CN103592404A

CN103592404A - 一种检测果蔬中有机铜农药残留量的方法

Info

Publication number: CN103592404A
Application number: CN201310618904.6A
Authority: CN
Inventors: 王秀国; 李义强; 闫晓阳; 宋超
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN103592404B

Abstract

本发明提供了一种检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测，具体包括以下步骤：(1)标准溶液的配制；(2)样品中加入破络剂破络，然后加入甲醇，涡旋振荡、超声提取；(3)净化；(4)仪器检测：用步骤(1)中的系列浓度标准工作液进样，UPLC-MS/MS检测，对步骤(3)收集的净化样品进行UPLC-MS/MS检测；(5)标准曲线的建立；(6)结果分析，计算试样中有机铜农药的含量。该方法能够快速、准确的检测果蔬中有机铜农药残留量，具有简便迅速、准确可靠的特点，对指导有机铜农药的安全合理使用，控制果蔬中有机铜残留具有重要价值。

Description

一种检测果蔬中有机铜农药残留量的方法

技术领域

本发明属于痕量分析技术领域，具体涉及一种采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法(QuEChERS-UPLC-MS/MS)检测果蔬中有机铜农药残留量的方法。

背景技术

铜制剂作为一种多作用位点杀菌剂，其杀菌作用主要取决于制剂释放的铜离子浓度。铜盐喷施到作物表面后，在植物分泌的有机酸或呼吸作用释放出的二氧化碳与水形成的碳酸的作用下，可以逐步分解，缓慢释放铜离子起到杀菌作用。

铜制剂包括有机铜制剂和无机铜制剂两种。由于无机铜杀菌剂不能与其他酸性农药混用且易产生药害，近年来有机铜制剂得到明显重视和显著发展。有机铜作为一种螯合物，对作物上真菌、细菌性等病害具有良好预防与治疗作用，在作物表面形成一层严密的保护膜，能够防治番茄、黄瓜等蔬菜中的霜霉病以及梨、苹果等水果的轮纹病。随着有机铜在农业中的广泛应用，加强对该类农药在农作物中的残留量检测对保护人类身体健康具有重要意义。

目前，国内外关于有机铜残留量的检测报道较少。未见适合大部分有机铜农药的检测方法报道。除此之外，已报道的前处理过程繁琐，检测灵敏度低，抗干扰能力较弱。

《新疆农业大学学报》2008年第31卷第4期公开了一种反相高效液相色谱法测定黄瓜和土壤中的喹啉铜残留量的方法。黄瓜中喹啉铜残留是用盐酸和乙腈加热超声提取，正己烷萃取，无水硫酸钠脱水，旋转蒸发仪上浓缩，乙腈定容并超声，高效液相色谱测定。而对于土壤中喹啉铜的提取，而采用了氢氧化钠和乙腈加热提取，石油醚萃取，无水硫酸钠脱水，旋转蒸发仪上浓缩，乙腈定容并超声，高效液相色谱测定。检测实践发现，这种残留分析方法存在以下不足：1）溶剂浪费严重，对环境污染较大；2）操作过程繁琐，处理费时，劳动强度大；3）提取率低；4）检测灵敏度低，易受杂质干扰。

发明内容

本发明的目的在于弥补目前有机铜农药检测技术的不足，提供一种快速、准确的检测果蔬中有机铜农药残留量的方法。该方法具有简便迅速、准确可靠的特点，对指导有机铜农药的安全合理使用，控制果蔬中有机铜残留具有重要价值。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法（QuEChERS-UPLC-MS/MS）检测，具体包括以下步骤：

(1)标准溶液的配制：称取标准品，用有机溶剂溶解定容，制成标准储备液，将标准储备液逐级稀释，配制成系列浓度标准工作液；

(2)提取：称取样品于离心管中，加入破络剂，涡旋振荡，然后加入甲醇，涡旋振荡、超声提取、离心，取上清液，定容；

(3)净化：量取步骤(2)中提取液于离心管中，然后加入N-丙基乙二胺(PSA)和C18吸附剂，离心，取上清液；

(4)仪器检测：待仪器状态稳定后，用步骤(1)中的系列浓度标准工作液进样，UPLC-MS/MS检测，在此基础上，对步骤(3)收集的净化样品进行UPLC-MS/MS检测；

(5)标准曲线的建立：采用峰面积定量，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(6)结果分析：按以下公式计算试样中有机铜农药的含量

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C_标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V_标—标准溶液进样体积，单位μL；

S_样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V_终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V_样—样品溶液进样体积，单位μL；

S_标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g。

进一步地，所述有机铜包括喹啉铜、壬菌铜、噻森铜、噻菌铜、松脂酸铜、琥珀肥酸铜、硝基腐殖酸铜、氨基酸铜、环烷酸铜。

进一步地，所述破络剂包括硫化钠(Na₂S)、硫酸亚铁（FeSO₄）、次氯酸钠(NaClO)、Fenton试剂。

进一步地，所述步骤(1)中称取标准品的重量为0.01g±0.2mg；有机溶剂采用色谱甲醇。

进一步地，所述步骤(1)中标准储备液是指制成100mg/L储备液。

进一步地，所述步骤(2)中破络剂使用量为0.1g/g试样；甲醇使用量为1mL/g试样；

进一步地，所述步骤(3)中的PSA、C18使用量均为0.05g/mL提取液。

进一步地，所述步骤(4)中UPLC-MS/MS选用Thermo Scientific TSQQuantum Ultra；色谱柱选用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱(2.1×100mm,3.0μm)；

色谱检测条件：

柱温：25℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件为:0～2min，保持40%A;2～4.5min，80%～20%A；4.5～10min，保持80%A;10～12min，80%～40%A;12～15min，保持40%A；

流速：0.20mL/min；

进样量：10μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：正离子源/负离子源；

喷雾电压：3200V/2800V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：45Arb；

辅助气压力：15Arb；

检测方式：多重反应监测（MRM）。

进一步地，所述步骤(5)中进样浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明采用破络剂，克服了有机铜络合物难于直接仪器检测的问题。

2、本发明采用分散固相萃取(QuEChERS)提取和净化。与单一的液液萃取或柱层析相比，不仅操作简便，而且净化效果更好，能够有效去除果蔬中杂质。不仅提高了检测的准确性，而且能够有效减小杂质对色谱柱和检测器的污染，提高仪器的使用寿命。

3、本发明通过UPLC-MS/MS检测有机铜农药解络合后的产物来反映果蔬中有机铜农药含量，不仅干扰小，而且准确度高，能够准确方便、快速的检测果蔬中有机铜农药的含量，其最小检出量为1.2×10^-11g，最低检出浓度为0.01mg/kg。

本发明的检测方法能够快速、灵敏、准确的测定果蔬中有机铜农药残留量，为有机铜农药的检测提供了一种新的检测技术。

附图说明

图1是实施例1的8-羟基喹啉(喹啉铜解络合产物)标准色谱图；

图2是实施例1的西红柿空白样品色谱图；

图3是实施例1的添加喹啉铜的西红柿样品色谱图；

图4是实施例2的壬基酚磺酸(壬菌铜解络合产物)标准色谱图；

图5是实施例2的黄瓜空白样品色谱图；

图6是实施例2的添加壬菌铜的黄瓜样品色谱图；

其中，图1、3中的色谱峰代表8-羟基喹啉；4、6中的色谱峰代表壬基酚磺酸。

具体实施方式

下面分别以西红柿中喹啉铜残留量检测和黄瓜中壬菌铜残留量检测为例，并结合附图详述本发明的技术方案，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。

实施例1：西红柿中喹啉铜残留量的检测

(1)提取

称取5.0g西红柿样品于50mL离心管中，加入1g Na₂S，于涡旋振荡仪上充分涡旋震荡2min，然后加入15mL甲醇，涡旋振荡2min，超声波提取1h(超声期间，每20min晃动一次)，离心机上4000rpm离心10min。加入5mL甲醇重复提取一次。合并两次提取上清液，于25ml容量瓶中定容，混匀。

(2)净化

取1mL提取液于2mL离心管中，加入50mg PSA和50mg C18吸附剂，于13000rpm超高速离心机上离心10min。取上清液，过0.45μm滤膜，待测。

(3)UPLC-MS/MS检测

UPLC检测条件为：

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(2.1×100mm,3.0μm)；

柱温：25℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱条件为:0～2min，保持40%A;2～4.5min，80%～20%A；4.5～10min，保持80%A;10～12min，80%～40%A;12～15min，保持40%A；

流速：0.20mL/min；

进样量：10uL；

MS/MS条件为：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：正离子源；

喷雾电压：3200V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：45Arb；

辅助气压力：15Arb；

检测方式：多重反应监测（MRM）如下表：

在上述条件下所得的标准色谱图见图1。保留时间为1.6min。

(4)标准曲线的建立

称取0.0100g8-羟基喹啉标准品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L储备液。将8-羟基喹啉标准储备液逐级稀释，配制成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L的标准工作液。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为：y=15224527x+15994，相关系数r=0.9998。

(5)计算公式

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C_标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V_标—标准溶液进样体积，单位μL；

S_样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V_终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V_样—样品溶液进样体积，单位μL；

S_标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g；

(6)添加回收率试验

在西红柿空白样品中添加0.01～1.0mg/kg喹啉铜标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测，验证本发明方法的可靠性。结果见表1。结果表明，喹啉铜在西红柿中添加浓度为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg时，平均回收率83.9%～92.6%，相对标准偏差1.9%～3.3%。回收率和相对标准偏差均符合农药残留试验的要求。

表1喹啉铜在西红柿中添加回收率试验结果

西红柿空白样品色谱图见图2；添加喹啉铜的西红柿样品色谱图见图3。

由图2可以看出，本发明对样品中的杂质净化效果较好，西红柿空白样品中基本无杂质峰出现，喹啉铜(8-羟基喹啉)本底值为0，对本实验不会形成干扰。由图3可以看出，目标峰峰形良好，与邻近的干扰峰有良好的分离；邻近的干扰峰较小，对结果的分析不会产生偏差。

实施例2：黄瓜中壬菌铜残留量的检测

(1)提取

称取5.0g黄瓜样品于50mL离心管中，加入1g Na₂S，于涡旋振荡仪上充分涡旋震荡2min，然后加入15mL甲醇，涡旋振荡2min，超声波提取1h(超声期间，每20min晃动一次)，离心机上4000rpm离心10min。加入5mL甲醇重复提取一次。合并两次提取上清液，于25mL容量瓶中定容，混匀。

(2)净化

(3)UPLC-MS/MS检测

UPLC检测条件为：

Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18(2.1×100mm,3.0μm)；

柱温：25℃；

流速：0.20mL/min；

进样量：10μL；

MS/MS条件为：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：负离子源；

喷雾电压：2800V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：45Arb；

辅助气压力：15Arb；

检测方式：多重反应监测（MRM）如下表：

在上述条件下所得的标准色谱图见图4。保留时间为4.6min。

(4)标准曲线的建立

称取0.0100g壬基酚磺酸标准品，用甲醇溶解定容至100mL，制成100mg/L储备液。将壬基酚磺酸标准储备液逐级稀释，配制成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L的标准工作液。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得标准曲线回归方程为：y=18313437x+26917，相关系数r=0.9998。

(5)计算公式

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C_标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V_标—标准溶液进样体积，单位μL；

S_样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V_终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V_样—样品溶液进样体积，单位μL；

S_标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g；

(6)添加回收率试验

在黄瓜空白样品中添加0.01～1.0mg/kg壬菌铜标准品溶液，每个浓度重复5次，按上述方法提取、净化和检测，验证本发明方法的可靠性。结果见表1。结果表明，壬菌铜在黄瓜中添加浓度为0.01mg/kg、0.1mg/kg、1.0mg/kg时，平均回收率92.6%～95.9%，相对标准偏差1.7%～2.5%。回收率和相对标准偏差均符合农药残留试验的要求。

表2壬菌铜在黄瓜中添加回收率试验结果

黄瓜空白样品色谱图见图5；添加壬菌铜的黄瓜样品色谱图见图6。由图5可以看出，黄瓜空白样品中壬菌铜(壬基酚磺酸)本底值为0，对本实验不会形成干扰。

实施例1和2采用破络剂Na₂S，克服了有机铜络合物难于直接仪器检测的问题，而且Na₂S价格便宜、效果好、应用条件宽松，在有机铜农药检测中具有应用推广价值。

采用分散固相萃取(QuEChERS)提取和净化，不仅操作简便，而且净化效果更好，能够有效去除果蔬中杂质，提高了检测的准确性，能够有效减小杂质对色谱柱和检测器的污染，提高仪器的使用寿命。通过UPLC-MS/MS检测有机铜农药解络合后的产物来反映果蔬中有机铜农药含量，不仅干扰小，而且能够准确方便、快速的检测果蔬中有机铜农药的含量，其最小检出量为1.2×10^-11g，最低检出浓度为0.01mg/kg。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于采用分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法检测，具体包括以下步骤：

(1) 标准溶液的配制：称取标准品，用有机溶剂溶解定容，制成标准储备液，将标准储备液逐级稀释，配制成系列浓度标准工作液；

(2) 提取：称取样品于离心管中，加入破络剂，涡旋振荡，然后加入甲醇，涡旋振荡、超声提取、离心，取上清液，定容；

(3) 净化：量取步骤(2)中提取液于离心管中，然后加入PSA和C18吸附剂，离心，取上清液；

(4) 仪器检测：待仪器状态稳定后，用步骤(1)中的系列浓度标准工作液进样，UPLC-MS/MS检测，在此基础上，对步骤(3)收集的净化样品进行UPLC-MS/MS检测；

(5) 标准曲线的建立：采用峰面积定量，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(6) 结果分析：按以下公式计算试样中有机铜农药的含量

R—样品中所含农药残留量，单位mg/kg；

C _标—标准溶液浓度，单位mg/L；

V _标—标准溶液进样体积，单位μL；

S _样—样品溶液中被测农药的峰面积；

V _终—样品溶液最终定容体积，单位mL；

V _样—样品溶液进样体积，单位μL；

S _标—标准溶液中被测农药的峰面积；

W—样品称样重量，单位g。

2.根据权利要求1所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述有机铜包括喹啉铜、壬菌铜、噻森铜、噻菌铜、松脂酸铜、琥珀肥酸铜、硝基腐殖酸铜、氨基酸铜、环烷酸铜。

3.根据权利要求1或2所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述破络剂包括硫化钠、硫酸亚铁、次氯酸钠、Fenton试剂。

4.根据权利要求3所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中称取标准品的重量为0.01 g±0.2 mg；有机溶剂采用色谱甲醇。

5.根据权利要求3所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述步骤(1)中标准储备液是指制成100 mg/L储备液。

6.根据权利要求3所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述步骤(2)中破络剂使用量为0.1g/g试样；甲醇使用量为1 mL/g试样。

7.根据权利要求3所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的PSA、C18使用量均为0.05g/mL提取液。

8.根据权利要求3所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中UPLC-MS/MS选用Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra；色谱柱选用Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱；

色谱检测条件：

柱温：25℃；

流动相：A相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件为: 0~2 min，保持40%A ; 2~4.5 min，80%~20%A；4.5~10 min，保持80%A; 10~12 min，80%~40%A; 12~15 min，保持40%A；

流速：0.20 mL/ min；

进样量：10 μL；

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源ESI；

扫描方式：正离子源/负离子源；

喷雾电压：3200V/2800V；

毛细管温度：350℃；

鞘气压力：45 Arb；

辅助气压力：15 Arb；

检测方式：多重反应监测。

9.根据权利要求3所述检测果蔬中有机铜农药残留量的方法，其特征在于：所述步骤(5)中进样浓度为0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L。