CN103837388A

CN103837388A - 一种用于强极性农药残留检测的前处理方法

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Publication number: CN103837388A
Application number: CN201410098242.9A
Authority: CN
Inventors: 刘靖靖; 汤志旭; 王骏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-03-16
Filing date: 2014-03-16
Publication date: 2014-06-04

Abstract

本发明公开了一种用于强极性农药残留检测的前处理方法，首先用甲醇水溶液提取样品中的强极性农药，用分散固相萃取剂对提取液进行净化，过滤后用于仪器分析。本发明是对已有QuEChERS方法的补充和改进，弥补了现有国际广泛认可使用的QuEChERS方法至今尚无法用于强极性农药检测的不足。本发明操作简便、重现性好，有效保证了强极性化合物的回收率，同时净化有效去除了样品提取液中的杂质，减少了对检测仪器的污染，大大提高了检测灵敏度。

Description

一种用于强极性农药残留检测的前处理方法

技术领域

本发明属于农药残留量的测定技术领域，具体地说涉及一种强极性农药残留量测定的前处理方法。

背景技术

QuEChERS方法是代表快速、简单、价廉、高效、稳定和安全（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）的样品前处理方法。2003年美国农业部（USDA）的科学家首次提出了农药分析的QuEChERS方法，美国FDA和欧盟等实验室也相继参与研究和制定标准方法，期间得到不断修改完善。目前国际广泛认可使用的QuEChERS方法有欧盟制定的EN15662和美国官方分析化学师协会的AOAC2007.01标准方法。上述方法都包括提取、净化2个步骤：其中1用乙腈或含1％乙酸的乙腈提取样品，通过加入缓冲盐混合物进行盐析萃取实现乙腈和样品所在水相的液-液分离；2用分散固相萃取剂和无水硫酸镁对提取溶液净化，分散固相萃取剂的选择依据样品基质和待测化合物的性质，如去除极性的有机酸、一些糖类和脂类可选择PSA，但PSA对酸性待测化合物有吸附，去除色素可选择GCB进行净化，但GCB对平面结构待测化合物有吸附，去除脂类和固醇可选择C18。但都必须加入无水硫酸镁以去除中乙腈中残留的水分。由于QuEChERS方法简单、容易操作，QuEChERS方法用于多种基质中几百种农药的方法已被开发和验证，广泛的应用于果蔬、牛奶、谷物、植物油、茶叶、土壤等产品中多种农药残留的测定。目前已有Agilent等多家供货商提供用于第一步提取的缓冲盐试剂盒商品和用于第二步净化的硫酸镁、分散固相萃取剂试剂盒商品。

但是现有的QuEChERS方法不能用于强极性农药的处理：如百草枯、敌草快、野燕枯、灭锈胺、矮壮素、灭蝇胺、草甘膦、草铵磷、氨甲基膦酸、N-乙酰基草铵磷、乙磷铝、乙烯利、二乙醇胺、三乙醇胺、吗啉、乙烯硫脲等农药。因为强极性化合物极易溶于水，无法用乙腈或含1％乙酸的乙腈从水相中萃取。因此通常采用固相萃取柱净化，但其步骤复杂，且对操作技术人员的要求较高；虽然也有方法提取后不经净化直接进样检测，显然杂质对方法干扰大，并且对检测仪器污染严重。因此寻求和建立适应强极性农药残留检测、以进一步完善经典的QuEChERS方法是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种适用于强极性农药残留检测的前处理方法，以弥补现有技术的不足。

本发明的另一目的是提供一种样品前处理方法，以弥补现有国际广泛认可使用的QuEChERS方法至今尚无法用于强极性农药检测的不足。

本发明是对已有QuEChERS方法的补充和改进：由于强极性农药极易溶于水的特性，现有QuEChERS方法用乙腈或含1％乙酸的乙腈从水相中盐析萃取的提取方法无法实用，本发明选用甲醇水溶液为提取溶剂从样品中直接提取，有效保证了强极性农药的提取效率，回收率可达85%以上。在净化步骤，考虑到提取溶剂主要是水，所以现有方法加入无水硫酸镁以去除提取液中残余水分的方法并不可行，因此本发明仅使用分散固相萃取剂对提取液进行净化，而不加入无水硫酸镁。从而实现了对强极性农药的优化性的QuEChERS方法。

本发明的技术方案是：

用于强极性农药残留检测的样品前处理方法，分为提取和净化2个步骤。

（1）提取

称取均质化的样品于具塞离心管中，加入甲醇水溶液，涡旋振荡，离心，上清液待净化；

（2）净化

然后取上清液于装有分散固相萃取剂的离心管，涡旋振荡，离心，上清液过0.22μm滤膜后，所得样品液用于仪器分析。

上述步骤（1）中甲醇水溶液的体积浓度优选20%。

上述步骤（1）与现有QuEChERS方法用乙腈或含1％乙酸的乙腈从样品所在水相中盐析萃取不同的是：用甲醇水溶液直接从样品中提取。

上述步骤（2）中基质分散固相萃取剂优选C18、PSA中的一种或两种组成，每毫升提取液中C18或PSA加入量分别为50mg。

上述步骤（2）与现有QuEChERS方法加入无水硫酸镁以去除多余水分不同的是：不加入无水硫酸镁。

上述步骤（1）～（2）中的涡旋振荡时间是1min。

上述步骤（1）和（2）中的离心5000r/min，离心时间3～5min。

上述步骤（1）～（2）中样品接触到的包括离心管在内容器均应为塑料材质。

本发明弥补现有QuEChERS方法不能用于强极性农药残留检测样品处理的缺陷，方法简便容易操作，能够保证强极性化合物的回收率，同时有效去除了样品提取液中杂质，从而减少了对检测仪器的污染，大大提高了检测灵敏度。

附图说明

图1.为以苹果为基质，浓度为10ng/mL的百草枯提取离子色谱图。

图2.为以胡萝卜为基质，浓度为50.0ng/mL的草甘膦多反应监测色谱图。

图3.为以胡萝卜为基质，浓度为50.0ng/mL的氨甲基磷酸多反应监测色谱图。

图4.为以胡萝卜为基质，浓度为50.0ng/mL的草铵膦多反应监测色谱图。

具体实施方式

现仅以以下4种农药的实施例说明本发明在强极性农药检测前处理的具体应用，完全可以作为QuEChERS方法的补充和改进。但并不是限制本发明的范围。

本发明实施例中使用的仪器与试剂如下：

CR21GⅢ型高速冷冻离心机（Hitachi，Japan）；MS3型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200高效液相色谱-6520四级杆飞行时间质谱（Agilent，USA）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；PSA分散固相萃取剂（Agilent，USA）；C18分散固相萃取剂（Agilent，USA）。

试剂：甲醇（HPLC级，Merke，Germany）；甲酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；甲酸（HPLC级，CNW，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；氨水（分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司）。

标准物质：百草枯纯度为97.5%，购自德国Dr Ehrenstorfer公司；草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸，纯度均大于99%，购自Sigma公司。

实施例1：苹果中百草枯残留量的检测

（1）样品前处理

称取经均质化的苹果样品10.0g于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL甲醇水溶液，涡旋振荡1min，5000r/min离心5min，上清提取液待净化。取2mL上清提取液至装有100mg C18和100mg PSA的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min，上清液过0.22μm滤膜后，供液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q TOF）测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取25±0.1mg标准品于25mL塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；

用经检测不含百草枯的苹果作为空白样品，通过上述前处理步骤（1）制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成10、20、50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液。

（3）液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（LC-Q TOF）测定

定量测定：将步骤（3）中的各浓度基质标准工作液进行LC-Q TOF测定，以各浓度基质标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）得到的样品液注入LC-Q TOF进行测定，测得样品液中百草枯的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中百草枯含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中百草枯残留量。

其中色谱条件为：BEH HILIC色谱柱(2.1mm×100mm,1.7μm;美国Waters)；流动相：甲醇和含0.1%甲酸-5mmol/L甲酸铵水，以体积比20:80等度洗脱；流速：0.2mL/min；柱温：30℃；进样量：2μL。

其中质谱参数为：电喷雾源（ESI）正离子模式扫描；干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min，雾化气压力275.8kPa，毛细管电压4kV，毛细管出口电压190V，扫描方式：一级全扫描，参比离子m/z121.050873与m/z922.009798，扫描范围50-1100m/z。

定性鉴定：检测步骤（2）得到的样品液中目标物，若其准分子离子色谱峰保留时间与基质标准工作溶液一致；且其准确质量数与浓度相当基质标准溶液中目标物的准确质量数的相对标准偏差不超过5ppm时，则判断该样品中存在百草枯；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含百草枯。标准工作曲线和检出限：

以基质标准工作溶液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。以3倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为检出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为定量限(LOQ)，获得各目标物的检出限和定量限。结果显示(如表1所示)，相关系数大于0.999，定量限和检出限分别为10μg/kg和5μg/kg。

表1百草枯的保留时间、回归方程、相关系数、定量限和检出限

加标回收率和重复性如下：

用经检测不含百草枯的苹果作为空白样品，加入上述低中高不同浓度水平的百草枯标准溶液，添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表2。

表2百草枯的回收率和重复性（n=6）

由表2可以看出，在3个加标水平上，百草枯的回收率为80.6%～96.8%，相对标准偏差（RSD）为3.9%～7.1%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

显然，本发明能弥补现有技术中强极性农药百草枯残留检测无法使用QuEChERS方法前处理的技术缺陷，提高LC-Q TOF检测的灵敏度,实现食品中百草枯残留的准确分析。

实施例2：胡萝卜中草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的胡萝卜样品10.0g于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL甲醇水溶液，涡旋振荡1min，5000r/min离心5min。离心后，取2mL上清提取液至装有100mg C18的离心管中，涡旋1min，5000r/min离心3min。上清液过0.22μm滤膜后，待衍生。

（2）标准工作溶液的配制

称取标准品25±0.1mg于25mL塑料容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸标准储备液各1.0mL置于100mL塑料容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL混合标准中间液；

用经检测不含草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸的胡萝卜作为空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将混合标准中间液用空白基质溶液稀释配制成50、100、200、500、1000ng/mL系列基质标准工作溶液，待衍生。

（3）衍生

取待衍生液1mL，加入5%硼酸钠溶液0.2mL、1.0g/L9-芴基氯甲酸酯丙酮溶液0.2mL，混匀，衍生2h。衍生后的样品液和系列基质标准工作液待测定。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中目标物的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中目标物含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中目标物残留量。其中色谱条件为：

其中，色谱柱：Extend C18，150mm×2.1mm（内径），3.5μm（粒径）；流动相：（A）水（含5mmol/L乙酸铵，pH9）；（B）乙腈；流速：0.3mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序如表3。

表3：实施例1的梯度洗脱程序

时间（min）	A（%）	B（%）
			0	90	10
1.0	90	10
			1.1	60	40
3.0	60	40
			3.1	90	10
9.0	90	10

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描；电喷雾电压：+3500V；雾化气压力：275.9kPa；干燥气：氮气，350℃，流速为10.0L/min；MRM检测参数见表4。

表4实施例2的MRM检测参数

*为定量离子对。

定性鉴定：对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表5。

表5胡萝卜基质中草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸标准工作曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				草铵磷	6.19	Y=2636.44X+1732.09	0.9997
草甘膦	3.62	Y=5976.97X-153.1	0.9995
				氨甲基磷酸	6.50	Y=9988.29X+3.20	0.9998

加标回收率和重复性：

选取大豆、苹果、胡萝卜、红茶、香蕉空白样品中，分别添加0.05、0.10、0.50mg/kg浓度水平的草铵膦、草甘膦和氨甲基磷酸标准溶液，然后分别进行前处理待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差。三种化合物的平均回收率70.5%～91.2%，相对标准偏差（RSD）为4.5%～7.3%。

以3倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N)对应的样品中目标物浓度作为定量限(LOQ)，草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸的检出限均为20μg/kg。草铵磷、草甘膦和氨甲基磷酸的定量限均为50μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求。

Claims

1.一种用于强极性农药残留检测的样品前处理方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）提取

称取均质化的样品于具塞离心管中，加入甲醇水溶液，涡旋振荡，离心，上清提取液待净化；

（2）净化

然后取上清液于装有分散固相萃取剂的离心管，涡旋振荡，离心，上清液过0.22μm滤膜后，所得样品液即可用于仪器分析。

2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征是上述步骤（1）中甲醇水溶液的体积浓度优选20%。

3.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征是上述步骤（2）中基质分散固相萃取剂优选C18、PSA中的一种或两种组成，每毫升提取液中C18或PSA加入量分别为50mg。

4.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征是上述步骤（1）和（2）中的离心5000r/min，离心时间3～5min。

5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征是上述步骤（1）和（2）中的涡旋振荡时间是1min。

6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征是上述步骤（1）提取和步骤（2）净化中样品接触到的包括离心管在内的容器均应为塑料材质制成。

7.权利要求1所述的前处理方法应用于强极性农药残留的检测。