CN104251891A - 替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能测定替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质含量的高效液相色谱方法，该方法能同时测定替米考星、磺胺二甲嘧啶及其钠盐的有关物质；本发明在测定有关物质含量方面结果准确、可靠，具有很强的实用性与推广价值。

Description

替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质检测方法，属方法学领域。 

背景技术

兽医临床实际中往往通过联合用药使不同药物获得协同或相加作用，从而提高疗效，减少用量，降低或避免毒性反应，减少细菌耐药性的产生。这使得复方药物的研究应用在兽药领域越来越受到关注。替米考星是大环内酯类药物，是繁殖期抑菌剂，属于快速抑菌剂，磺胺类药物是静止期抑菌剂，是一种慢效抑菌剂，二者合用能够扩大抗菌谱，并有相加的作用，在临床中有很大的运用基础。按照国家有关规定，对于复方制剂必须按照新兽药申报，所以，需要进行该复方制剂的有关物质研究。在中国兽药典（2010年版）中，替米考星的有关物质用高效液相色谱法进行检测，磺胺二甲嘧啶的有关物质用薄层色谱法检测。基于薄层色谱法不适于杂质的定量研究，所以采用高效液相色谱法进行杂质的检测。但是如果完全参照药典中关于替米考星有关物质的方法进行检测，发现顺反式替米考星杂质峰未能达到基线分离，且拖尾严重，图谱见说明书附图1，而同时检测替米考星、磺胺二甲嘧啶钠的方法尚无研究，因此开发新的检测替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂中有关物质的检测方法，已达到能将制剂中的杂质完全、准确的检出的目的。 

《中华人民共和国兽药典》（2010年版一部）替米考星项下的有关物质检测方法如下：取替米考星约0.2g，精密称定，置50ml量瓶内，加乙腈10ml超声处理使溶解，用磷酸溶液（取水900ml，加磷酸5.71g，用12.5mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至2.5±0.1，加水至1000ml）稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；取替米考星对照品适量，精密称定，加乙腈制成每1ml中含0.25mg的溶液，精密量取5ml，置25ml量瓶中，用上述磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱法（附录36页）试验，用十八烷基键合硅胶为填充剂；以水-磷酸二丁胺溶液[取二丁胺16.8ml，加磷酸溶液（1→10）70ml，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节pH值至2.5±0.1，加水至100ml]（975:25）为流动相A，以乙腈为流动相B；按下表1进行梯度洗脱；检测波长为280nm；流速为每分钟1.1ml。替米考星反式异构体（两个不完全分开的峰）的相对保留时间为0.8，替米考星顺式异构体的相对保留时间为1.0，替米考星顺式-8-差向异构体的相对保留时间为1.2。精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中（除顺式、反式和顺-8-差向异构体外）如有杂质峰，以无水物计算，单个杂质不得过3.0％，各杂质的和不得过10.0％。供试品溶液色谱图中任何小于对照品溶液顺式异构体峰面积0.01倍的峰可忽略不计。 

表1 梯度洗脱程序 

本发明参照上述方法，但又在上述方法上有所提升。 

本发明在确定之前，详细分析了替米考星、磺胺二甲嘧啶及其钠盐的杂质。磺胺二甲嘧啶及其钠盐的主要杂质为氨苯磺胺，氨苯磺胺用本发明测定时得到的色谱图见附图2，图3为加入了1%氨苯磺胺的替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂样品，图4为替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂样品。通过比较我们可以判断复方制剂中保留时间为4.9min左右的物质中为氨苯磺胺，即氨苯磺胺可以成功分离出来。 

参考《兽药杂质分析指导原则》，替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂采取主成分自身对照法，对有关物质进行限定，将供试品溶液稀释为2.5mg/mL，将供试品溶液稀释100倍作为对照品溶液，将供试品溶液的色谱图去除磺胺二甲嘧啶钠、替米考星反式异构体、替米考星顺式异构体、替米考星顺-8差向异构体后，将剩下的杂质峰进行峰回归（表2所示），分别计算氨苯磺胺、最大单一杂质和总杂质含量。 

表2 供试品中各杂峰归属分析 

通过附图5、6、7分析得出，替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂中所有含量大于顺式替米考星峰面积0.1%杂峰都可以判断其来源，其中的最大单一杂峰是由替米考星引入的，因此定义最大单一杂质限量时以替米考星主峰面积作为对照，按照兽药药典关于替米考星有关物质的控制方法和实际测定结果，确定替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂中单一最大杂质不得过替米考星主成分的3%。对于磺胺二甲嘧啶钠，兽药典利用薄层色谱法控制有关物质氨苯磺胺，而通过考察氨苯磺胺与磺胺二甲嘧啶钠在本液相条件下的响应因子发现，两种物质响应因子接近，因此本方法同样可以有效控制氨苯磺胺，具体方法为通过氨苯磺胺对照品，定位制剂中氨苯磺胺的出峰位置，用氨苯磺胺的峰面积与对照溶液的磺胺二甲嘧啶钠主峰对照计算，同样参考兽药典的杂质限度，定为不得过0.5%。参考兽药典对替米考星的总杂质限度和制剂实际测定结果，确定总杂质不得过10%。具体的图谱见说明书附图8。 

发明内容

本发明的目的是提供替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，通过研究梯度洗脱的梯度曲线，达到将杂质逐一分离并且能够定量检测，进而制定单一杂质和总杂质限度的目的。 

本发明所述替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂所用原料为：替米考星、磺胺二甲嘧啶或磺胺二甲嘧啶钠，所用辅料包括但不限于磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、DL-酒石酸、柠檬酸、DL-苹果酸、聚乙二醇6000、无水葡萄糖、环糊精中的一种或多种。 

本发明所述的方法，是采用高效液相色谱法测定，采用的流动相为：乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液为流动相B； 10%甲醇溶液为流动相C。 

流动相的梯度洗脱程序为： 

具体实施步骤如下： 

（1）取替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂适量，加提取液制成每1mL含替米考星4mg的溶液，作为供试品溶液；取替米考星对照品适量，精密称定，加提取液制成每1mL中含0.25mg的溶液，精密量取5mL，置25mL量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；     

（2）用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择250mm×4.6mm分析柱；以乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8mL，加磷酸溶液（1→10）70mL，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节pH值至2.5±0.1，加水至100mL，即得〕（975：25）为流动相B，10%甲醇溶液为流动相C，流速为1.1mL/min，检测波长为280nm，替米考星反式异构体（两个不完全分开的峰）的相对保留时间为0.9，替米考星顺式异构体的相对保留时间为1.0，替米考星顺式-8-差向异构体的相对保留时间为1.1，理论板数按替米考星顺式峰计算应不低于3000，替米考星的顺式和反式异构体峰之间的分离度应符合要求； 

（3）精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中（除顺式、反式和顺-8-差向异构体外）如有杂质峰，按下式以无水物计算，单个杂质不得过3.0％，各杂质的和不得过10.0％，供试品溶液色谱图中任何小于对照品溶液顺式异构体峰面积0.01倍的峰可忽略不计： 

$\frac{A\×\mathrm{Ws}\×P}{\mathrm{As}\×W\×n}$

式中  A：供试品溶液色谱图中除了顺式替米考星、反式替米考星、顺-8-差向异构体替米考星和磺胺二甲嘧啶钠外，有关物质峰面积的和或单个有关物质峰面积； 

As：对照品溶液色谱图中顺式、反式、顺-8-差向异构体、磺胺二甲嘧啶钠峰面积 

的和； 

Ws：对照品的重量； 

W：供试品的重量； 

P：对照品的顺式和反式异构体的含量； 

N：对照品与供试品的稀释倍数比。 

所述提取液的配制方法为：取乙腈400-600ml和pH5.0-8.0的磷酸盐缓冲液25mL加入适 量水中，用水稀释至1000 mL。 

本发明方法参照中国兽药典（2010年版）制定有关物质的检测标准为：供试品溶液的色谱图中（除顺式、反式和顺-8-差向异构体外）如有杂质峰，以无水物计算，单个杂质不得过3.0％，各杂质的和不得过10.0％。供试品溶液色谱图中任何小于对照品溶液顺式异构体峰面积0.01倍的峰可忽略不计。 

本发明的有益效果是： 

相对于中国兽药典（2010年版）中关于替米考星有关物质的检测方法，本发明最大的优势是色谱条件中缩短了梯度洗脱时间，通过在同一分析周期内按照比例调整流动相的浓度配比，同时达到了缩短检测周期、提高分析灵敏度、峰形得到改善、提高分离度的效果。     

由于替米考星、磺胺二甲嘧啶为复方制剂，在考察有关物质项时，不仅对原料药可能的杂质进行分析，重要的是要考虑各种原料药以及辅料是否会相互作用，产生新的杂质。因此参照中国兽药典（2010年版）替米考星的含量检测方法，配制了替米考星原料药溶液、磺胺二甲嘧啶钠原料药溶液、替米考星与磺胺二甲嘧啶钠按照1:1比例配制的混合物溶液，上述辅料等比例配制的溶液。为了能够使各种杂质能在本发明所述检测条件中体现出来、分离度较好，以上各种溶液浓度均为2.5mg/mL，相当于含量测定时浓度的5倍。以2.5mg/mL浓度进样，得到的替米考星单品、磺胺二甲嘧啶钠单品、替米考星与磺胺二甲嘧啶钠1:1混合样品的色谱图如说明书附图5、6、7所示。可以看出两种原料并没有相互作用产生新的杂质。再次进了所有辅料的样品，得到的色谱图如说明书附图9-14所示。可以得出所有辅料在主峰位置均没有吸收峰出现，仅在3.8-3.9分钟左右有溶剂峰，这对杂质含量测定不会有影响。 

以2.5mg/mL浓度进样，得到的替米考星与磺胺二甲嘧啶钠二甲嘧啶钠1:1的混合物、替米考星磺胺二甲嘧啶钠二甲嘧啶钠可溶性粉样品溶液的色谱图如说明书附图15、16所示，通过对比可以看出各种辅料与主药之间没有相互作用产生新的杂质。 

原料药磺胺二甲嘧啶钠的有关物质主要为氨苯磺胺。单独的氨苯磺胺对照和磺胺二甲嘧啶钠原料的对比色谱图如说明书附图17所示。氨苯磺胺在4.7min左右出峰，在替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂中加入此杂质，进行了相互影响的考察，结果见说明书附图18所示。 

具体实施方式

以下实施例是用以说明本发明的优选的实施方案，本领域技术人员应当理解，以下描述不应用于限制本发明的保护范围。 

实施例一： 

待检样品按以下组方配制： 

色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8ml，加磷酸溶液（1→10）70ml，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节pH值至2.5±0.1，加水至100ml〕（975：25）为流动相B； 10%甲醇溶液为流动相C；流速为1.1mL/min；检测波长为280nm，按以下程序进行梯度洗脱： 

测定法  取替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂适量，加提取液制成每mL含替米考星4mg的溶液，作为供试品溶液；取替米考星对照品适量，精密称定，加提取液制成每1mL中含0.25mg的溶液，精密量取5mL，置25mL量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。 

测得样品色谱图见说明书附图19。 

实施例二： 

梯度洗脱的流动相配比如下表所示： 

测得实施例一中样品色谱图见说明书附图20。 

实施例三： 

梯度洗脱的流动相配比如下表所示： 

测得实施例一中样品色谱图见说明书附图21。 

从三个实施例所测得的有关物质HPLC图谱可以看出，本发明可以很好的把主成分和杂质进行分离，能够有效的测定有关物质的含量，可用于含有替米考星、磺胺二甲嘧啶成分的复方制剂的质量标准中。 

附图说明

图1《中国兽药典》2010年版一部方法检测替米考星有关物质图谱 

图2氨苯磺胺对照品色谱图 

图3加入氨苯磺胺的供试品色谱图 

图4供试品色谱图 

图5本发明方法中替米考星原料药色谱图 

图6磺胺二甲嘧啶钠原料药色谱图 

图7替米考星与磺胺二甲嘧啶钠1:1混合物色谱图 

图8条件优化后有关物质检测图谱 

图9辅料混合物色谱图1 

图10辅料混合物色谱图2 

图11辅料混合物色谱图3 

图12辅料混合物色谱图4 

图13辅料混合物色谱图5 

图14辅料混合物色谱图6 

图15替米考星与磺胺二甲嘧啶钠二甲嘧啶钠1:1混合物的色谱图 

图16替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂样品色谱图 

图17氨苯磺胺对照品色谱图 

图18氨苯磺胺对照品与磺胺二甲嘧啶钠原料色谱图 

图19实施例1测得有关物质色谱图 

图20实施例2测得有关物质色谱图 

图21实施例3测得有关物质色谱图。 

Claims (6)

1.一种替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法测定，其特征在于采用的流动相为：乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液为流动相B； 10%甲醇溶液为流动相C。

2.根据权利要求1 所述的一种替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，其特征在于流动相的梯度洗脱程序。

3.根据权利要求1、2任一所述的一种替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，其特征在于流动相梯度洗脱程序为：

4.根据权利要求1至3任一所述的一种替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，其特征在于具体实施步骤如下：

（1）取替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂适量，加提取液制成每1mL含替米考星4mg的溶液，作为供试品溶液；取替米考星对照品适量，精密称定，加提取液制成每1mL中含0.25mg的溶液，精密量取5mL，置25mL量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；

（2）用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择250mm×4.6mm分析柱；以乙腈为流动相A；水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8mL，加磷酸溶液（1→10）70mL，边加边搅拌，放冷后，用磷酸调节pH值至2.5±0.1，加水至100mL，即得〕（975：25）为流动相B，10%甲醇溶液为流动相C，流速为1.1mL/min，检测波长为280nm，替米考星反式异构体（两个不完全分开的峰）的相对保留时间为0.9，替米考星顺式异构体的相对保留时间为1.0，替米考星顺式-8-差向异构体的相对保留时间为1.1，理论板数按替米考星顺式峰计算应不低于3000，替米考星的顺式和反式异构体峰之间的分离度应符合要求；

（3）精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中（除顺式、反式和顺-8-差向异构体外）如有杂质峰，按下式以无水物计算，单个杂质不得过3.0％，各杂质的和不得过10.0％，供试品溶液色谱图中任何小于对照品溶液顺式异构体峰面积0.01倍的峰可忽略不计：

$\frac{A\×\mathrm{Ws}\×P}{\mathrm{As}\×W\×n}$

式中 A：供试品溶液色谱图中除了顺式替米考星、反式替米考星、顺-8-差向异构体替米考星和磺胺二甲嘧啶钠外，有关物质峰面积的和或单个有关物质峰面积；

As：对照品溶液色谱图中顺式、反式、顺-8-差向异构体、磺胺二甲嘧啶钠峰面积

的和；

Ws：对照品的重量；

W：供试品的重量；

P：对照品的顺式和反式异构体的含量；

N：对照品与供试品的稀释倍数比。

5.根据权利要求4所述的一种替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，其特征是，提取液的配制方法为：取乙腈400-600ml和pH5.0-8.0的磷酸盐缓冲液25mL加入适量水中，用水稀释至1000 mL。

6.根据权利要求1至5任一所述的一种替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂有关物质的检测方法，其特征是替米考星、磺胺二甲嘧啶复方制剂所用原料为：替米考星、磺胺二甲嘧啶或磺胺二甲嘧啶钠，所用辅料包括但不限于磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、DL-酒石酸、柠檬酸、DL-苹果酸、聚乙二醇6000、无水葡萄糖、环糊精中的一种或多种。