CN109187828A - 一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法 - Google Patents

一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，本发明属于动物营养与饲料技术检测领域，本发明是通过在配置待检测溶液时添加一定量的亚硫酸氢钠溶液，提高亚硫酸氢钠甲萘醌在水中的稳定性，避免因亚硫酸氢钠甲萘醌的分解降低溶液中亚硫酸氢钠甲萘醌的含量，而且可以使其得出的标准曲线的线性更接近于一，从而使检测结果更接近亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌的真实含量，本发明的检测方法比现有技术得出的结果可以更加准确检测出出硫酸氢烟酰胺甲萘醌的真实含量。

Description

一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法
技术领域
本发明属于动物营养与饲料技术检测领域，一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，本发明还涉及该用该生物发酵饲料配方的制备方法。
背景技术
亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌(Menadione nicotinamide bisulfite, MNB)是维生素K3(亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB))的稳定型盐，其结构式如下，通过将2-甲基-1，4-萘醌与亚硫酸氢钠反应生成亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)，并与烟酰胺形成稳定型盐(MNB)后，可以改进其水溶性，而且对光、热、水分等稳定，不易分解。亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌(MNB)因具有止血、促进生长、解痉等作用，被广泛地用作饲料添加剂。
目前检测亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌(MNB)含量的检测是参照GB/T26442-2010 饲料添加剂 亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌》，其原理是利用硫酸氢烟酰胺甲萘醌(MNB)在水中分解为亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺，通过检测亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺的含量，进而用外标法计算亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌的含量。然而，由于亚硫酸氢钠甲萘醌的不稳定性，在水中，亚硫酸氢钠甲萘醌与甲萘醌和亚硫酸氢钠存在着以下动态平衡，当亚硫酸氢钠甲萘醌与空气或溶液中的氧气、酸或者碱作用时，亚硫酸氢钠甲萘醌会发生分解，平衡向右移动，从而减少亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌在溶液中的浓度，一般这种饲料添加剂在饲料中的添加比例很低，所以对亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌里面各组分的含量检测必须要十分精确，因此，在亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌（MNB）的检测过程中，亚硫酸氢钠甲萘醌（MSB）的不稳定性会对亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌（MNB）的定量的准确性和稳定性造成影响。
发明内容
为了克服上述现有检测方法的不足，本发明提供了一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法。本发明所采用的技术方案是在水溶液中加入亚硫酸氢钠，促进亚硫酸氢钠甲萘醌，甲萘醌和亚硫酸氢钠的动态平衡向左移动，提高亚硫酸氢钠甲萘醌在水溶液中的稳定性，进而准确定量。与现有技术相比，本发明能更加稳定和准确的对饲料添加剂亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌的含量进行检测和定量。
为实现上述目的，本发明提供了一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法其步骤如下：
步骤一：配置标准溶液
（1）亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液的配置，准确称取100.00mg亚硫酸氢钠甲萘醌标准品于100.0mL棕色容量瓶中，用水溶解，加1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容，可得浓度为1000μg/mL的储备液，在检测前分别取储备液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL于100.0mL棕色容量瓶中，加1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容可得浓度分别为2μg/mL、 5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的标准溶液；
（2）烟酰胺标准工作液：准确称取烟酰胺标准品50mg，置于100.0mL容量瓶中，加水稀释定容，此储备液浓度为500ug/mL，分别取储备液0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL于100.0mL棕色容量瓶中，用水稀释成浓度分别为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的标准工作液，有效期一个月；
步骤二：样品溶液的制备
取试样0.1000g，置于100.0mL容量瓶中， 加入1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液和70.0mL水，超声波水浴中超声5min使之溶解，然后用水定容至刻度，摇匀。精确移取1.0mL溶液，置于50.0mL容量瓶中，加入0.5mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容，摇匀。取上清液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱的测定；
步骤三：测定，取标准溶液和样品溶液，分别连续进入液相色谱仪测定，待测样液中亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺的响应值应在工作曲线范围中。
色谱条件
色谱柱：C18，粒度5μm，250mm×4.6mm(内径)或性能类似的分析柱；
流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（2.5）：甲醇=65:35；
流速：1.0mL/min；
温度：30℃；
进样量：10μL；
检测器：紫外检测器(或二极管矩阵检测器PDA)，波长265nm。
步骤四：计算，按峰面积计算校正因子，并计算样品中的亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺含量计算方法如下；
试样中烟酰胺含量X1，甲萘醌含量X2、MNB含量X3以质量分数表示，分别按式（1）式（2）式（3）计算：
式（1）
式中：As1—烟酰胺标准溶液的色谱峰面积；
A1—烟酰胺样品溶液的色谱峰面积；
Cs1—通过标准工作液曲线测得的试液浓度，单位为μg/mL；
m —试样质量，单位为g ；
n—样品的稀释倍数。
式（2）
式中：As2—亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液中色谱峰面积；
A2—亚硫酸氢钠甲萘醌样品溶液中色谱峰面积；
CS2—通过标准工作液曲线测得的试液浓度，单位为μg/mL；
m —试样质量，单位为g；
n—样品的稀释倍数；
0.623—甲萘醌与亚硫酸氢钠甲萘醌（未含结晶水）的换算系数。
式（3）
式中：X2—甲萘醌含量，单位为%
A—样品的稀释倍数；
2.186—亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌于甲萘醌的换算系数。
计算结果保留至小数点后两位。
下表为亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌各组分含量标准
进一步地，配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时添加的亚硫酸氢钠溶液中为亚硫酸氢钠的纯度为分析纯，溶液浓度为5-20%。
进一步地，配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时添加的亚硫酸氢钠溶液中亚硫酸氢钠的纯度为分析纯，溶液浓度为10%。
进一步地，配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时，亚硫酸氢钠溶液的添加量占定容后溶液体积的0.1-2%。
进一步地，配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时，亚硫酸氢钠溶液的添加量占定容后溶液体积的1%。
因在烟酰胺标准工作液的检测中配置烟酰胺标准工作液时亚硫酸氢钠溶液无论加入与否都对检验结果没有影响，所以在配置烟酰胺标准工作液时可以不加入亚硫酸氢钠溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明配置在检测溶液时添加一定浓度的亚硫酸氢钠溶液，可以提高亚硫酸氢钠甲萘醌在水溶液中的稳定性，使反应向左移动，进而可以更加稳定和准确的对饲料添加剂亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌的含量进行检测和定量，增加其检测的精确度使检测结果更好的展示出样品真实水平。
2、本发明对配置检测溶液和液相色谱仪测定等相关步骤进行了改进使其检测的样品数量变少，从而节约了检测时间，减少其检测成本。
具体实施方式
一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法其步骤如下：
步骤一：配置标准溶液
（1）亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液的配置，准确称取100.00mg亚硫酸氢钠甲萘醌标准品于100.0mL棕色容量瓶中，用水溶解，加1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容，可得浓度为1000μg/mL的储备液，在检测前分别取储备液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL于100.0mL棕色容量瓶中，加1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容可得浓度分别为2μg/mL、 5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的标准溶液；
（2）烟酰胺标准工作液：准确称取烟酰胺标准品50mg，置于100.0mL容量瓶中，加水稀释定容，此储备液浓度为500ug/mL，分别取储备液0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL于100.0mL棕色容量瓶中，用水稀释成浓度分别为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的标准工作液，有效期一个月；
步骤二：样品溶液的制备
取试样0.1000g，置于100.0mL容量瓶中， 加入1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液和70.0mL水，超声波水浴中超声5min使之溶解，然后用水定容至刻度，摇匀，精确移取1.0mL溶液，置于50.0mL容量瓶中，加入0.5mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容，摇匀，取上清液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱的测定；
步骤三：测定，取标准溶液和样品溶液，分别连续进入液相色谱仪测定，待测样液中亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺的响应值应在工作曲线范围中。
色谱条件
色谱柱：C18，粒度5μm，250mm×4.6mm(内径)或性能类似的分析柱；
流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（2.5）：甲醇=65:35；
流速：1.0mL/min；
温度：30℃；
进样量：10μL；
检测器：紫外检测器(或二极管矩阵检测器PDA)，波长265nm。
步骤四：计算，按峰面积计算校正因子，并计算样品中的亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺含量计算方法如下；
试样中烟酰胺含量X1，甲萘醌含量X2、MNB含量X3以质量分数表示，分别按式（1）式（2）式（3）计算：
式（1）
式中：As1—烟酰胺标准溶液的色谱峰面积；
A1—烟酰胺样品溶液的色谱峰面积；
Cs1—通过标准工作液曲线测得的试液浓度，单位为μg/mL；
m —试样质量，单位为g ；
n—样品的稀释倍数。
式（2）
式中：As2—亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液中色谱峰面积；
A2—亚硫酸氢钠甲萘醌样品溶液中色谱峰面积；
CS2—通过标准工作液曲线测得的试液浓度，单位为μg/mL；
m —试样质量，单位为g；
n—样品的稀释倍数；
0.623—甲萘醌与亚硫酸氢钠甲萘醌（未含结晶水）的换算系数。
式（3）
式中：X2—甲萘醌含量，单位为%
A—样品的稀释倍数；
2.186—亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌于甲萘醌的换算系数；
计算结果保留至小数点后两位。
实验：
取两组亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌样品每组分为两份分别用GB/T26442-2010 与本发明所用方法分别进行检测。
具体结果见下表：
由以上结果可知，（1）亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液处理时未加入亚硫酸氢钠溶液，亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液的标准曲线R2=0.9713线性不好，加入后R2=0.9999线性变好；（2）样品处理时未加入亚硫酸氢钠溶液，最终计算得出的结果一是未达到标示量（96%），二是结果的平行线不好，而加入亚硫酸氢钠溶液后，结果明显改善，平行性变好，且达到标示量；（3）亚硫酸氢钠溶液加入与否，不影响烟酰胺的检测。
通过在水溶液中加入亚硫酸氢钠溶液，促进亚硫酸氢钠甲萘醌，甲萘醌和亚硫酸氢钠的动态平衡向左移动，提高亚硫酸氢钠甲萘醌在水溶液中的稳定性，进而能更加稳定和准确的对饲料添加剂亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌的含量进行定量，且此方法对亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌中烟酰胺含量的测定没有影响。
以上所述的实施例仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何本领域的技术人员可能在上述揭示的技术内容基础之上加以变更或改型的实施例，在未脱离本发明技术方案内容的前提下，均应落入本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，其特征在于，检测方法如下：
步骤一：配置标准溶液
（1）亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液的配置，准确称取100.00mg亚硫酸氢钠甲萘醌标准品于100.0mL棕色容量瓶中，用水溶解，加1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容，可得浓度为1000μg/mL的储备液，在检测前分别取储备液0.2mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL于100.0mL棕色容量瓶中，加1mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容可得浓度分别为2μg/mL、 5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的亚硫酸氢钠甲萘醌标准溶液；
（2）烟酰胺标准工作液：准确称取烟酰胺标准品50mg，置于100.0mL容量瓶中，加水稀释定容，可得浓度为500ug/mL的储备液，分别取储备液0.4mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL于100.0mL棕色容量瓶中，用水稀释成浓度分别为2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的标准工作液，有效期一个月；
步骤二：样品溶液的制备
取试样0.1000g，置于100.0mL容量瓶中， 加入1.0mL10%亚硫酸氢钠溶液和70.0mL水，超声波水浴中超声5min使之溶解，然后用水定容至刻度，摇匀，精确移取1.0mL溶液，置于50.0mL容量瓶中，加入0.5mL10%亚硫酸氢钠溶液，加水稀释定容，摇匀，取上清液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后用于高效液相色谱的测定；
步骤三：测定，取标准溶液和样品溶液，分别连续进入液相色谱仪测定，待测样液中亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺的响应值应在工作曲线范围中；
色谱条件
色谱柱：C18，粒度5μm，内径为250mm×4.6mm或性能类似的分析柱；
流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾溶液（2.5）：甲醇=65:35；
流速：1.0mL/min；
温度：30℃；
进样量：10μL；
检测器：使用紫外检测器或二极管矩阵检测器PDA，波长为265nm
步骤四：计算，按峰面积计算校正因子，并计算样品中的亚硫酸氢钠甲萘醌和烟酰胺含量。
2.根据权利要求1所述的一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，其特征在于配置标准溶液时所用的亚硫酸氢钠甲萘醌标准品其纯度≥98%，烟酰胺标准品的纯度≥99%。
3.根据权利要求1所述的一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，其特征在于配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时添加的亚硫酸氢钠溶液中为亚硫酸氢钠的纯度为分析纯，溶液浓度为5-20%。
4.根据权利要求2所述的一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，其特征在于在配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时添加的亚硫酸氢钠溶液中亚硫酸氢钠的纯度为分析纯，溶液浓度为10%。
5.根据权利要求1所述的一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，其特征在于在配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时，亚硫酸氢钠溶液的添加量占定容后溶液体积的0.1-2%。
6.根据权利要求4所述的一种亚硫酸氢烟酰胺甲萘醌检测方法，其特征在于在配置亚硫酸氢钠甲萘醌溶液时，亚硫酸氢钠溶液的添加量占定容后溶液体积的1%。
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