CN103792302A - 一种检测化妆品中杜鹃醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效液相色谱法检测美白类化妆品中杜鹃醇的方法，包括以下步骤：向待测试样中加入醋酸铵水溶液，再加入5%三氯乙酸-乙腈溶液后超声提取，提取液离心，取上清液过微孔滤膜后进行高效液相色谱法测定。采用荧光检测器检测，荧光激发和发射波长分别为280nm和315nm。本发明的高效液相色谱法测定化妆品中杜鹃醇的方法快速、前处理简便、检出限低、回收率高。

Description

一种检测化妆品中杜鹃醇的方法

技术领域

本发明属于化妆品分析领域，具体涉及一种检测化妆品中杜鹃醇的方法。

背景技术

杜鹃醇的化学名称为4-(4-羟苯基)-2-丁醇，纯品为白色粉末，易溶于水，溶于甲醇、乙醇和乙腈等有机溶剂。杜鹃醇主要存在于桦木、槭树科、杉木和郁金等药用植物中，主要作为生物催化法合成香料（如覆盆子酮和白桦苷）的原料；因结构与络氨酸酶活性抑制物质类似，大多具有酚式结构，杜鹃醇具有抑制黑色素合成的作用，因此还被用作化妆品美白成分。然而，正是由于具有抑制黑色素合成的作用，从而干扰了皮肤中络氨酸向黑色素的正常酶转化过程，添加了杜鹃醇美白成分的化妆品会造成皮肤美白过度而出现白斑等过敏症状，目前已有数千起“白斑”症状投诉。

由于杜鹃醇的副作用，2013年9月份，台湾地区发布公告，禁止在化妆品中使用杜鹃醇成分。虽然有厂商将杜鹃醇作为化妆品新原料向国家食药局提出过行政许可申请，但因未通过安全性审批，含有杜鹃醇的化妆品均未获批在我国上市销售。2013年11月份，国家食药总局在《关于调整化妆品许可备案管理有关事宜的通知》中着重加强了对美白类产品管理措施，将宣称有助于皮肤美白或能减轻皮肤表面色素沉着的化妆品，一并纳入祛斑类化妆品管理，自2015年1月1日起，上述产品必须取得特殊用化妆品批准证书后方可组织生产。

为了有效的监控含有杜鹃醇的美白类化妆品，采用有效手段检测化妆品中杜鹃醇的成分是关键。目前国内外文献中对杜鹃醇的报道主要集中于其在生物体内赋存状况和其生物合成方法等方面，未见有涉及到其检测技术研究方面的报道，化妆品中杜鹃醇检测还处于空白状态。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测化妆品中杜鹃醇的方法，该方法样品前处理简便快捷、检测限低，回收率高；能有效的检测出化妆品中的杜鹃醇，为化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，从而保障民众使用化妆品的安全性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种检测化妆品中杜鹃醇的方法，包括如下步骤：

（1）将待测样本加入醋酸铵水溶液中，涡旋后再加入三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液，再经涡旋、超声提取，得到提取液；

（2）将提取液离心，取上清用微孔膜过滤得到提取物溶液；

（3）以乙腈与甲酸水溶液作为流动相溶剂，利用高效液相色谱分析法对所述提取物溶液进行检测。

上述技术方案中，步骤（1）中，醋酸铵水溶液的浓度为0.02 mol/L；对应每克待测样本醋酸铵水溶液的用量为0.75ml。

上述技术方案中，步骤（1）中，第一次涡旋的时间为30s；第二次涡旋的时间为60s；超声提取时间为15min。

上述技术方案中，步骤（1）中，三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的质量分数为5%；三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液中，三氯乙酸水溶液、乙腈的体积比为70∶30。

上述技术方案中，步骤(2)中，离心时的转速为10000 rpm，时间为10 min；微孔膜的孔径为0.22μm。

上述技术方案中，步骤(3)中进行高效液相色谱分析时采用荧光检测器检测，荧光激发波长为280 nm，荧光发射波长为315 nm。

上述技术方案中，步骤(3)的甲酸水溶液中，甲酸的体积分数为0.1%；高效液相色谱分析提取物溶液时采用梯度洗脱，梯度程序为：0 ~ 6 min，25 % 乙腈，6 ~ 7 min，90 % 乙腈，7 ~ 9 min，25 %乙腈。

本发明中，根据高效液相色谱可以检测化妆品中是否含有杜鹃醇，也可以得到化妆品中杜鹃醇的含量。具体方法是，采用杜鹃醇标准品由高效液相色谱分析获得不同杜鹃醇浓度下高效液相色谱检测到的杜鹃醇对应峰的峰面积，制备标准曲线；然后对待测样本的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其杜鹃醇对应峰的峰面积，再与标准曲线对比获得待测样本中杜鹃醇的浓度，再经过计算得出化妆品中杜鹃醇的含量；其中，杜鹃醇标准品可以将杜鹃醇稀释成不同浓度梯度的乙腈溶液制成。

通过高效液相色谱分析法得到待测样液中杜鹃醇的质量浓度，然后按照以下公式计算化妆品中杜鹃醇含量： 

  

式中：

W（杜鹃醇）——化妆品中杜鹃醇质量分数，mg/kg；

c ——待测样液中杜鹃醇的质量浓度，μg/L；

V ——样品定容体积， mL；

m ——样品用量，g。

采用上述技术方案，对化妆品中杜鹃醇的检出限为0.5mg/kg，回收率为83.7~89.2 %，相对标准偏差(RSD)为1.43 ~ 2.83 %。

被检测化妆品基质没有品种、样式的限制，其可以是霜膏、乳液、水剂或者面膜。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:

1．本发明首次提供了一种检测化妆品中杜鹃醇的方法，对化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，对保障民众使用化妆品的安全性具有积极的意义。 

2．本发明在样品前处理时采用醋酸铵水溶液可以使待测样品分散均匀，利于后续的有效提取，采用三氯乙酸水溶液-乙腈混合溶液作为提取液，能够有效提取化妆品中的杜鹃醇，排除其余组分的干扰，同时还可以沉淀样品中的蛋白质，提取液澄清，过膜后即可直接上机测试，且提取液和色谱分离中所用的起始流动相强度相当，方便快捷又避免了因溶剂强度不匹配造成的峰展宽；采用高效液相色谱进行分析时，分离时间短，样品中杂质对目标化合物无干扰，利用荧光检测器检测，选定荧光激发波长和发射波长分别为280 nm和315 nm，在此条件下，可以得到较高的检测灵敏度。

3. 本发明公开的方法对化妆品中杜鹃醇的检出限低至0.5mg/kg，在多种基质中的加标回收率均超过 83 %，相对标准偏差(RSD)为1.43 ~ 2.83 %；检测结果准确，样品前处理简便有效，分析时间短，灵敏度高，能够满足实际化妆品中杜鹃醇检测的要求。

附图说明

图1为实施例一提供的杜鹃醇的浓度-液相色谱峰面积的相互关系图；

图2为实施例一提供的杜鹃醇标准溶液液相色谱图；

图3为实施例二中霜膏供试样品的液相色谱图；

图4为实施例二中乳液供试样品的液相色谱图；

图5为实施例二中水剂供试样品的液相色谱图；

图6为实施例二中面膜供试样品的液相色谱图；

图7为实施例三中添加杜鹃醇的霜膏供试样品的液相色谱图；

图8为实施例三中添加杜鹃醇的乳液供试样品的液相色谱图；

图9为实施例三中添加杜鹃醇的水剂供试样品的液相色谱图；

图10为实施例三中添加杜鹃醇的面膜供试样品的液相色谱图。

具体实施方式

实施例一  建立杜鹃醇标准曲线

将50 mg杜鹃醇（纯度≥85％）溶于乙腈配制成浓度为1000 μg/mL的标准储备液。分别移取标准储备溶液用含有体积百分比0.1%的甲酸-乙腈配制成浓度分别为15，50，100，250，500，1000mg/L共6个浓度的标准工作溶液，取各浓度标准工作液，经0.22μm滤膜过滤， 取10 μL进样按液相色谱条件进行测定，每个系列进样3次，取平均峰面积值。

液相色谱条件： 

高效液相色谱仪，配有荧光检测器（安捷伦1260，美国安捷伦公司）；

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18，100 × 4.6mm(内径)，2.6 μm(粒径)；

流动相：A：体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 6 min，25 % B，6 ~ 7 min，90 % B，7 ~ 9 min，25 % B；

流速：1.0 mL/min；

荧光检测条件：激发波长：280 nm，发射波长：315 nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的杜鹃醇浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线，求得回归方程为y=0.2342 x + 1.1720。如附图1所示，为荧光检测器所检测到的峰面积与杜鹃醇浓度的关系曲线，可见，在0.05 ~1000mg/L浓度范围内，杜鹃醇的浓度值与响应峰面积值之间的相关系数为0.9998，呈良好的线性关系。杜鹃醇的检出限为0.5 mg/kg，能够满足化妆品成分测试的要求。

实施例二 化妆品中杜鹃醇的检测

(一) 试样处理

称取待测样本0.20 g（精确至0.001 g），置于10 mL塑料离心管中，加0.15 mL 0.02 mol/L的醋酸铵水溶液，涡旋30 s，再加5%三氯乙酸-乙腈混合提取液（70:30, V/V）1.85 mL，涡旋60 s后超声提取15 min，然后以10000 rpm转速离心10 min，取上清液通过0.22 μm微孔滤膜，得到提取物溶液，备用；上述待测样本分别为霜膏、乳液、水剂以及面膜。

(二) 液相色谱条件 

高效液相色谱仪，配有荧光检测器（安捷伦1260，美国安捷伦公司）；

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18，100 × 4.6mm(内径)，2.6 μm(粒径)；

流动相：A：体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 6 min，25 % B，6 ~ 7 min，90 % B，7 ~ 9 min，25 % B；

流速：1.0 mL/min；

荧光检测条件：激发波长：280 nm，发射波长：315 nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

(四)试样测定

用自动进样器准确吸取10μL提取物溶液注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。

杜鹃醇标准品色谱图参见附图2所示，从图中可以看出杜鹃醇标准品在280 nm下检测到的出峰时间是2.33min。附图3~6分别为杜鹃醇添加在上述霜膏、乳液、水剂以及面膜化妆品中的出峰情况，结果显示，所有化妆品基质中均未检测到杜鹃醇。

实施例三 添加浓度为1mg/kg杜鹃醇的化妆品中杜鹃醇的检测

(一) 试样处理

以与实施例二中来源相同的霜膏、乳液、水剂以及面膜作为基质，制备含有浓度为1mg/kg杜鹃醇的霜膏、乳液、水剂以及面膜待测样本。

称取待测样本0.20 g（精确至0.001 g），置于10 mL塑料离心管中，加0.15 mL 0.02 mol/L的醋酸铵水溶液，涡旋30 s，再加5%三氯乙酸-乙腈混合提取液（70:30, V/V）1.85 mL，涡旋60 s后超声提取15 min，然后以10000 rpm转速离心10 min，取上清液通过0.22 μm微孔滤膜，得到提取物溶液，备用。

(二) 液相色谱条件 

高效液相色谱仪，配有荧光检测器（安捷伦1260，美国安捷伦公司）；

色谱柱：Phenomenex Kinetex C18，100 × 4.6mm(内径)，2.6 μm(粒径)；

流动相：A：体积浓度为0.1%的甲酸水溶液；B：乙腈；

洗脱方式：梯度洗脱：0 ~ 6 min，25 % B，6 ~ 7 min，90 % B，7 ~ 9 min，25 % B；

流速：1.0 mL/min；

荧光检测条件：激发波长：280 nm，发射波长：315 nm；

柱温：30℃；

进样量：10μL。

(四)试样测定

用自动进样器准确吸取10μL提取物溶液注入高效液相色谱仪，按色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积。

附图7~10分别为杜鹃醇在上述霜膏、乳液、水剂以及面膜样式化妆品中的出峰情况，与附图2比较，结果显示，添加杜鹃醇的化妆品样品基质，均在2.33min处检测到杜鹃醇峰。

(五)结果计算

将待测样本液相色谱图中的峰面积带入实施例一得到的标准曲线得出待测样液中杜鹃醇的质量浓度，然后按照以下公式计算化妆品中杜鹃醇含量：

式中：

W（杜鹃醇）——化妆品中杜鹃醇质量分数，mg/kg；

c ——从标准曲线上查得的待测样液中杜鹃醇的质量浓度，μg/L；

V ——样品定容体积，本实施例中为2 mL；

m ——样品用量，本实施例中为0.2g。

经计算，添加浓度为1mg/kg杜鹃醇的霜膏、乳液、水剂以及面膜待测样本的实际测得值分别为：0.863 mg/kg，0.887 mg/kg，0.924 mg/kg和0.915mg/kg。

实施例四 化妆品中杜鹃醇的检出限、回收率与精密度

按照加标样品10倍信噪比的计算方法，本方法对杜鹃醇的检出限为0.5mg/kg。

准确度指测定值（平均值）与真实值的接近程度，表示分析结果的正确性。采用标准添加法，在化妆品中添加3个不同水平浓度的杜鹃醇进行回收率试验。每个加标水平重复测定6次，同时作空白实验，以回收率大于80%为标准；精密度指用方法重复测定同一均质样品所得的测定值彼此接近程度，表示分析结果的重复性，常用相对标准偏差（RSD）表示。回收率和精密度参见表1。

              表1 杜鹃醇回收率和精密度试验结果（n = 6）

表1结果表明：在基质加标试验中，在四种化妆品产品基质中的加标回收率良好；从相对标准偏差实验数据可看出，针对四种不同基质的实验平行性良好。

综上，本发明提供的检测化妆品中杜鹃醇含量的方法中，样品前处理简便快捷，能有效提取出化妆品中的杜鹃醇，检出限低至0.5mg/kg，回收率均在83%以上，相对偏差小；适用于不同类型化妆品中杜鹃醇含量的准确测定，从而为化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，进而保障民众使用化妆品的安全性。

Claims (9)

1.一种检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将待测样本加入醋酸铵水溶液中，涡旋后再加入三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液，再经涡旋、超声提取，得到提取液；

（2）将提取液离心，取上清用微孔膜过滤得到提取物溶液；

（3）以乙腈与甲酸水溶液作为流动相，利用高效液相色谱分析法对所述提取物溶液进行检测。

2.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤（1）中，醋酸铵水溶液的浓度为0.02 mol/L；对应每克待测样本醋酸铵水溶液的用量为0.75mL。

3.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤（1）中，第一次涡旋的时间为30s；第二次涡旋的时间为60s；超声提取时间为15min。

4.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤（1）的三氯乙酸水溶液中三氯乙酸的质量分数为5%。

5.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤（1）的三氯乙酸水溶液与乙腈组成的混合提取液中，三氯乙酸水溶液、乙腈的体积比为70∶30。

6.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤(2)中，离心时的转速为10000 rpm，时间为10 min；微孔膜的孔径为0.22μm。

7.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤(3)中进行高效液相色谱分析时采用荧光检测器检测，荧光激发波长为280 nm，荧光发射波长为315 nm。

8.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤(3)的甲酸水溶液中，甲酸的体积分数为0.1%。

9.根据权利要求1所述检测化妆品中杜鹃醇的方法，其特征在于：步骤(3)中高效液相色谱分析提取物溶液时采用梯度洗脱，梯度程序为：0 ~ 6 min，25 % 乙腈，6 ~ 7 min，90 % 乙腈，7 ~ 9 min，25 %乙腈。

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