CN106383186B - 同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1M醋酸钠溶液‑甲醇为流动相进行梯度洗脱，联合流动相的梯度流速和紫外检测器的程序变化波长，在60分钟内可实现14种维生素（包括4种脂溶性维生素和10种水溶性维生素）的完好分离与定量分析，方法专属性强、精密度高、稳定性好、准确度高，操作简便，试剂与耗材价廉易得，适用于医药与食品行业中复合维生素产品的质量控制，可有效地节约检测成本与时间。

Description

同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法
技术领域
本发明属于分析技术领域，涉及一种利用高效液相色谱（HPLC）法同时测定14种维生素含量的方法。
背景技术
维生素可维持生命体的正常生理机能和物质能量代谢，是人与动物重要的营养素之一。其按照溶解性可分为水溶性维生素（B族维生素和维生素C）与脂溶性维生素（维生素A、维生素D、维生素E、维生素K）两类。随着经济的快速发展，人们生活水平的不断提高、健康意识的逐步加强，复合维生素产品在市场中愈来愈受到青睐，种类纷繁的复合维生素食品、保健品、药品等层出不穷，所含维生素的种类也日益增多。但由于维生素种类繁多，对温度、湿度、光照等条件敏感，最为重要的是各维生素的溶解度不尽相同，现有的含量测定方法多以单一维生素测定为主，存在多种维生素含量测定需分别进行、操作繁琐耗时等缺点。也有文献报道同时测定几种脂溶性维生素或水溶性维生素含量的方法，其仍然存在维生素种类检测不全等缺点，而迄今为止尚未见同时检测14种维生素（包括4种脂溶性维生素和10种水溶性维生素）含量的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测14种维生素（包括4种脂溶性维生素和10种水溶性维生素）含量的方法，可广泛应用于医药与食品行业中复合维生素产品的质量控制，有效地节约检测成本与时间。
经研究，本发明提供如下技术方案：
同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法，包括以下步骤：
1）色谱条件
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相及洗脱方式：以0.1M醋酸钠溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按以下程序进行梯度洗脱：
0-4min：流动相为体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液；
4-10min：流动相由体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液线性变化为体积比55:45的流动相A-流动相B混合液；
10-18min：流动相由体积比55: 45的流动相A-流动相B混合液线性变化为体积比0: 100的流动相A-流动相B混合液；
18-50min：流动相为体积比0: 100的流动相A-流动相B混合液；
50-55min：流动相由体积比0: 100的流动相A-流动相B混合液线性变化为体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液；
55-60min：流动相为体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液；
流速：按以下程序采用梯度流速：
0-10min：流速为1.0ml/min；
10-18min：流速由1.0ml/min线性变化为1.5ml/min；
18-50min：流速为1.5ml/min；
50-55min：流速由1.5ml/min线性变化为1.0ml/min；
55-60min: 流速为1.0ml/min；
检测波长：按以下程序采用变化波长：
0-10min：检测波长为266nm；
10-12min：检测波长为280nm；
12-24min：检测波长为325nm；
24-32min：检测波长为266nm；
32-60min：检测波长为325nm；
2）供试品溶液的制备
取供试品，制成供试品溶液；
3）对照品溶液的制备
取维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K3，精密称定，加入乙酸乙酯使溶解，加入吐温-80混匀，用0.1M醋酸钠溶液稀释并定容，作为脂溶性维生素对照品贮备液；取维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酰胺、烟酸、叶酸、右泛醇、生物素和维生素C，精密称定，加水使溶解，精密加入脂溶性维生素对照品贮备液，用水稀释并定容，作为对照品溶液；
4）测定
精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取对照品溶液注入液相色谱仪，同法测定；按外标法以峰面积计算供试品中各维生素的含量。
优选的，所述供试品溶液的制备采用以下方法：
a. 供试品为固体样品：取供试品，研细，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml，超声5min，加入吐温-80 5ml，混匀，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液；
b. 供试品为含水注射液：精密量取供试品，置100ml棕色量瓶中，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
c. 供试品为除含水注射液外的其它液体样品：精密量取供试品，置100ml棕色量瓶中，加入体积比2:1的乙酸乙酯-吐温混合液15ml，超声5min，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液。
优选的，所述对照品溶液的制备采用以下方法：取维生素 A 100,000i.u.、维生素D3 100,000i.u、维生素 E 200mg和维生素 K3 100mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml使溶解，加入吐温-80 5ml，混匀，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为脂溶性维生素对照品贮备液；取维生素B1 50mg、维生素B2 5mg、维生素B6 25mg、维生素B12 5mg、烟酰胺 50mg、烟酸25mg、叶酸7.5mg、右泛醇5mg、生物素6mg和维生素C 25mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水50ml使溶解，精密加入脂溶性维生素对照品贮备液10ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
本发明的有益效果在于：本发明是反相高效液相色谱法同时测定14种维生素（包括4种脂溶性维生素和10种水溶性维生素）的含量，采用价廉易得的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1M醋酸钠溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱（0.1M醋酸钠溶液可有效洗脱水溶性维生素，甲醇可有效洗脱脂溶性维生素；醋酸钠为有机盐，可溶于甲醇中，无需考虑在梯度转至100%甲醇时醋酸钠析出的问题），联合流动相的梯度流速和紫外检测器的程序变化波长，在60分钟内可实现14种维生素的完好分离与定量分析。方法专属性强、精密度高、稳定性好、准确度高，操作简便，试剂与耗材价廉易得，适用于医药与食品行业中复合维生素产品的质量控制，可有效地节约检测成本与时间。
附图说明
图1为14种维生素混合对照品溶液的高效液相色谱图。
图2为市售复合维生素片的高效液相色谱图。
图3为市售复合维生素注射液的高效液相色谱图。
图1~3中，vit表示维生素。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
一、含量测定方法
1. 色谱条件
色谱柱：C18色谱柱（250mm×4.6mm，5µm）；
流动相及洗脱方式：以0.1M醋酸钠溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按以下程序进行梯度洗脱：
0-4min：流动相为流动相A-流动相B（体积比95: 5）；
4-10min：流动相由流动相A-流动相B（体积比95: 5）线性变化为流动相A-流动相B（体积比55: 45）；
10-18min：流动相由流动相A-流动相B（体积比55: 45）线性变化为流动相A-流动相B（体积比0: 100）；
18-50min：流动相为流动相A-流动相B（0: 100）；
50-55min：流动相由流动相A-流动相B（0: 100）线性变化为流动相A-流动相B（体积比95: 5）；
55-60min：流动相为流动相A-流动相B（体积比95: 5）。
流速：按以下程序采用梯度流速：
0-10min：流速为1.0ml/min；
10-18min：流速由1.0ml/min线性变化为1.5ml/min；
18-50min：流速为1.5ml/min；
50-55min：流速由1.5ml/min线性变化为1.0ml/min；
55-60min: 流速为1.0ml/min。
检测波长：按以下程序采用变化波长：
0-10min：检测波长为266nm；
10-12min：检测波长为280nm；
12-24min：检测波长为325nm；
24-32min：检测波长为266nm；
32-60min：检测波长为325nm。
柱温：室温。
2. 供试品溶液的制备
a. 供试品为固体样品：取供试品适量，研细，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml，超声5min，加入吐温-80 5ml，混匀，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液。
b. 供试品为含水注射液：精密量取供试品适量，置100ml棕色量瓶中，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
c. 供试品为除含水注射液外的其它液体样品：精密量取供试品适量，置100ml棕色量瓶中，加入体积比2:1的乙酸乙酯-吐温混合液15ml，超声5min，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液。
3. 对照品溶液的制备
取脂溶性维生素对照品适量（维生素 A 100,000i.u.、维生素 D3 100,000i.u、维生素 E 200mg、维生素 K3 100mg），精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml使溶解，加入吐温-80 5ml，混匀，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为脂溶性维生素对照品贮备液；取水溶性维生素对照品适量（维生素 B1 50mg、维生素 B2 5mg、维生素 B6 25mg、维生素 B12 5mg、烟酰胺 50mg、烟酸 25mg、叶酸7.5mg、右泛醇5mg、生物素6mg、维生素 C25mg），精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水50ml使溶解，精密加入脂溶性维生素对照品贮备液10ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
4. 测定
精密量取供试品溶液20µl注入液相色谱仪，按前述色谱条件进行测定，记录色谱图。另精密量取对照品溶液20µl注入液相色谱仪，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中各维生素的含量。
二、含量测定方法的验证
1. 专属性考察
分别精密量取对照品溶液与14种维生素的各阴性供试液各20µl，注入液相色谱仪，记录色谱图。对照品溶液的色谱图见图1。通过比较对照品溶液和14种维生素的各阴性供试液的色谱图，确认14种维生素各自的色谱峰平均保留时间见表1。比较对照品溶液和14种维生素的各阴性供试液的色谱图还可以看出，各维生素色谱峰的保留时间一致，说明各维生素色谱峰在保留时间位置上阴性供试液没有明显干扰，进一步说明在本发明所述色谱条件下，14种维生素之间可以实现完好分离。
表1 14种维生素的色谱峰平均保留时间
2. 线性关系考察
精密量取对照品溶液5µl、10µl、20µl、30µl、40µl分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以进样量x（mg）为横坐标，峰面积Y为纵坐标作图绘制标准曲线，计算14种维生素的线性回归方程与相关系数（r）。结果见表2。由表2可知，14种维生素在线性范围内，峰面积与浓度均呈现良好的线性关系。
表2 线性关系考察结果
3. 精密度考察
精密量取对照品溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图，重复6次。以各维生素色谱峰的6次测得峰面积计算相对标准偏差（RSD）。结果见表3。由表3可知，14种维生素色谱峰的峰面积RSD均符合精密度要求，说明本发明方法精密度良好。
表3 精密度考察结果
4. 稳定性考察
制备对照品溶液，分别于0、1、2、4、6、8、12小时精密量取对照品溶液20µl注入液相色谱仪，记录色谱图。以各维生素色谱峰的7次测得峰面积计算RSD。结果见表4。由表4可知，14种维生素色谱峰的峰面积RSD均符合精密度要求，说明本发明方法稳定性良好。
表4 稳定性考察结果
5. 准确度考察
加样回收率试验：精密量取已知各维生素含量的供试品溶液9份，每3份为1组，每组均按照低、中、高三个浓度分别精密加入对照品溶液4ml、5ml、6ml，摇匀，精密量取20µl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算14种维生素的平均加样回收率和RSD。结果见表5。由表5可知，14种维生素的平均加样回收率均大于97.5%，RSD不大于2.2%，说明本发明方法准确度高。
表5 准确度考察结果
三、样品测定
1. 市售复合维生素片
以市售复合维生素片作为供试品，其标示每片含有维生素C 60mg、烟酸8mg、维生素B1 2mg、维生素B6 2mg、烟酰胺 25mg、维生素B2 1.5mg、叶酸400µg、维生素D3 4000i.u、维生素E 8mg和维生素A 4000i.u。
供试品溶液的制备：取供试品适量，研细，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml，超声5min，加入吐温-80 5ml，混匀，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液。
按前述含量测定方法测定该复合维生素片所含各维生素的含量，结果见图2。由图2可知，该复合维生素片含有维生素C、烟酸、维生素B1、维生素B6、烟酰胺、维生素B2、叶酸、维生素D3、维生素E和维生素A共10种维生素，其标示百分含量分别为：维生素C 97.41%、烟酸96.47%、维生素B1 99.54%、维生素B6 95.24%、烟酰胺99.78%、维生素B2 93.26%、叶酸90.78%、维生素D3 98.13%、维生素E 94.01%和维生素A 96.87%。
2. 市售复合维生素注射液
以市售复合维生素注射液作为供试品，其标示每ml含有维生素C 5mg、烟酸5mg、维生素B1 10mg、维生素B6 5mg、烟酰胺10mg、维生素B12 1mg、维生素B2 1mg、生物素2mg、叶酸2mg、维生素D3 2000i.u、维生素E 4mg、维生素A 2000i.u。
供试品溶液的制备：精密量取供试品5ml，置100ml量瓶中，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
按前述含量测定方法测定该复合维生素注射液所含各维生素的含量，结果见图3。由图3可知，该复合维生素注射液含有维生素C、烟酸、维生素B1、维生素B6、烟酰胺、维生素B12、维生素B2、生物素、叶酸、维生素D3、维生素E和维生素A共12种维生素，其标示百分含量分别为：维生素C 91.07%、烟酸 93.78%、维生素B1 97.21%、维生素B6 96.46%、烟酰胺97.14%、维生素B12 90.74%、维生素B2 93.47%、生物素94.02%、叶酸 91.87%、维生素D390.14%、维生素E 98.74%、维生素A 99.45%。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）色谱条件
色谱柱填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相及洗脱方式：以0.1M醋酸钠溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，按以下程序进行梯度洗脱：
0-4min：流动相为体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液；
4-10min：流动相由体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液线性变化为体积比55: 45的流动相A-流动相B混合液；
10-18min：流动相由体积比55: 45的流动相A-流动相B混合液线性变化为体积比0:100的流动相A-流动相B混合液；
18-50min：流动相为体积比0: 100的流动相A-流动相B混合液；
50-55min：流动相由体积比0: 100的流动相A-流动相B混合液线性变化为体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液；
55-60min：流动相为体积比95: 5的流动相A-流动相B混合液；
流速：按以下程序采用梯度流速：
0-10min：流速为1.0ml/min；
10-18min：流速由1.0ml/min线性变化为1.5ml/min；
18-50min：流速为1.5ml/min；
50-55min：流速由1.5ml/min线性变化为1.0ml/min；
55-60min: 流速为1.0ml/min；
检测波长：按以下程序采用变化波长：
0-10min：检测波长为266nm；
10-12min：检测波长为280nm；
12-24min：检测波长为325nm；
24-32min：检测波长为266nm；
32-60min：检测波长为325nm；
2）供试品溶液的制备
取供试品，制成供试品溶液；
3）对照品溶液的制备
取维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K3，精密称定，加入乙酸乙酯使溶解，加入吐温-80混匀，用0.1M醋酸钠溶液稀释并定容，作为脂溶性维生素对照品贮备液；取维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酰胺、烟酸、叶酸、右泛醇、生物素和维生素C，精密称定，加水使溶解，精密加入脂溶性维生素对照品贮备液，用水稀释并定容，作为对照品溶液；
4）测定
精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密量取对照品溶液注入液相色谱仪，同法测定；按外标法以峰面积计算供试品中各维生素的含量。
2.如权利要求1所述的同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备采用以下方法：
a. 供试品为固体样品：取供试品，研细，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml，超声5min，加入吐温-80 5ml，混匀，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液；
b. 供试品为含水注射液：精密量取供试品，置100ml棕色量瓶中，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
c. 供试品为除含水注射液外的其它液体样品：精密量取供试品，置100ml棕色量瓶中，加入体积比2:1的乙酸乙酯-吐温混合液15ml，超声5min，加入0.1M醋酸钠溶液25ml，超声5min，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，所得滤液作为供试品溶液。
3.如权利要求1所述的同时测定14种维生素含量的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备采用以下方法：取维生素 A 100,000i.u.、维生素 D3 100,000i.u、维生素 E 200mg和维生素 K3 100mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加入乙酸乙酯10ml使溶解，加入吐温-80 5ml，混匀，用0.1M醋酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为脂溶性维生素对照品贮备液；取维生素B1 50mg、维生素B2 5mg、维生素B6 25mg、维生素B12 5mg、烟酰胺50mg、烟酸25mg、叶酸7.5mg、右泛醇5mg、生物素6mg和维生素C 25mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加水50ml使溶解，精密加入脂溶性维生素对照品贮备液10ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
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