CN108760919A - 一种儿童维d钙咀嚼片制剂中维生素d3含量的检测方法 - Google Patents

一种儿童维d钙咀嚼片制剂中维生素d3含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，涉及药物分析技术领域，包括以下步骤：(1)标准品溶液的制备、(2)标准溶液的梯度稀释、(3)标准曲线的制作、(4)样品溶液的制备：取儿童维D钙咀嚼片，加入液氮研磨成粉末，微波助溶使粉末完全溶解，制得供试品溶液，经过离心机离心，用10ml取样器取出上清加入到500ml棕色圆底烧瓶中，将上清进行旋转蒸发；(5)阴性对照溶液的制备、(6)样品溶液的上样、(7)阴性对照溶液的上样，所述步骤(4)中的溶剂经过微波处理3‑5min。本发明操作简单，分离度高，专属性强、检测结果准确可信，适用于大批次、多批量的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测，具有很好的推广价值。

Description

一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法。
背景技术
维生素D3是胆钙化醇，又称为胆钙化固醇，是维生素D的一种。维生素D3能够提高肌体对钙、磷的吸收，使血浆钙和血浆磷的水平达到饱和程度，促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全，通过肠壁增加磷的吸收，并通过肾小管增加磷的再吸收，维持血液中柠檬酸盐的正常水平并且能够防止氨基酸通过肾脏损失。
维生素D3的稳定性好，是制备制剂时的首选原料。2015年版《中国药典》中收载的维生素D3含量测定方法采用高效液相色谱法，样品的制备需皂化处理，操作烦琐。维生素D3的含量测定大多采用高效液相色谱法，样品需用二甲基亚砜－水溶液提取，正己烷萃取，操作复杂、耗时长。也有少数采用反相高效液相色谱法测定，在流动相中加入二氯甲烷，对色谱柱的损害较大。儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3的含量低，辅料所占比例高，测定难度较大，现有的技术的检测方法是基于皂化法，对皂化液进行液液萃取，合并分次的萃取液后经旋转蒸发装置浓缩后定容，再使用正相色谱，对浓缩液中的干扰物质进行正相分离除杂，最终上机液进入液相色谱分析。上述方法操作过程复杂，液液萃取容易出现待测物提取不完全，两相液面出现乳化等现象；而正相色谱净化往往需要较专业的半制备液相色谱，以上两点均不利于大批量，多批次检验操作。儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3的含量低，现有的技术采用普通的研磨，溶解提取方式得到的溶液，操作方式虽然简单，但是由于维生素D3的相对含量非常低，直接注入高效液相色谱仪，几乎没有峰值，根本检测不到维生素D3。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单，分离度高，专属性强、检测结果准确可信，适用于大批次、多批量的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法。
一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准品溶液的制备：精密称取维生素D3标准品1-5mg加入到50ml棕色瓶中，然后向50ml棕色瓶中加入正戊醇5-10ml，随后微波助溶使维生素D3标准品完全溶解，制得标准品溶液；
(2)标准溶液的梯度稀释：震荡混匀步骤(1)制得的标准溶液，梯度稀释标准溶液，得到梯度稀释液；
(3)标准曲线的制作：精密量取10-30ul步骤(2)制得的梯度稀释液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，然后根据色谱图制作标准曲线；
(4)样品溶液的制备：取50-100片儿童维D钙咀嚼片加入到无菌研钵中，然后加入液氮研磨成粉末，随后精密称取30-70g粉末加入到500ml棕色瓶A中，再向500ml棕色瓶A中加入溶剂200-400ml，微波助溶使粉末完全溶解，制得供试品溶液，然后将制得的供试品溶液加入到500ml棕色离心管中，经过离心机离心，然后用10ml取样器取出上清加入到500ml棕色圆底烧瓶中，将上清进行旋转蒸发，制得维生素D3浓缩液，精密量取维生素D3浓缩液，加入正戊醇定容到5-10ml，制得样品溶液；
(5)阴性对照溶液的制备：将步骤(4)的离心管中剩余的下层溶液倒入500ml棕色瓶B中，制得阴性对照溶液；
(6)样品溶液的上样：精密量取10-30ul步骤(4)制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(7)阴性对照溶液的上样：精密量取10-30ul步骤(5)制得的阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
本发明的阴性对照排除其他峰的干扰，若维生素D3提取不完全，阴性对照液注入高效液相色谱仪之后就会产生对应的色谱峰，另外，儿童维D钙咀嚼片中辅料占用很大的比例，成分也较为复杂，阴性对照液注入高效液相色谱仪进行检测，记录色谱图，将得到的色谱图与色谱图进行对比，排除辅料成分对维生素D3含量检测的干扰。
本发明对儿童维D钙咀嚼片采用液氮研磨成粉末，液氮具有快速高效的作用，能够使维生素D3彻底释放，并且因为速度很快，也就避免了维生素D3被外界环境分解，有利于得到纯净的维生素D3。维生素D3是一种胆钙化醇，耐热性好，在空气中极易被氧化，本发明采用微波助溶，微波是频率在300MHz到300GHz的电波，溶剂和溶质在快速变化的高频电磁场(微波)作用下，其极性取向将随着外电场的变化而变化。造成溶剂分子的自旋运动的效应，加速分子运动，加快溶解速度和溶解的效率，并且很好的避免了空气的氧化。
本发明对供试品溶液进行离心机离心分离维生素D3和其他杂质，不互溶的液体在离心机中因密度不同而很快分离，离心机离心分离比重力分离时间要短得多。维生素D3对光不稳定，现有技术采用萃取技术进行分离，其原理是利用重力分离，时间非常长，并且无法做到很好的避光处理，维生素D3难免会部分分解，检测结果不准确可信。
本发明将上清进行旋转蒸发，制得维生素D3浓缩液，浓缩，指使溶剂蒸发而提高溶液的浓度，泛指不需要的部分减少而需要部分的相对含量增高。本发明中儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3的含量非常低(2.5ug/g)，离心分离得到的上清中维生素D3含量是微量的，若直接将得到的上清注入高效液相色谱仪，由于浓度过低，色谱图中几乎无法读取峰面积，与对照品浓度差异过大，所计算的结果不可信。因此本发明选用旋转蒸发技术对上清进行旋转蒸发浓缩，旋转蒸发的原理为在真空条件下，恒温加热，使旋转瓶恒速旋转，物料在瓶壁形成大面积薄膜，高效蒸发，得到高浓度的维生素D3浓缩液。
进一步的，所述步骤(4)中的溶剂包括氯仿溶液和乙醇溶液，所述氯仿溶液和乙醇溶液的体积比为20-40：1-3。
进一步的，所述步骤(4)中的溶剂经过微波处理3-5min。
本发明的溶剂经过微波处理，微波波长约在1m-1mm(相应频率约为300MHz到300GHz)之间的电磁波，微波可以使化学物质发生分子变形和振动，溶剂经过微波处理之后，化学活性增强，更有利于样品的溶解。
进一步的，所述高效液相色谱仪的流动相包括乙腈溶液和甲醇溶液，所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的乙腈溶液和甲醇溶液的体积比为80-100：10-20，所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的柱温为23-27℃、检测波长为245-275nm、流速为1-2ml/min。
本发明采用高效液相色谱仪检测，根据样品溶液和标准品溶液的峰面积来计算儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量，若以甲醇作为流动相，提高保留时间，峰宽变长，但是峰形不好，峰面积计算结果不准，若以乙腈作为流动相，乙腈粘度较甲醇小，从速率方程角度说，流动相传质阻抗小，有利于柱效提高，峰宽较窄，峰形较好，但是由于峰宽比较窄，峰面积的计算不准，检测结果也就不可信，以上两点均仅针对流动相，本发明将乙腈和甲醇进行合理配比来作为流动相，可以提高峰形的质量和提高保留时间，检测结果准确可信。
进一步的，所述步骤(4)中的离心机离心的转速为3000-5000rpm、离心时间为10-15min、离心温度为23-27℃。
进一步的，所述步骤(4)中的液氮研磨需在避光环境中进行研磨。
进一步的，所述步骤(4)中的旋转蒸发的温度为30-40℃，旋转速度为40-100rpm。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(4)中的微波助溶的时间为10-15min。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(4)中的正戊醇为色谱纯。
本发明的正戊醇为色谱纯，色谱纯一般是指色谱专用溶剂或者试剂，在低波长处的透光率比较好。色谱纯是指进行色谱分析时使用的标准试剂，在色谱条件下只出现指定化合物的峰，不出现杂质峰。
本发明的有益效果是：本发明操作简单，分离度高，专属性强、检测结果准确可信，适用于大批次、多批量的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测，具有很好的推广价值。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准品溶液的制备：精密称取维生素D3标准品1mg加入到50ml棕色瓶中，然后向50ml棕色瓶中加入正戊醇5ml，随后微波助溶使维生素D3标准品完全溶解，制得标准品溶液；
(2)标准溶液的梯度稀释：震荡混匀步骤(1)制得的标准溶液，梯度稀释标准溶液，得到梯度稀释液；
(3)标准曲线的制作：精密量取10ul步骤(2)制得的梯度稀释液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，然后根据色谱图制作标准曲线；
(4)样品溶液的制备：取50片儿童维D钙咀嚼片加入到无菌研钵中，然后加入液氮研磨成粉末，随后精密称取30g粉末加入到500ml棕色瓶A中，再向500ml棕色瓶A中加入溶剂200ml，微波助溶使粉末完全溶解，制得供试品溶液，然后将制得的供试品溶液加入到500ml棕色离心管中，经过离心机离心，然后用10ml取样器取出上清加入到500ml棕色圆底烧瓶中，将上清进行旋转蒸发，制得维生素D3浓缩液，精密量取维生素D3浓缩液，加入正戊醇定容到5ml，制得样品溶液；
(5)阴性对照溶液的制备：将步骤(4)的离心管中剩余的下层溶液倒入500ml棕色瓶B中，制得阴性对照溶液；
(6)样品溶液的上样：精密量取10ul步骤(4)制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(7)阴性对照溶液的上样：精密量取10ul步骤(5)制得的阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
所述步骤(4)中的溶剂包括氯仿溶液和乙醇溶液，氯仿溶液和乙醇溶液的体积比为40：1。
所述步骤(4)中的溶剂经过微波处理3min。
所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的流动相包括乙腈溶液和甲醇溶液，乙腈溶液和甲醇溶液的体积比为100：10，步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的柱温为23℃、检测波长为245nm、流速为1ml/min。
所述步骤(4)中的离心机离心的转速为3000rpm、离心时间为10min、离心温度为23℃。
所述步骤(4)中的液氮研磨需在避光环境中进行研磨。
所述步骤(4)中的旋转蒸发的温度为30-40℃，旋转速度为40-100rpm。
所述步骤(1)和步骤(4)中的微波助溶的时间为10-15min。
所述步骤(1)和步骤(4)中的正戊醇为色谱纯。
实施例2
一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准品溶液的制备：精密称取维生素D3标准品1-5mg加入到50ml棕色瓶中，然后向50ml棕色瓶中加入正戊醇7.5ml，随后微波助溶使维生素D3标准品完全溶解，制得标准品溶液；
(2)标准溶液的梯度稀释：震荡混匀步骤(1)制得的标准溶液，梯度稀释标准溶液，得到梯度稀释液；
(3)标准曲线的制作：精密量取20ul步骤(2)制得的梯度稀释液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，然后根据色谱图制作标准曲线；
(4)样品溶液的制备：取75片儿童维D钙咀嚼片加入到无菌研钵中，然后加入液氮研磨成粉末，随后精密称取50g粉末加入到500ml棕色瓶A中，再向500ml棕色瓶A中加入溶剂100ml，微波助溶使粉末完全溶解，制得供试品溶液，然后将制得的供试品溶液加入到500ml棕色离心管中，经过离心机离心，然后用10ml取样器取出上清加入到500ml棕色圆底烧瓶中，将上清进行旋转蒸发，制得维生素D3浓缩液，精密量取维生素D3浓缩液，加入正戊醇定容到7.5ml，制得样品溶液；
(5)阴性对照溶液的制备：将步骤(4)的离心管中剩余的下层溶液倒入500ml棕色瓶B中，制得阴性对照溶液；
(6)样品溶液的上样：精密量取20ul步骤(4)制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(7)阴性对照溶液的上样：精密量取20ul步骤(5)制得的阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
所述步骤(4)中的溶剂包括氯仿溶液和乙醇溶液，氯仿溶液和乙醇溶液的体积比为30：2。
所述步骤(4)中的溶剂经过微波处理4min。
所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的流动相包括乙腈溶液和甲醇溶液，乙腈溶液和甲醇溶液的体积比为90：15，步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的柱温为25℃、检测波长为260nm、流速为1.5ml/min。
所述步骤(4)中的离心机离心的转速为4000rpm、离心时间为13min、离心温度为25℃。
所述步骤(4)中的液氮研磨需在避光环境中进行研磨。
所述步骤(4)中的旋转蒸发的温度为35℃，旋转速度为70rpm。
所述步骤(1)和步骤(4)中的微波助溶的时间为13min。
所述步骤(1)和步骤(4)中的正戊醇为色谱纯。
实施例3
一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)标准品溶液的制备：精密称取维生素D3标准品5mg加入到50ml棕色瓶中，然后向50ml棕色瓶中加入正戊醇10ml，随后微波助溶使维生素D3标准品完全溶解，制得标准品溶液；
(2)标准溶液的梯度稀释：震荡混匀步骤(1)制得的标准溶液，梯度稀释标准溶液，得到梯度稀释液；
(3)标准曲线的制作：精密量取30ul步骤(2)制得的梯度稀释液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，然后根据色谱图制作标准曲线；
(4)样品溶液的制备：取100片儿童维D钙咀嚼片加入到无菌研钵中，然后加入液氮研磨成粉末，随后精密称取70g粉末加入到500ml棕色瓶A中，再向500ml棕色瓶A中加入溶剂400ml，微波助溶使粉末完全溶解，制得供试品溶液，然后将制得的供试品溶液加入到500ml棕色离心管中，经过离心机离心，然后用10ml取样器取出上清加入到500ml棕色圆底烧瓶中，将上清进行旋转蒸发，制得维生素D3浓缩液，精密量取维生素D3浓缩液，加入正戊醇定容到10ml，制得样品溶液；
(5)阴性对照溶液的制备：将步骤(4)的离心管中剩余的下层溶液倒入500ml棕色瓶B中，制得阴性对照溶液；
(6)样品溶液的上样：精密量取30ul步骤(4)制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(7)阴性对照溶液的上样：精密量取30ul步骤(5)制得的阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
所述步骤(4)中的溶剂包括氯仿溶液和乙醇溶液，氯仿溶液和乙醇溶液的体积比为20：3。
所述步骤(4)中的溶剂经过微波处理3-5min。
所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的流动相包括乙腈溶液和甲醇溶液，乙腈溶液和甲醇溶液的体积比为80：20，步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的柱温为27℃、检测波长为275nm、流速为2ml/min。
所述步骤(4)中的离心机离心的转速为5000rpm、离心时间为15min、离心温度为27℃。
所述步骤(4)中的液氮研磨需在避光环境中进行研磨。
所述步骤(4)中的旋转蒸发的温度为40℃，旋转速度为100rpm。
所述步骤(1)和步骤(4)中的微波助溶的时间为15min。
所述步骤(1)和步骤(4)中的正戊醇为色谱纯。
对比实施例1
本对比实施例1与实施例2相比，省去步骤(4)中的液氮操作，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
本对比实施例2与实施例2相比，省去步骤(4)中的旋转蒸发操作，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
本对比实施例3与实施例2相比，省去步骤(4)中的微波处理操作，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例4
省去步骤(4)中的液氮操作、步骤(4)中的旋转蒸发操作和步骤(4)中的微波处理操作，除此外的方法步骤均相同。
对照组1
申请号为：201610612293.8公开的一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法。
对照组2
申请号为为：201610543201.5公开的一种维生素D3含量的检测方法。
为了对比本发明效果，选用市面上同一批制得的儿童维D钙咀嚼片制剂(产品中生产的维生素D3的含量为：2.5ug/g)作为实验对象，分别用上述实施例1、实施例2、实施例3、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组1、对照组2的方法进行检测，对应检测的对比数据如下表1所示：
表1
维生素D3的含量(ug/g) 准确率(％)
实施例1 2.32 92.8
实施例2 2.48 99.2
实施例3 2.36 94.4
对比实施例1 2.08 83.2
对比实施例2 0.89 35.6
对比实施例3 1.37 54.8
对比实施例4 0.48 19.2
对照组1 0.57 22.8
对照组2 0.63 25.2
从上述表格可以看出，在与申请号为201610612293.8公开的一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法和申请号为201610543201.5公开的一种维生素D3含量的检测方法相比，本发明能够有效地保护维生素D3不被破坏，促进维生素D3彻底释放并完全溶解，并且旋转蒸发浓缩溶液，得到维生素D3含量高的浓缩液，解决了现有技术中维生素D3变性分解，高效液相色谱得不到有效的色谱峰，检测结果不准确，并且操作复杂的问题。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)标准品溶液的制备：精密称取维生素D3标准品1-5mg加入到50ml棕色瓶中，然后向50ml棕色瓶中加入正戊醇5-10ml，随后微波助溶使维生素D3标准品完全溶解，制得标准品溶液；
(2)标准溶液的梯度稀释：取震荡混匀步骤(1)制得的标准溶液，梯度稀释标准溶液，得到梯度稀释液；
(3)标准曲线的制作：精密量取10-30ul步骤(2)制得的梯度稀释液注入高效液相色谱仪，记录色谱图，然后根据色谱图制作标准曲线；
(4)样品溶液的制备：取50-100片儿童维D钙咀嚼片加入到无菌研钵中，然后加入液氮研磨成粉末，随后精密称取30-70g粉末加入到500ml棕色瓶A中，再向500ml棕色瓶A中加入溶剂200-400ml，微波助溶使粉末完全溶解，制得供试品溶液，然后将制得的供试品溶液加入到500ml棕色离心管中，经过离心机离心，然后用10ml取样器取出上清加入到500ml棕色圆底烧瓶中，将上清进行旋转蒸发，制得维生素D3浓缩液，精密量取维生素D3浓缩液，加入正戊醇定容到5-10ml，制得样品溶液；
(5)阴性对照溶液的制备：将步骤(4)的离心管中剩余的下层溶液倒入500ml棕色瓶B中，制得阴性对照溶液；
(6)样品溶液的上样：精密量取10-30ul步骤(4)制得的样品溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
(7)阴性对照溶液的上样：精密量取10-30ul步骤(5)制得的阴性对照溶液注入高效液相色谱仪，记录色谱图。
2.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的溶剂包括氯仿溶液和乙醇溶液，所述氯仿溶液和乙醇溶液的体积比为20-40：1-3。
3.根据权利要求2所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的溶剂经过微波处理3-5min。
4.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的流动相包括乙腈溶液和甲醇溶液，所述乙腈溶液和甲醇溶液的体积比为80-100：10-20，所述步骤(3)、步骤(6)和步骤(7)中的高效液相色谱仪的柱温为23-27℃、检测波长为245-275nm、流速为1-2ml/min。
5.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的离心机离心的转速为3000-5000rpm、离心时间为10-15min、离心温度为23-27℃。
6.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的液氮研磨需在避光环境中进行研磨。
7.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中的旋转蒸发的温度为30-40℃，旋转速度为40-100rpm。
8.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(4)中的微波助溶的时间为10-15min。
9.根据权利要求1所述的儿童维D钙咀嚼片制剂中维生素D3含量的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(4)中的正戊醇为色谱纯。
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