CN102841169B

CN102841169B - 一种高效液相色谱梯度法测定左亚叶酸钙有关物质的方法

Info

Publication number: CN102841169B
Application number: CN201210294425.9A
Authority: CN
Inventors: 刘小柔; 高媛; 李勇; 严启新; 马春铭; 王丽丽; 湛常娟; 冯汉林
Original assignee: Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Neptunus Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2012-08-17
Publication date: 2014-12-03
Anticipated expiration: 2032-08-17
Also published as: CN102841169A

Abstract

本发明公开了一种左亚叶酸钙的高效液相色谱分析法，具体是以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱；取左亚叶酸钙或左亚叶酸钙制剂，加水制成含左亚叶酸钙1mg/ml的溶液，作为供试品溶液，并用水稀释制成每1ml中约含0.01mg的溶液，作为对照溶液。分别进样，供试品溶液的色谱图中各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍。本发明的方法克服了以往方法主峰理论板数低、主峰与相邻杂峰的分离度差、灵敏度低、色谱柱不耐用的缺点。可快速准确的检测出左亚叶酸钙的杂质及降解产物，操作简单，重现性好，灵敏度高，可较好地控制左亚叶酸钙产品质量。

Description

一种高效液相色谱梯度法测定左亚叶酸钙有关物质的方法

技术领域

本发明涉及左亚叶酸钙及左亚叶酸钙相关制剂的分析方法，具体涉及一种用高效液相色谱梯度法进行测定的方法，属于药物制剂分析检测领域。

背景技术

左亚叶酸钙为左亚叶酸的钙盐，其化学名称为(-)-N-[4[[[(6S)-2-氨基-5-甲酰基-1，4，5，6，7，8-六氢-4-氧代-6-蝶啶基]甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸钙盐五水合物。与5-氟尿嘧啶合用，用于治疗胃癌和结直肠癌。左亚叶酸钙的主要杂质有7种，其在左亚叶酸钙的合成过程中生成，在储藏过程中还有可能产生降解产物。左亚叶酸钙与其中一种杂质二氢叶酸结构相似，在现有的检测方法中难以完全分离；另外，左亚叶酸酸性较强，在等度分离中需加入相应的离子对试剂，存在所得主峰理论板数低，主峰与相邻杂峰分离差、灵敏度低、色谱柱使用时间短，方法耐用性差等问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明的目的在于提供一种采用高效液相色谱梯度法对左亚叶酸钙、左亚酸钙中间体及含左亚叶酸钙的相关制剂进行检查的测定方法。本发明的高效液相色谱梯度法可对上述制剂中的杂质A：(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸；C：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸；D：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸；G：2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸和其它杂质进行有效的分离和含量测定。

本发明的技术方案为：

一种高效液相谱梯度法检测左亚叶酸钙待测样品中有关物质的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

(1)制备标准品溶液，以所述标准品溶液在下述色谱条件下进行系统适用性试验，校定检测系统；

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为35～40℃，优选40℃，流速为0.9～1.1ml/min，优选1.0ml/min，检测波长为280nm；

标准品溶液制备：分别取杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙标准品，精密称定，加水制成每1ml溶液中分别含杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙各0.005～0.01mg的混合溶液；

精密量取10μl所述混合溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至左亚叶酸钙主峰与相邻杂质G的峰的分离度应大于1.5，理论板数按左亚叶酸钙计算应不低于5000；

其中，所述A是(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸，C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，D是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，G是2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸。

(2)制备供试品溶液和对照溶液

取左亚叶酸钙待测样品，加水制成浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液；

量取所述供试品溶液，加水制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液；

(3)通过高效色谱测定待测样品中的左亚叶酸钙及相关物质的含量

以对照溶液注入经上述步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，其中供试品溶液色谱中各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍；

(4)计算待测样品中各杂质的含量。

进一步地，上述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为于0～20分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为66％，流动相B的比例从10％变化为34％；于20～42分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持66％不变，流动相B的比例保持34％不变；于42～43分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从66％变化为90％，流动相B的比例从34％变化为10％；于43～50分钟，流动相A和B回到初始比例，色谱柱重新平衡。

进一步地，上述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵的一种或多种。

进一步地，上述磷酸盐缓冲液包括0.01mol/L磷酸氢二钠、0.08％四丁基氢氧化铵，pH值为7.8～8.0。

进一步地，上述左亚叶酸钙待测样品包括左亚叶酸钙原料、左亚叶酸钙中间体、注射用左亚叶酸钙和左亚叶酸钙注射液。

本发明通过使用高效液相色谱梯度法测定左亚叶酸钙及相关物质，通过对色谱条件的探索，确定了可以有效分离左亚叶酸钙及相关物质的色谱条件，克服了以往方法主峰理论板数低、主峰与相邻杂峰分离度差、灵敏度低、色谱柱不耐用的缺点。传统方法常用高效液相色谱等度法测定本品的有关物质，但由于色谱柱不耐用及灵敏度低的缺点，难以在合成左亚叶酸钙及制剂生产过程中有效控制有关物质，本发明方法有效提高了灵敏度、相邻杂峰与主峰之间的分离度，大大延长了色谱柱的使用寿命，从原来只能进样几十针提升至几千针。

本发明方法适用于左亚叶酸钙中间体、左亚叶酸钙原料及含左亚叶酸钙的相关制剂，如冻干粉针以及注射液。本发明检测方法准确，操作简单，灵敏度高，精密度好，可以充分满足有关物质检查与分解产物测定的要求，较好地控制样品中的特定杂质与非特定杂质，保证产品质量，在实际工作中实用性强。

附图说明

图1是左亚叶酸钙以及杂质A、C、D、G标准品的色谱图；

其中，1为杂质A，2为左亚叶酸钙主峰，3为杂质G，4为杂质D，5为杂质C。

图2是左亚叶酸钙原料供试品溶液的色谱图(批号：20120301)。

具体实施方式

仪器：Agilent 1100系列高效液相色谱仪，

试剂：磷酸氢二钠(分析纯)，10％四丁基氢氧化铵(分析纯)，甲醇(色谱纯，Merk公司)

色谱柱：Thermo ODS柱(250×4.0mm，5μm)

标准品的来源：

左亚叶酸钙：自制，纯度：99.6％，批号：20120101；其制备方法：取左亚叶酸钙原料经乙醇-水重结晶，干燥，即得。

杂质A：

化学名：(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸

来源：sigma，批号：BCBD6281

杂质C：

化学名：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸

来源：sigma，批号：107K0741V

杂质D：

化学名：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4-二氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸

来源：EP，批号：00AZJ3

杂质G：

化学名：(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1，4，7，8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸

来源：sigma，批号：028K5007V

左亚叶酸钙原料及中间体：参照公开号为CN 1401647A、名称为《高比旋度的左旋亚叶酸钙及拆分方法》中的方法制得。

注射用左亚叶酸钙：参照公开号为CN 1456162A、名称为《左亚叶酸钙的注射药剂及制备方法》中的方法制得。

左亚叶酸钙注射液：参照美国专利号US2006/0058312A1，名称为《Stabilizedaqueous preparation for injection》中的方法制得。

【实施例1】高效液相色谱梯度法的条件筛选

1、色谱条件与系统适用性试验

1.1流动相的选择

参照相关文献并结合试验具体情况，先后选用甲醇-水、甲醇-磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)，甲醇-水-冰醋酸，乙腈-水-冰醋酸，甲醇-水-三氟醋酸，乙腈-水-三氟醋酸等作为流动相的组成，以左亚叶酸钙主峰与最难分离杂质G的分离度与左亚叶酸钙主峰的理论板数和对称度作为评价指标，最后确定以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.0～8.0)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.0～8.0)-甲醇(40∶60)为流动相B，磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵)的最佳pH值为7.8左右，照下表1进行梯度洗脱。流动相选择结果见下表2。

表1.流动相与洗脱时间

表2.流动相选择结果

1.2色谱柱的选择

以左亚叶酸钙主峰与最难分离杂质G的分离度与左亚叶酸钙主峰的理论板数和对称度作为评价指标，曾试用不同品牌、不同型号的色谱柱，最后确定采用Thermo ODS柱(250×4.0mm，5μm)，色谱柱选择结果见表3。

表3.色谱柱选择结果

1.3柱温的选择

以左亚叶酸钙主峰与最难分离杂质G的分离度与左亚叶酸钙主峰的理论板数和对称度作为评价指标，选择柱温为30℃、35℃、40℃和45℃进行考察，最后确定柱温为40℃，柱温选择结果见表4。

表4.柱温选择结果

1.4仪器及流速

Agilent 1100系列，VWD检测器；流速为1.0ml/min。

在上述色谱条件下，左亚叶酸钙主峰保留时间适中，理论板数高，峰形对称，主峰与相邻杂峰的分离度符合要求。

1.5灵敏度的测定

取适量左亚叶酸钙待测样品，用水配制成每1ml含1mg左亚叶酸钙的溶液，作为供试品溶液。再分别用水稀释成一系列不同浓度的溶液，分别进样10μl，使之产生主峰为基线噪音三倍的信号。经试验，最小检知量为0.1ng，(S/N≥3)，若以有关物质检查时的浓度1mg/ml计算，其检出限度为百万分之十。

1.6溶液稳定性

取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8小时分别进样测定，其主峰面积及有关物质测定结果在8小时内基本稳定。

以上实验结果表明，此方法简单灵敏，重现性好，可较好地对样品中左亚叶酸钙的质量进行较好的检测。

色谱条件的确定：经上述选择试验，确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶(250×4.0mm，5μm)为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇(40∶60)为流动相B，梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm；其中所述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为于0～20分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为66％，流动相B的比例从10％变化为34％；于20～42分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持66％不变，流动相B的比例保持34％不变；于42～43分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从66％变化为90％，流动相B的比例从34％变化为10％；于43～50分钟，流动相A和B回到初始比例，色谱柱重新平衡。

1.7系统适用性试验：

分别取杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙标准品适量，精密称定，加水制成每1ml中分别含杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙各0.005～0.01mg的混合溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，左亚叶酸钙主峰与相邻杂峰(杂质G)的分离度应大于1.5，理论板数按左亚叶酸钙计算应不低于5000。如附图1所示。

2、供试品溶液和对照溶液的制备

取适量左亚叶酸钙待测样品，加水制成浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。

3、对照溶液的制备

量取上述2的供试品溶液适量，加水制成浓度为约0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液。

4、测定法

精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10～20％，再精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2％)。

【实施例2】左亚叶酸钙原料有关物质的测定

取左亚叶酸钙原料适量，精密称定，加水制成浓度1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取适量，加水稀释并制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液。在下列选定的色谱条件下：Thermo ODS柱(250×4.0mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)-甲醇(40∶60)为流动相B，照下表5进行梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10～20％，再精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2％)。分别对三个批次(20120301、20120302、20120303)的左亚叶酸钙原料进行测定，其中，左亚叶酸钙原料有关物质的测定结果如下表6所示，图谱如附图2所示。

表5.流动相与洗脱时间

表6.左亚叶酸钙原料有关物质测定结果

【实施例3】左亚叶酸钙中间体有关物质的测定

取左亚叶酸钙中间体适量，精密称定，加水制成浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取适量，加水稀释并制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液。在下列选定的色谱条件下：Thermo ODS柱(250×4.0mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)-甲醇(40∶60)为流动相B，照下表7进行梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10～20％，再精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2％)。分别对三个批次(20120201、20120202、20120203)的左亚叶酸钙中间体进行测定，其中，左亚叶酸钙中间体有关物质的测定结果如下表8所示。

表7.流动相与洗脱时间

表8.左亚叶酸钙中间体有关物质测定结果

【实施例4】注射用左亚叶酸钙有关物质的测定

取注射用左亚叶酸钙适量，混匀，精密称取适量(约相当于左亚叶酸钙25mg)，加水制成浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取适量，加水稀释并制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液。在下列选定的色谱条件下：Thermo ODS柱(250×4.0mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)-甲醇(40∶60)为流动相B，照下表9进行梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10～20％，再精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2％)。分别对三个批次(20120401、20120402、20120403)的注射用左亚叶酸钙进行测定，其中，注射用左亚叶酸钙有关物质的测定结果如下表10所示。

表9.流动相与洗脱时间

表10.注射用左亚叶酸钙有关物质测定结果

【实施例5】左亚叶酸钙注射液有关物质的测定

精密量取左亚叶酸钙注射液适量，(约相当于左亚叶酸钙25mg)，加水制成浓度为1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取适量，加水稀释并制成浓度为0.01mg/ml的溶液，作为对照溶液。在下列选定的色谱条件下：Thermo ODS柱(250×4.0mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)为流动相A，以磷酸盐缓冲液(0.01mol/L磷酸氢二钠，0.08％四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH值为7.8)-甲醇(40∶60)为流动相B，照下表11进行梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000，主峰与相邻杂质峰的分离度应大于1.5。精密量取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰高约为满量程的10～20％，再精密量取供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰面积的2倍(2％)。分别对三个批次(20120501、20120502、20120503)的注射用左亚叶酸钙注射液进行测定，其中，注射用左亚叶酸钙注射液有关物质的测定结果如下表12所示。

表11.流动相与洗脱时间

表12.左亚叶酸钙注射液有关物质测定结果

Claims

1.一种高效液相色谱梯度法检测左亚叶酸钙待测样品中有关物质的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：

色谱条件:以十八烷基硅烷键合硅胶250×4.0mm，5μm为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇40：60为流动相B，梯度洗脱，柱温为35～40℃，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为280nm；

标准品溶液制备：分别取杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙标准品，精密称定，加水制成每1ml溶液中分别含杂质A、C、D、G及左亚叶酸钙各0.005～0.01mg的混合溶液，精密量取10μl所述混合溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，校定检测系统至左亚叶酸钙主峰与相邻杂质G的峰的分离度应大于1.5，理论板数按左亚叶酸钙峰计算应不低于5000；

其中，所述杂质A是(2S)-2-[(4-氨基苯甲酰)氨基]戊二酸，杂质C是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，D是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢-6-蝶啶基)甲基]甲酰氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸，G是(2S)-2-[[4-[[(2-氨基-4-氧代-1,4,7,8-四氢-6-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]氨基]戊二酸；

(2)制备供试品溶液和对照溶液

(3)通过高效液相色谱测定待测样品中的相关物质的含量

以对照溶液注入经步骤(1)校定后的液相色谱仪，调节检测灵敏度，再将供试品溶液注入液相色谱仪，在步骤(1)所述的色谱条件下进行高效液相色谱测定，记录色谱图至左亚叶酸钙主峰保留时间的2.5倍，其中供试品溶液色谱中各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2倍；

(4)计算待测样品中各杂质的含量；

其中，步骤1中所述的梯度洗脱中，流动相A比例的变化范围为于0～20分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从90％变化为66％，流动相B的比例从10％变化为34％；于20～42分钟，等度洗脱，流动相A的比例保持66％不变，流动相B的比例保持34％不变；于42～43分钟，线性梯度洗脱，流动相A的比例从66％变化为90％，流动相B的比例从34％变化为10％；于43～50分钟，流动相A和B回到初始比例，色谱柱重新平衡。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐选自磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二铵的一种或多种。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述磷酸盐缓冲液包括0.01mol/L磷酸氢二钠、0.08％四丁基氢氧化铵，pH值为7.8～8.0。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶250×4.0mm，5μm为填充剂，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以磷酸盐缓冲液-甲醇40：60为流动相B，梯度洗脱，柱温为40℃，流速为1.0ml/min，检测波长为280nm。

5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述左亚叶酸钙待测样品包括左亚叶酸钙原料、左亚叶酸钙中间体、注射用左亚叶酸钙和左亚叶酸钙注射液。