前处理是用甲醇水溶液提取食品样品中的草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸，再选择C18分散固相萃取剂对提取液进行净化，过滤后经衍生，结合高效液相色谱-串联质谱实现3种化合物同时定性和定量测定。显然本发明的方法操作简便、重现性好，有效去除样品提取液中的杂质，前处理是对已有QuEChERS方法的补充和改进，回收率可达70.5%～91.2%，相对标准偏差为4.5%～7.3%，定量限50μg/kg。完全满足我国和欧盟、美国、日本对安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

食品中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的测定方法

技术领域

本发明属于农药残留量的测定技术领域，具体地说涉及一种草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸残留量测定方法。

背景技术

草甘膦（glyphosate,PMG）是美国孟山都公司于20世纪70年代开发的广谱灭生性除草剂，是除草活性最强的有机磷农药,它的杀草谱广,通过茎叶吸收后传导到植物各部位的，可防除单子叶和双子叶、一年生和多年生、草本和灌木等40多科的植物。因具有用药成本低、传导性强、药效好、环境兼容性优良等特点而被广泛使用。

氨甲基磷酸(aminomethyl phosphonic acid，AMPA)是草甘膦在植物、土壤及水中的主要代谢产物。

草铵膦(glufosinate,GLUF)是赫斯特公司于上世纪80年代开发的新型灭生性除草剂，是广谱、触杀型、灭杀性除草剂，采用杂草茎叶定向喷雾处理，几乎可以用于各种宽行种植的果树、中耕作物、蔬菜和非耕地。

草甘膦和草铵膦虽然属于低毒类有机磷除草剂，但不合理使用会导致植物产品中草甘膦和草铵膦的残留超标，影响消费者的食用安全，同时也会影响相关产品的国际贸易。显然随着草甘膦和草铵膦的推广和使用，寻求和建立食品中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的检测方法具有重要意义。

QuEChERS方法作为新发展起来的样品前处理技术，是代表快速、简单、价廉、高效、稳定和安全（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）的样品前处理方法。具有回收率高，分析农药范围广，处理速度快，溶剂使用量少，操作简便等优点。目前国际广泛认可使用的QuEChERS方法有欧盟制定的EN15662和美国官方分析化学师协会的AOAC2007.01标准方法。方法包括提取、净化2个步骤：1用乙腈或含1％乙酸的乙腈提取样品，通过加入缓冲盐混合物进行盐析萃取实现乙腈和样品所在水相的液-液分离；2用分散固相萃取剂和无水硫酸镁对提取溶液净化，分散固相萃取剂依据样品基质和待测化合物的性质，可选择PSA、GCB、C18EC等，但都加入无水硫酸镁以去除中乙腈中残留的水分。

草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸分子式中都同时含有膦酸基、羟基、氨基，是极强的两性化合物，极易溶于用水，因此难以用乙腈从水相中萃取，无法采用现有QuEChERS方法进行样品前处理。前处理通常采用固相萃取柱净化，方法较复杂，回收率低，对操作人员要求较高；也有方法不经净化直接检测，基质干扰大，对检测仪器污染严重。

发明内容

本发明的目的是提供一种食品中草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的测定方法，以弥补现有技术的不足。

本发明的另一目的是提供一种样品前处理方法，以弥补现有国际广泛认可使用的QuEChERS方法无法用于草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸这三种农药残留检测的不足。

本发明的测定首先是对样品的前处理，即对已有QuEChERS方法的补充和改进，这是由于草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸极易溶于水的特性决定，现有QuEChERS方法用乙腈或含1％乙酸的乙腈从水相中盐析萃取的提取方法无法实用，本发明选用甲醇水溶液为提取溶剂从样品中直接提取，保证了上述农药的提取效率。在净化步骤，因为考虑到提取溶剂主要是水，所以现有方法加入无水硫酸镁以去除提取液中残余水分的方法并不可行，因此本发明用分散固相萃取剂对提取液进行净化，而不加入无水硫酸镁。

因此，本发明的检测，其前处理是首先用甲醇水溶液提取食品样品中的草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸，再选择C18分散固相萃取剂对提取液进行净化，衍生，最后结合高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）实现上述三种农药同时定性和定量测定。

本发明的测定方法包括如下步骤：

（1）提取

称取经均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加甲醇水溶液均质提取1min，涡旋振荡1min，离心；

（2）净化

移取（1）获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm滤膜，待衍生；

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在50～1000μg/L范围内，配制至少三个浓度的草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸系列基质标准工作溶液，待衍生。

（4）衍生

将步骤（2）和步骤（3）中所得待衍生溶液分别加入硼酸钠溶液和9-芴基氯甲酸酯丙酮溶液，混匀，衍生2h。衍生后的样品液和系列基质标准工作液待测定。

（5）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

a)定量测定：将步骤（4）中衍生后的系列基质标准工作液进行LC-MS/MS测定，以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（4）中衍生后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中农药的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中农药含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中农药残留量。

b)定性测定：检测步骤（4）中衍生后样品液中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种目标化合物；

若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物。

上述步骤（2）优选甲醇水溶液的体积浓度为20%。

上述步骤（2）中基质分散固相萃取剂为C18，每毫升提取液中C18为50mg。

上述步骤（4）中硼酸钠溶液浓度为5%，每毫升待衍生样品液或标准工作溶液中加入0.2mL。

上述步骤（4）中9-芴基氯甲酸酯丙酮溶液的浓度为1.0g/L，每毫升待衍生样品液或标准工作溶液中加入0.2mL。

上述步骤（5）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液（pH9），流动相B：乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量10μL。

上述步骤（5）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

时间（min）	A（%）	B（%）
			0	90	10
1.0	90	10
			1.1	60	40
3.0	60	40
			3.1	90	10
9.0	90	10

A和B的%是体积比例。

上述步骤（5）中液相色谱的色谱柱填料为C18，柱温为30℃。

上述步骤（5）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为+3500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

上述步骤（5）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，草甘膦的母离子392，子离子分别为214和88，氨甲基磷酸的母离子334，子离子分别为112和179，草铵磷的母离子404.1，子离子分别为136和182。

上述步骤（1）～（5）中样品接触到包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。

本发明的有益效果在于：

本发明能有效降低食品中草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸残留检测中的基质干扰，将此前处理方法结合LC-MS/MS应用于食品中草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸定性确证和定量检测，平均回收率78.5%～98.2%，相对标准偏差（RSD）为4.5%～7.3%，定量限为50μg/kg。本发明具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点，是对已有QuEChERS方法的补充和改进。完全能满足我国和欧盟、美国、日本对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为以胡萝卜为基质，浓度为50.0ng/mL的草甘膦多反应监测色谱图。

图2为以胡萝卜为基质，浓度为50.0ng/mL的氨甲基磷酸多反应监测色谱图。

图3为以胡萝卜为基质，浓度为50.0ng/mL的草铵膦多反应监测色谱图。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂如下：

CR21GⅢ型高速冷冻离心机（Hitachi，Japan）；MS3型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；C18分散固相萃取剂（Agilent，USA）。

试剂：甲醇（HPLC级，Merke，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；氨水（分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司）。

标准物质：草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸，纯度均大于99%，购自Sigma公司。

实施例1：胡萝卜中草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的检测

（1）样品前处理

称取经均质化的胡萝卜样品10.0g于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL甲醇水溶液，涡旋振荡1min，5000r/min离心5min。离心后，取2mL上清提取液至装有100mg C18的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min。上清液过0.22μm滤膜后，待衍生。

（2）标准工作溶液的配制

称取标准品25±0.1mg于25mL塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸标准储备液各1.0mL置于100mL塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL混合标准中间液；

再用经检测不含草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸的胡萝卜作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将混合标准中间液用空白基质溶液稀释配制成50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液，待衍生。

（3）衍生

取待衍生液1mL，加入0.2mL5%硼酸钠溶液、0.2mL1.0g/L9-芴基氯甲酸酯丙酮溶液，混匀，衍生2h。衍生后的样品液和系列基质标准工作液待测定。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中目标物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标物残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Extend C18，150mm×2.1mm（内径），3.5μm（粒径）；流动相：（A）水（含5mmol/L乙酸铵，pH9）；（B）乙腈；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序如表1。表1：实施例1的梯度洗脱程序

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描；电喷雾电压：+3500V；雾化气压力：275.9kPa；干燥气：氮气，350℃，流速为10.0L/min；MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM检测参数

*为定量离子对。

定性鉴定：对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3胡萝卜基质中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸标准工作曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				草铵磷	6.19	Y=2636.44X+1732.09	0.9997
草甘膦	3.62	Y=5976.97X-153.1	0.9995
				氨甲基磷酸	6.50	Y=9988.29X+3.20	0.9998

加标回收率和重复性：

选取大豆、苹果、胡萝卜、红茶、香蕉空白样品中，分别添加0.05、0.10、0.50mg/kg浓度水平的草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸标准溶液，然后分别进行前处理待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差。三种化合物的回收率70.5%～91.2%，相对标准偏差（RSD）为4.5%～7.3%。

本发明以3倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为定量限(LOQ)，草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸的检出限均为20μg/kg。草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸的定量限均为50μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种食品中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的测定方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取

称取经均质化的食品样品于具塞塑料离心管中，加甲醇水溶液，涡旋振荡，离心；

（2）净化

移取（1）获得的上清液于塑料离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm滤膜，得到样品液待衍生；

（3）配制基质标准工作溶液

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在50～1000μg/L范围内，配制至少三个浓度的草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸系列基质标准工作溶液，待衍生；

（4）衍生

将步骤（2）和步骤（3）中所得待衍生溶液分别加入硼酸钠溶液和9-芴基氯甲酸酯丙酮溶液，混匀，衍生2h；衍生后的样品液和系列基质标准工作液待测定；

（5）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

质谱检测使用多反应监测扫描模式，草甘膦的母离子392，子离子分别为214和88，氨甲基磷酸的母离子334，子离子分别为112和179，草铵磷的母离子404.1，子离子分别为136和182；

a)定量测定：将步骤（4）中衍生后的系列基质标准工作液进行LC-MS/MS测定，以基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（4）中衍生后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中农药的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中农药含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中农药残留量；

b)定性测定：检测步骤（4）中衍生后样品液中目标化合物母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且样品液中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当基质标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种目标化合物；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种目标化合物。

2.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（2）优选甲醇水溶液的体积浓度为20%。

3.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（2）中基质分散固相萃取剂为C18，每毫升样品液中C18为50mg。

4.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（4）中硼酸钠溶液浓度为5%，每毫升待衍生样品液或标准工作溶液中加入0.2mL。

5.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（4）中9-芴基氯甲酸酯丙酮溶液的浓度为1.0g/L，每毫升待衍生样品液或标准工作溶液中加入0.2mL。

6.如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤（5）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液（pH9），流动相B：乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量10μL；

其中步骤（5）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

A和B的%是体积比例。

7.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（5）中液相色谱的色谱柱填料为C18，柱温为30℃。

8.如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤（5）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为+3500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

9.如权利要求1所述的测定方法，其特征是步骤（1）和（2）中的涡旋振荡时间1min。

10.如权利要求1所述的测定方法，其特征是上述步骤（1）～（5）中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。