CN104965034A - 化妆品中杜鹃醇的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了化妆品中杜鹃醇的检测方法，包括如下步骤：首先对样品进行前处理，将待测样本利用乙醇溶解，混匀，然后超声提取，利用滤膜过膜后得到样品提取液。配置杜鹃醇标准溶液系列，利用高效液相色谱串联质谱法上机测定，根据测定结果得到标准溶液含量-结果的标准曲线。然后采用高效液相色谱串联质谱法或超高效液相色谱法对上述样品提取液上机检测，根据标准曲线得到样品中杜鹃醇的含量。本发明采用HPLC-MS/MS的方案操作方法简单，而且灵敏度高、测试结果的准确性和稳定性均十分良好，采用UPLC检测则还可以实现样品的快速检测。

Description

化妆品中杜鹃醇的检测方法

技术领域

本发明涉及化妆品检测领域，具体涉及化妆品中杜鹃醇的检测方法。

背景技术

杜鹃醇，化学名为4-(4-羟苯基)-2-丁醇，其分子式是C₁₀H₁₄O₂，分子量为166.2，纯品为白色粉末，易溶于水，溶于甲醇、乙醇和乙腈等有机溶剂。现代美白化妆品中有效成分大多来自天然植物提取物，如熊果苷、中草药提取物和杜鹃醇等，其中杜鹃醇广泛分布于白桦和日光槭，具有有效抑制黑色素形成的作用。然而，正是由于杜鹃醇具有抑制黑色素合成的作用，从而干扰了皮肤中酪氨酸向黑色素的正常酶转化过程，添加了杜鹃醇的美白化妆品会造成皮肤美白过度而出现白斑等过敏症状。

因此有必要建立快速有效检测杜鹃醇的方法，以鉴别各类美白化妆品是否含有杜鹃醇。目前国内外文献中对杜鹃醇的报道主要集中于其在生物体内赋存状况和其生物合成方法等方面，具体涉及到杜鹃醇的检测技术以及化妆品中杜鹃醇的检测技术还很少，几乎处于空白状态。

发明内容

本发明的目的在于提供化妆品中杜鹃醇的检测方法，以便能够快速简便，定性定量的准确检测出化妆品中的杜鹃醇含量。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：

一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，采用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定，包括如下步骤：

(1)样品的前处理：将待测样本利用乙醇溶解，混匀，然后超声提取，利用滤膜过膜后得到样品提取液；

(2)标准曲线测定：配置杜鹃醇标准溶液系列，利用高效液相色谱串联质谱法上机测定，根据测定结果得到标准溶液含量-结果的标准曲线；

(3)上机检测：采用高效液相色谱串联质谱法对上述样品提取液上机检测，色谱条件为：粒径为1.9微米的C18色谱柱，流动相为甲醇-氨水溶液，梯度洗脱的方式；质谱条件为：大气压化学离子源负离子检测模式，放电针电流为4.0μA，母离子分子量为165，子离子分子量(碰撞能量)为93(25eV)、106(20eV)、119(21eV)、121(18eV)，其中106为定量离子。

优选的，所述梯度洗脱程序为：0-1min采用体积比为30:70的甲醇-氨水，1.15-3.5min采用体积比为45:55的甲醇-氨水，第一斜坡时间为0.15min，3.7-4.5min采用体积比为30:70的甲醇-氨水，第二斜坡时间为0.2min。

优选的，步骤(1)中，所述超声提取后，离心分离，将上清液经滤膜过膜后得到样品提取液。

优选的，所述离心速度为8000转/分，离心时间为10分钟。

优选的，步骤(1)中，所述超声提取后，取样用体积比为30:70的甲醇-氨水溶液定容至10倍体积，然后经滤膜过膜后得到样品提取液。

优选的，所述氨水的体积百分比浓度为0.05％。

优选的，所述滤膜为0.22微米水相滤膜。

优选的，所述杜鹃醇标准溶液系列中包括空白样。

优选的，所述高效液相色谱串联质谱法中，高效液相色谱的进样量为10微升。

本发明的优点在于：

(1)利用HPLC-MS/MS测定化妆品中的杜鹃醇，样品前处理步骤快速简单，而且样品上机洗脱检测时间也短，可以在5min实现对杜鹃醇的定量定性分析。

(2)采用高效液相色谱串联质谱的方法，与仅采用高效液相色谱相比，其检测结果更加精确，因为液相图谱可能会存在其他物质的干扰，仅根据液相图谱并不能完全确认测定结果就是样品中的杜鹃醇，导致结果在定性方面受到质疑，而以质谱的的检测结果加以辅助则可以毫无疑问定性为杜鹃醇。

(3)利用该方法检测的灵敏度高，样品的检测限可低至0.1mg/kg，测试结果的准确性和稳定性均十分高，加标回收率达到80.6％-110％，相对标准偏差(RSD)为3.08％-10.5％，回收率和精密度良好。

本发明还提供了一种化妆品中杜鹃醇的快速检测方法，采用超高效液相色谱(UPLC)法测定，包括如下步骤：

(1)样品前处理：将待测样品利用乙醇溶解，混匀，然后超声提取，利用滤膜过膜后得到样品提取液；

(2)标准溶液配置：配置杜鹃醇标准溶液系列，利用超高效液相色谱法上机测定，根据测定结果得到标准溶液含量-结果的标准曲线；

(3)上机检测：以乙腈与水溶液为流动相，二极管阵列检测器检测，采用超高效液相色谱法对上述样品提取液上机检测，所述超高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为粒径为1.7微米的C18色谱柱，检测波长为280纳米，流动相为体积比为75:25的水-乙腈溶液，洗脱采用等度洗脱，进样量为1微升。

与现有技术相比，本发明的优点在于，利用UPLC检测化妆品中的杜鹃醇，实现了样品的快速检测。首先，样品前处理过程快速简便，而且与高效液相色谱(HPLC)相比，UPLC的色谱柱粒径更小，样品分离速度更快，因此样品的检测速度很快，利用该法检测杜鹃醇，每个样品的上机时间仅为2.5min。同时，杜鹃醇的测试结果的准确性和稳定性也十分高，加标回收率达到92.9％-97.1％，相对标准偏差(RSD)仅为0.4％-1.5％，回收率和精密度良好。该方法测定杜鹃醇的样品检出限为200mg/kg，而美白化妆品中杜鹃醇含量需要达到1.8％(18000mg/kg)以上才会起到美白作用，因此本方案完全能够满足化妆品中杜鹃醇的检测要求。

附图说明

图1是本发明利用具体实施方式中所述高效液相色谱串联质谱法测定杜鹃醇的色谱图；

图2是本发明利用具体实施方式中所述高效液相色谱串联质谱法测定杜鹃醇的质谱图；

图3是杜鹃醇分子的质谱碎裂方式示意图；

图4是本发明利用具体实施方式中所述超高效液相色谱法测定杜鹃醇标准溶液的吸收光谱图；

图5是本发明利用具体实施方式中所述超高效液相色谱法测定空白化妆品的色谱图；

图6是本发明利用具体实施方式中所述超高效液相色谱法测定空白化妆品添加杜鹃醇标准溶液的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明提出的化妆品中杜鹃醇的检测方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。

实施例1：高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定化妆品中杜鹃醇的条件选择

1.1样品前处理：采用乙醇做溶剂，溶解杜鹃醇。与甲醇等溶剂相比，乙醇无毒性，更为安全。

1.2流动相及洗脱条件：

采用甲醇-氨水作为流动相，梯度洗脱的方式。与乙腈-水、甲醇-水、乙腈-氨水等流动体系相比，采用甲醇-氨水流动相，可以在短时间内(5min)实现对杜鹃醇的分离检测，而且灵敏度最好。

1.3质谱条件的选择:

在APCI负离子监测模式下，杜鹃醇主要生成[M-H]-准分子离子，离子的质荷比(m/z)为165，其保留时间为2.21min，如图1所示，选择性对[M-H]-进行产物离子扫描分析，结果如图2所示，其母离子和碎片离子以及质谱条件见表1，杜鹃醇生成的主要碎片离子m/z是106，将其作为定量离子，杜鹃醇的碎片离子的碎裂规律如图3所示，碎片离子93是由分子离子165丢失CH₂CH₂CHOCH₃，碎片离子106是由分子离子165丢失CH₂CHOHCH₃形成的，碎片离子119，121是由分子离子165丢失CHOHCH₃形成的。

表1杜鹃醇的母离子、子离子和相关的参数设置

1.4线性关系与检测限：

对不同浓度的杜鹃醇标准溶液依次进样上机测定，以峰面积对质量浓度绘制工作曲线，发现在1μg/L-25μg/L浓度范围内，浓度与其峰面积都成线性关系，相关系数>0.995，样品的检测限为0.1mg/kg，具体结果见表2。

表2化妆品中杜鹃醇的线性方程、相关系数及检测限

1.5方法特异性：

选取具有代表性的水溶液类化妆品和乳状类化妆品进行加标测试，发现利用HPLC-MS/MS对杜鹃醇进行检测，这两类化妆品本身对杜鹃醇的检测结果不会产生干扰。

实施例2：利用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定化妆品中的杜鹃醇

实验所用试剂和样品均为市购商品。

1.1样品的前处理：准确称取1.0g美白化妆品试样(精确至0.001g)于洁净的15mL带刻度离心管中，用乙醇溶解，定容至10.0mL刻度，于漩涡震荡器上混匀后，超声提取10分钟(若提取后样品呈浑浊，以8000r/min离心10min)。取2.00mL上述提取液于另一根洁净的15mL带刻度离心管中，加入甲醇-氨水溶液(甲醇与氨水的体积比为70:30，氨水为0.05％(V/V)的氨水溶液)，定容至10.00mL刻度，摇匀。将摇匀后试样，过0.22μm针式滤膜后，待测。

1.2标准溶液的配置：

(1)杜鹃醇标准贮备液配置：准确称取0.06250g杜鹃醇标准品于25mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，配置成浓度为2.5g/L的杜鹃醇标准贮备液，该溶液在4℃下保存，有效期六个月；

(2)杜鹃醇标准中间液配置：准确移取100μL杜鹃醇标准贮备液于10mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，得到浓度为25.00mg/L的杜鹃醇标准中间液，该溶液需现配现用。

(3)杜鹃醇标准工作溶液配置：准确移取100μL杜鹃醇标准中间液于10mL容量瓶中，用甲醇-氨水溶液(甲醇与氨水的体积比为70:30，氨水为0.05％(V/V)的氨水溶液)定容至刻度，得到浓度为0.2500mg/L的杜鹃醇标准工作溶液，该溶液需现配现用。

(4)分别取10mL容量瓶中各加入0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL的杜鹃醇标准工作溶液，并同时加入1.00mL不含杜鹃醇的空白样(消除样品基质对检测结果产生的干扰作用)，然后用甲醇-氨水溶液(甲醇与氨水的体积比为70:30，氨水为0.05％(V/V)的氨水溶液)定容至刻度。使标准工作系列浓度分别为5.0μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、25μg/L、0μg/L。现配现用。

1.3上机检测：利用HPLC-MS/MS分别对标准溶液和样品进行上机测定，根据标准溶液的测量结果，绘制标准溶液含量-结果的标准曲线，然后利用该标准曲线和样品的上机结果计算样品中杜鹃醇的含量。

高效液相色谱(HPLC)的色谱条件为：

a)色谱仪型号：Thermo ACCELA液相色谱仪；

b)色谱柱：C18色谱柱(2.1*50mm，粒径1.9μm)；

c)流动相：甲醇-氨水溶液，梯度洗脱，梯度洗脱程序见表3

表3梯度洗脱程序对应的洗脱时间与流动相浓度

时间(min)	甲醇比例	0.05％氨水比例
			0	30％	70％
1	30％	70％
			1.15	45％	55％
3.5	45％	55％
			3.7	30％	70％
4.5	30％	70％

c)流速：200μL/min；

d)柱温：室温；

e)进样量：10μL。

质谱(MS)条件：

a)大气压化学离子源(APCI)负离子检测模式；

b)放电针电流：4.0μA；

c)喷雾温度：200℃；

d)去溶剂气：氮气；

e)毛细管温度：270℃；

f)碰撞气：氩气，纯度≥99.99％；

g)碰撞压力：1.5；

h)母离子分子量：165；

i)子离子分子量(碰撞能量)：93(25eV)、106(20eV)、119(21eV)、121(18eV)。106为定量离子。

1.4结果计算：利用外标法定量，样品中杜鹃醇含量用色谱数据处理或按照下列公式进行计算：

$X=\frac{A-b}{a}\×\frac{V_1}{V_2}\×\frac{V_3}{m}\×\frac{1}{1000}$

式中：

X——试样中杜鹃醇含量，单位为mg/kg；

A——样液中杜鹃醇的峰面积；

b——标准曲线的截距；

a——标准曲线的斜率；

V₁——样品分取后定容体积，单位为mL；

V₂——样品分取体积，单位为mL；

V₃——样品溶解定容体积，单位为mL；

m——样品称样质量，单位为g。

实施例3：利用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定杜鹃醇的回收率和精密度试验

对空白化妆品添加不同量的标准溶液进行加标回收率和精密度实验。

参考实施例2的试验方法，在乳状类化妆品和水溶液中分别加入浓度为0.1、0.5、1.0、2.0mg/kg的杜鹃醇，进行6次平行试验，同时分别以不加杜鹃醇的乳状类化妆品和水溶液为本底，根据检测结果测定回收率和相对标准偏差。结果如表4和表5所示：

表4乳液类化妆品加标回收统计表

表5水溶液类化妆品加标回收统计表

根据表4和表5的结果显示，利用该方法测定杜鹃醇的回收率在80.6％～110％，其RSD为3.08％～10.5％，加标回收率和精密度均十分良好，表明HPLC-MS/MS法测定杜鹃醇结果稳定可靠。

实施例4：超高效液相色谱法(UPLC)快速测定化妆品中杜鹃醇的条件选择

4.1样品前处理：采用乙醇做溶剂，溶解杜鹃醇。与甲醇等溶剂相比，乙醇无毒性，更为安全。

4.2流动相及洗脱条件的选择：

采用乙腈-水的流动相进行等度洗脱，水：乙腈＝75:25(体积比)为最优。

4.3检测波长的选择:

采用二极管阵列检测器(Waters Acquity PDA二极管阵列检测器)，以杜鹃醇标准溶液为样品采用UPLC(Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪)进行上机测定，测定杜鹃醇标准溶液的吸收光谱图，如图4所示。

根据图4的结果可以看出，杜鹃醇在221.2和276.9nm处均有吸收峰，但是考虑到在实际分析中，流动相在低波长下基线噪音大，会影响检测。所以本发明采用了280nm为杜鹃醇检测波长，以提高灵敏度。

4.4线性关系与检测限：

对不同浓度的杜鹃醇标准溶液依次进样上机测定，以峰面积对质量浓度绘制工作曲线，发现在2mg/L-12mg/L浓度范围内，浓度与其峰面积都成线性关系，相关系数>0.995，样品的检测限为200mg/kg，具体结果见表6。参考实施例1的结果，虽然UPLC的检测限比HPLC-MS/MS高，即UPLC的灵敏度较低，但是美白化妆品中杜鹃醇含量需要达到1.8％(18000mg/kg)以上才会起到美白作用，因此本发明中UPLC法的杜鹃醇检测限已经能够满足检测要求。

表6化妆品中杜鹃醇的线性方程、相关系数及检测限

4.5方法特异性：

选取具有代表性的水溶液类化妆品和乳状类化妆品进行加标测试，测试结果见图5和图6所示，发现利用UPLC对杜鹃醇进行检测，这两类化妆品本身对杜鹃醇的检测结果不会产生干扰。

实施例5：利用超高效液相色谱法(UPLC)快速测定化妆品中的杜鹃醇

3.1样品前处理：准确称取0.1g美白化妆品样品(精确至0.01g)于10mL具塞比色管中，加入乙醇定容至刻度，于漩涡震荡器上混匀后，超声提取10min，经0.22μm水相滤膜过滤，待测。

3.2标准溶液的配置：

(1)杜鹃醇标准储备液：分别准确称取适量的杜鹃醇标准品，溶入乙醇，配成1000mg/L的标准储备液；

(2)杜鹃醇标准工作液：取标准储备液10.0ml移入10mL容量瓶，用流动相定容到10mL，此溶液含杜鹃醇200mg/L；

(3)分别取10mL容量瓶中各加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL的杜鹃醇标准工作液，用乙醇定容至10mL，杜鹃醇含量分别为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，以此系列浓度的标准溶液上机绘制标准溶液工作曲线。

3.3上机检测：利用UPLC(Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪)分别对标准溶液和样品进行上机测定，根据标准溶液的测量结果，绘制标准溶液含量-结果的标准曲线，然后利用该标准曲线和样品的上机结果计算样品中杜鹃醇的含量。

UPLC色谱条件：

a)采用二极管阵列检测器(Waters Acquity PDA二极管阵列检测器)；

b)色谱柱：BEH C18色谱柱2.1(I.D.)×10mm，粒径1.7μm或相当；

c)检测波长：280nm；

d)流动相：水：乙腈＝75:25；

e)流速：0.2mL/min；

f)柱温：40℃；

g)进样量：1μL。

3.4结果计算：利用外标法定量，样品中杜鹃醇含量利用数据处理系统或按照下列公式进行计算：

式中：

X——样品中杜鹃醇的含量，单位为mg/kg

A_样——样液中杜鹃醇的峰面积

A_标——标准溶液中杜鹃醇的峰面积

m——称取的样品质量，单位为g

C——标准溶液中杜鹃醇的浓度，单位为mg/L

V——样品定容体积，单位为mL

实施例6：利用超高效液相色谱法(UPLC)快速测定杜鹃醇的回收率和精密度试验

对空白化妆品添加不同量的标准溶液进行加标回收率和精密度实验

参考实施例5的试验方法，在乳状类化妆品和水溶液中分别加入浓度为200、400、1000mg/kg的杜鹃醇，进行6次平行试验，同时分别以不加杜鹃醇的水溶液和乳状类化妆品为本底，根据检测结果测定回收率和相对标准偏差。结果如表7和表8所示：

表7水溶液类和乳状类化妆品加标测定结果

表8水溶液类和乳状类化妆品加标回收统计表

根据表7和表8的结果显示，利用该方法测定杜鹃醇的回收率在92.9％～97.1％，其RSD为0.4％～1.5％，加标回收率和精密度均十分良好，结果表明UPLC法测定杜鹃醇结果稳定可靠，而且采用UPLC法测定杜鹃醇，样品测定速度快，每个样品上机检测仅需2.5分钟，与利用高效液相色谱(HPLC)法测定相比，效率大大提高。

上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

Claims (10)

1.一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，采用高效液相色谱串联质谱法测定，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品的前处理：将待测样本利用乙醇溶解，混匀，然后超声提取，利用滤膜过膜后得到样品提取液；

(2)标准曲线测定：配置杜鹃醇标准溶液系列，利用高效液相色谱串联质谱法上机测定，根据测定结果得到标准溶液含量-结果的标准曲线；

(3)上机检测：采用高效液相色谱串联质谱法对上述样品提取液上机检测，色谱条件为：粒径为1.9微米的C18色谱柱，流动相为甲醇-氨水溶液，梯度洗脱的方式；质谱条件为：大气压化学离子源负离子检测模式，放电针电流为4.0μA，母离子分子量为165，子离子分子量/碰撞能量为93/25eV、106/20eV、119/21eV、121/18eV，其中106为定量离子。

2.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：0-1min采用体积比为30:70的甲醇-氨水，1.15-3.5min采用体积比为45:55的甲醇-氨水，第一斜坡时间为0.15min，3.7-4.5min采用体积比为30:70的甲醇-氨水，第二斜坡时间为0.2min。

3.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声提取后，离心分离，将上清液经滤膜过膜后得到样品提取液。

4.根据权利要求4所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，所述离心速度为8000转/分，离心时间为10分钟。

5.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声提取后，取样用体积比为30:70的甲醇-氨水溶液定容至10倍体积，然后经滤膜过膜后得到样品提取液。

6.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，所述氨水的体积百分比浓度为0.05％。

7.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，所述滤膜为0.22微米水相滤膜。

8.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，所述杜鹃醇标准溶液系列中包括空白样。

9.根据权利要求1所述的一种化妆品中杜鹃醇的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱法中，高效液相色谱的样品进样量为10微升。

10.一种化妆品中杜鹃醇的快速检测方法，采用超高效液相色谱法测定，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品前处理：将待测样品利用乙醇溶解，混匀，然后超声提取，利用滤膜过膜后得到样品提取液；

(2)标准溶液配置：配置杜鹃醇标准溶液系列，利用超高效液相色谱法上机测定，根据测定结果得到标准溶液含量-结果的标准曲线；

(3)上机检测：以乙腈与水溶液为流动相，二极管阵列检测器检测，采用超高效液相色谱法对上述样品提取液上机检测，所述超高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为粒径为1.7微米的C18色谱柱，检测波长为280纳米，流动相为体积比为75:25的水-乙腈溶液，洗脱采用等度洗脱，进样量为1微升。