CN107245506A - 一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法和应用。该方法包括以下操作步骤：1.以市售化橘红提取物为原料制备提取物溶液，2.提取物的糖苷酶催化糖基化，3.糖基化产物的膜分离与浓缩，4.高生物利用度化橘红糖基化提取物的干燥与收集。所述应用是所述高生物利用度化橘红提取物在制备药物制剂、保健品或特殊配方食品中的应用。本发明的高生物利用度化橘红提取物是采用生物酶转化技术实现化橘红提取物黄酮的糖基化，从而提高其在水中的溶解度和体外溶出速度，同时可以提高其生物利用度。

Description

一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法和应用
一、技术领域
本发明属于黄酮化合物改性制备技术领域，提高化州橘红有效成分生物利用度和药效的生产工艺。
二、技术背景
化州橘红又名“化州陈皮”，是芸香科植物，其未成熟的果皮具有化痰、理气、健胃、消食等功能,用于治疗胸中痰滞,咳嗽气喘,呕吐呃逆,饮食积滞等。研究表明，化橘红中的有效成分为黄酮类化合物，虽然化橘红是一种名贵的中药材，但是起到主要药效的成分在纯水中的溶解度很低，生物利用度很低，大大降低了化橘红的药用价值，提高化橘红有效成分生物利用度和药效为本发明要解决的问题，
黄酮化合物主要存在于柑桔类果实中，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、阵血脂和胆固醇，增强毛细血管韧性、抗是自由基氧化，增强维生素C功效并具有美白皮肤、防止骨质疏松等作用，广泛应用于医药、食品、日用化学品领域，是一种极具开发利用价值且经济和社会效益良好的产品。化橘红中的黄酮化合物易溶于吡啶、二甲基甲酰胺和氢氧化钠溶液；微溶于甲醇、热冰醋酸、乙醋、丙酣、氯仿和苯；在纯水中，化橘红中的黄酮化合物的溶解度仅为0.02％。由于在水中的溶解度极低，致使化橘红中的黄酮化合物的开发利用受到极大限制，因此，必须进行改性处理，以增加其在水溶液中的溶解度，经过糖基化后，化橘红中的黄酮化合物的溶解度提高到1.02％，进而提升稳定性、吸收性、药效等应用领域。
现有化橘红中的黄酮化合物糖基化的方法，如公开号CN102051397A，要求的粗化橘红中的黄酮化合物的纯度高(化橘红中的黄酮化合物的纯度90％以上)，而且转化率较低(约50-80％，低于本发明的90％的转化率)，而且有未参加糖基化的化橘红中的黄酮化合物和残余的葡萄糖，大大降低了其药用价值；如公开号CN 104862362A，虽然化橘红中的黄酮化合物糖基化的纯度高，但是要求再制备液相的条件下来生产较高糖基化的化橘红中的黄酮化合物，其设备生产成本高，单位时间的产率低，生产工艺复杂，不利于工业化生产，大大限制了在生物生产上的应用。
三、发明内容
本发明是基于化橘红提取物有效成分黄酮化合物在纯水中的溶解度低，限制化橘红提取物在食品药物领域的应用，提供了一种提高化橘红提取物有效成分生物利用度和药效的生产工艺。
本发明首先通过市售粗化橘红提取物(50％)为原料，基于化橘红中的黄酮化合物易溶于氢氧化钠溶液(pH＝10-12)中，制备化橘红中的黄酮化合物溶液，制备化橘红中的黄酮化合物的超滤溶液，制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液，制备糖基化化橘红中的黄酮化合物溶液，制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉；制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液，制备高生物利用度化橘红糖基化提取物超滤溶液，制备高生物利用度化橘红糖基化提取物冻干粉。
具体方法步骤如下：
1.一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法的生产工艺，其特征在于操作步骤如下：
(1)制备化橘红中黄酮化合物溶液
以市售质量浓度为50～70％的化橘红中的黄酮化合物溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L中，在30～40℃条件下处理30min，即制备出化橘红中的黄酮化合物溶液。
(2)制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的化橘红中的黄酮化合物溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1～0.3MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为化橘红中的黄酮化合物超滤溶液。超滤截留液可在(1)中再次利用。
(3)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液
第(2)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:20～100投入到反应釜中，60～70℃恒温搅拌15～20h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于40℃、流速不低于10mL/min、操作压力0.55～1.0MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用。对收集的超滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为1～1.2MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氢氧化钠，送入生化处理池净化达标后排放，对收集的纳滤截留液，即为糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.l MPa的条件下减压浓缩至膏状，用于制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，颜色为黄色。
所用糖苷转移酶的活性不低于100U/mg的糖苷转移酶，即环糊精葡萄糖苷转移酶、麦芽糖基转移酶、4-α-葡萄糖转移酶、α-淀粉酶中的一种或一种以上混合物。
(4)制备糖基化化橘红黄酮化合物冻干粉
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化化橘红中的黄酮化合物浓缩液置于-20～-40℃的低温冰箱中预冻4～l0h，再送入冷冻干燥机中，在40～60Pa的绝对真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～48h，就制出高生物利用度化橘红糖基化提取物冻干粉，其收得率为85.2～88.3％，平均分子量为1450Da。
(5)高生物利用度化橘红糖基化提取物冻干粉溶出度研究
第(4)步完成后，将第(4)步收集的高生物利用度化橘红糖基化提取物的冻干粉，制成化橘红糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒剂，然后测定化橘红糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒剂的溶出速率。
(6)高生物利用度化橘红糖基化提取物的药代动力学研究
第(4)步完成后，将第(4)步收集的高生物利用度化橘红糖基化提取物的冻干粉，用PBS配成溶液，测定其在大鼠体内的代谢情况。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的化橘红中的黄酮化合物提取物为黄色粉末或膏状，微溶于水，总化橘红中的黄酮化合物含量50％以上。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：步骤1中所述氢氧化钠溶液pH＝10-12的溶液。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：糖苷转移酶：环糊精：化橘红中的黄酮化合物的质量比为1:20～80：20～60。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于所用糖苷转移酶的活性不低于100U/mg的糖苷转移酶，所选的糖苷酶为环糊精葡萄糖苷转移酶、麦芽糖基转移酶、4-α-葡萄糖转移酶、α-淀粉酶中的一种或一种以上混合物。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的酶催化转化反应的条件为反应温度60～70℃恒温搅拌15～20h，避光。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：步骤1配制的化橘红糖基化提取物的冻干粉的颗粒剂的含量为150mg。
步骤1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的应用方法，其特征在于：步骤1选定的大鼠重量在体重为250±20g，实验步骤要求按照《2015中国药典》。
本发明的糖基化化橘红中的黄酮化合物在制备药物制剂中的应用是将制得的化橘红糖基化提取物与常规的药剂辅料经常规方法制得；可根据需要制成适当的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、口服液等；通常以口服方式使用，也可以采用其他给药方式。
本发明的糖基化化橘红中的黄酮化合物在制备保健食品中的应用是将制得的化橘红糖基化提取物采用常规的保健食品加工方法制备成保健食品。
与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：(1)用市售的粗化橘红中的黄酮化合物为原料，降低了原料生产成本，提高原料的利用度；(2)进行化橘红中的黄酮化合物的酶催化反应，反应与分离于一体化，酶可以回收循环使用，提高了酶的使用效率，降低了生产成本，可以流水线循环产出，降低甚至消除了产物对酶的抑制作用、提高了催化反应的速度，缩短了生产周期；(3)本发明集成膜反应系统、冷冻干燥技术制备高生物利用度的化橘红中的黄酮化合物，适用于工业化生产；(4)本发明生产出糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉的生物利用度高，溶解度提高到1.02％，具有更高的医疗保健价值和更宽的实际应用领域。(5)本发明的化橘红糖基化提取物冻干粉在制备药物制剂中的应用是将制得的化橘红糖基化提取物冻干粉与常规的药剂辅料经常规方法制得；可根据需要制成适当的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、口服液等；通常以口服方式使用，也可以采用其他给药方式。(6)本发明的化橘红糖基化提取物冻干粉在制备保健食品中的应用是将制得的化橘红糖基化提取物冻干粉采用常规的保健食品加工方法制备成保健食品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明内容。
实施例1
一种以制备糖基化化橘红中的黄酮化合物的合成及纯化方法，其特征在于具体的方法步骤如下：
(1)制备化橘红中的黄酮化合物溶液
以市售质量浓度为50％的化橘红中的黄酮化合物溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L中，在30～40℃条件下处理30min，即制备出化橘红中的黄酮化合物溶液。
(2)制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的化橘红中的黄酮化合物溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1～0.3MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为化橘红中的黄酮化合物超滤溶液。超滤截留液可在(1)中再次利用。
(3)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液第(2)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:20～80投入到反应釜中，60℃恒温搅拌15h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于40℃、流速不低于30mL/min、操作压力0.55～0.65MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用。对收集的超滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为1.0～1.2MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氢氧化钠，送入生化处理池净化达标后排放，对收集的纳滤截留液，即为糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.l MPa的条件下减压浓缩至膏状，用于制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，颜色为黄色。
(4)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化化橘红中的黄酮化合物浓缩液置于-20℃的低温冰箱中预冻4h，再送入冷冻干燥机中，在40Pa的绝对真空度、-50℃温度下，进行冷冻干燥24h，就制出糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，其收得率为85.2％，平均分子量为1450Da，密封、避光保存于-20℃冰箱中。
实施例2
一种以制备糖基化化橘红中的黄酮化合物的合成及纯化方法，其特征在于具体的方法步骤如下：
(1)制备化橘红中的黄酮化合物溶液
以市售质量浓度为60％的化橘红中的黄酮化合物溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.4～0.5mol/L中，在35℃条件下处理30min，即制备出化橘红中的黄酮化合物溶液。
(2)制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的化橘红中的黄酮化合物溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.2～0.4MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为化橘红中的黄酮化合物超滤溶液。超滤截留液可在(1)中再次利用。
(3)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液
第(2)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:20～80投入到反应釜中，60℃恒温搅拌18h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于40℃、流速不低于20mL/min、操作压力0.65～0.75MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用。对收集的超滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为1.0～1.2MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氢氧化钠，送入生化处理池净化达标后排放，对收集的纳滤截留液，即为糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.l MPa的条件下减压浓缩至膏状，用于制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，颜色为黄色。
(4)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化化橘红中的黄酮化合物浓缩液置于-40℃的低温冰箱中预冻5h，再送入冷冻干燥机中，在50Pa的绝对真空度、-50℃温度下，进行冷冻干燥36h，就制出糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，其收得率为86.7％，平均分子量为1450Da。
实施例3
一种以制备糖基化化橘红中的黄酮化合物的合成及纯化方法，其特征在于具体的方法步骤如下：
(1)制备化橘红中的黄酮化合物溶液
以市售质量浓度为70％的化橘红中的黄酮化合物溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.6～1mol/L中，在30～40℃条件下处理30min，即制备出化橘红中的黄酮化合物溶液。
(2)制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的化橘红中的黄酮化合物溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.2～0.3MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为化橘红中的黄酮化合物超滤溶液。超滤截留液可在(1)中再次利用。
(3)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液
第(2)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:60投入到反应釜中，70℃恒温搅拌30h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于40℃、流速不低于10mL/min、操作压力0.85～1.0MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用。对收集的超滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为1.0～1.2MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氢氧化钠，送入生化处理池净化达标后排放，对收集的纳滤截留液，即为糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.l MPa的条件下减压浓缩至膏状，用于制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，颜色为黄色。
(4)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化化橘红中的黄酮化合物浓缩液置于-40℃的低温冰箱中预冻10h，再送入冷冻干燥机中，在40Pa的绝对真空度、-60℃温度下，进行冷冻干燥48h，就制出糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，其收得率为88.3％，平均分子量为1450Da，密封、避光保存于-20℃冰箱中。
实施例4
一种制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉固体颗粒剂的制备
将1.00g糖基化化橘红黄酮(GN)冻干粉溶解于30mL无水乙醇中，然后分别将2.0g、3.0g、6.0g、12.0g PVP K30溶解于l00mL无水乙醇中及1.00mg单硬脂酸甘油脂溶解于200mL无水乙醇，将混合载体材料溶液和糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉溶液混合，然后剧烈搅拌使混匀，采用旋转蒸发除去有机溶剂，待混合物里粘稠状态后，迅速冷却固化，25℃真空干燥箱中36h，研磨，过100目筛，即得固体颗粒GN-PVP(1:2)、GN-PVP(1:3)、GN-PVP(1:6)、GN-PVP(1:12)。
实施例5
一种制备高生物利用度化橘红糖基化提取物颗粒剂溶出度的测定
1分析方法学的建立
检测波长的确定：分别称取化橘红糖基化提取物冻干粉和辅料适量，用甲醇配制成适宜浓度的溶液，并以甲醇为空白对照，于200～700nm范围内进行扫描。结果表明在283nm处有化橘红糖基化提取物的最大吸收峰；而辅料在此处对化橘红糖基化提取物的测定均无干扰。因此，选定283nm作为测定波长。标准曲线：精密称取化橘红糖基化提取物冻干粉适量，用甲醇配制成系列浓度的溶液，于283nm处测定吸收度，以浓度(C)对吸收度(A)进行线性回归。
2固体颗粒溶出度的测定方法
称取化含有化橘红黄酮化合物(主要成分为柚皮苷)83nmol(50mg)的固体颗粒，以及含有化橘红糖基化提取物83nmol的固体颗粒样品进行溶出度试验。每组样品平行测定3份，按中国药典2015版第二法进行。溶出介质为900mL的蒸馏水，温度为37±0.5℃，转速为100±3rpm。分别在3、6、9、12、15min取样5mL并补入相同体积的溶出介质，样品经0.8μm微孔滤膜过滤。取续滤液稀释后于283nm处测定吸收度，计算化橘红糖基化提取物冻干粉的溶出度。
3测定结果
标准曲线方程C＝0.0455A+0.021,R2＝0.9945，线性范围：2.179～54.846μg/mL。本发明采用体外溶出度实验以柚皮苷原料药为对照，测定化橘红糖基化提取物固体颗粒在体外的溶出情况，结果表明，化橘红糖基化提取物固体颗粒在体外溶出情况良好。结果见表一
表一化橘红糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒的溶出速率
从表一可以看出，原料药柚皮苷在15min体外累计溶出的百分比为78.3％，而在本发明的糖基化化橘红提取物在3-15min内达到标量的88.53％-99.04％，制成的糖基化后的溶出速度均柚皮苷。因此糖基化增加了药物的体外释放速度。
实施例6
化橘红糖基化提取物在大鼠体内动力学研究
1药品、试剂与仪器
动物：大鼠(SPF级)，由中山大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK粤2016-00250
仪器：LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津，SIL-20A自动进样器、LC-20AD四元梯度泵、SPD-20AV紫外检测器)；Laboratory Centrifuges 3K18(Sigma)；XK96-13快速涡旋混合器(浙江)；HWS12型恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；BP 2110分析天平(德国Sartorius)；Simplicity超纯水系统(美国Millipore)。
试药：柚皮苷(Sigma公司，含量＞95％)；化橘红糖基化提取物冻干粉原料药及固体颗粒(实验室制备，批号：141105)；柚皮素(Sigma公司，含量＞98％)；补骨脂素(中国药品生物制品检定所，含量＞98％)；β-葡糖醛酸酶(Sigma，具硫酸酯酶活性)；甲醇(B&G公司，色谱纯)；冰醋酸(分析纯)；去离子水(美国Millipore)。
2柚皮素血药浓度的测定
2.1标准溶液的配制
标准储备液：称取105℃干燥至恒重的柚皮素(中国药典2015，化橘红中黄酮化合物的代谢产物主要为柚皮素)对照品各约10mg，精密称定，分别置于l00mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成浓度均为100μg/mL的母液；分别精密吸取母液适量，置于l0mL容量瓶中，用甲醇稀释走容成系列梯度浓度袖皮素对照品溶液(浓度依次为50μg/mL,25μg/mL,12.5μg/mL,6.25μg/mL,3.125μg/mL)，作为标准储备液，备用。
内标储备液：精密称取补骨脂素对照品10mg，用甲醇定容到100mL容量瓶中，配制成浓度为100μg/mL的母液，精密吸取母液，加甲醇稀释制成10μg/mL浓度对照品溶液,备用。
2.2检测条件(色谱条件)
色谱柱：Dikma C18柱(5μm,250mm×4.6mm)；
流动相：甲醇：水(冰醋酸调pH 3.0)＝53:47；
检测波长：283nm,324nm；
流速：1.0mL/min；柱温：室温；进样体积：50μL。
2.3血浆样品的处理方法
取血浆样品100μL，置1.5mL离心管中，加入50μL酶(β-葡萄糖醛酸酶，3000U/mL，具硫酸酯酶活性),37℃水浴2h，取出，加入内标溶液10μL，涡旋30s混合均匀，加入190μL甲醇沉淀蛋白，离心机上15000rpm离心12min，取上清液，50μL进样。
3分析方法学考察
3.1色谱条件专属性
空白血浆100μL 3份分别加入10μL的100μg/mL化橘红糖基化提取物冻干粉、10μL的100μg/mL柚皮素、10μL的100μg/mL补骨脂素对照品，考察是否有干扰。
3.2标准曲线与线性范围
精密吸取空白血浆溶液六份，每份100μL，分别加入10μL内标溶液和指定的系列浓度梯度化橘红糖基化提取物冻干粉溶液各10μL，血浆中化橘红糖基化提取物和柚皮素对照品浓度分别为：125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL。每个样品进样50μL。以柚皮苷、柚皮素与内标的峰面积比和化橘红糖基化提取物、柚皮素血浆浓度进行线性回归，即得标准曲线方程和线性范围。
4药代动力学实验的给药方设计及血样采集
采用单次给药，SD大鼠16只，体重为250±20g，随机分为2组。实验前一天禁食12h，自由饮水，分别灌服柚皮苷原料与化橘红糖基化提取物冻干粉片体(相当于原料药330mg/kg)，于预定的时间点(0.5,1,1.5,2,3,4,5,6,7,8,12h)大鼠眼眶取血0.5mL，置1.5mL经肝素处理的塑料离心管中，3000rpm/min离心10min；取上清血浆，置冰箱中-20℃保存，待分析。样品处理后测定。结果以给药时间为横坐标，以柚皮素的血药浓度为纵坐标绘制药时曲线。
5样品测定
采用建立的分析方法用来检测大鼠血浆中的柚皮素的浓度，专属性强，灵敏度较高，实验结果见表二所示。柚皮苷普通制剂及化橘红糖基化提取物固体颗粒口服后柚皮素血药达峰时间约在4h，血药峰值分别为8466.54±2069.91ng·mL-1及12839.75±2454.66ng·h·mL-1，计算出生物利用度分别为39028.23±4024.18ng·h·mL-1及57832.45±3934.63ng·h·mL-1。由实验结果得知，固体颗粒体提高了化橘红糖基化提取物的口服吸收以及生物利用度。药物的口服生物利用度是由多种原因决定的，其中之一就是药物溶解差，分散性不好而限制其吸收。化橘红糖基化提取物通过提高其溶解度、分散度和溶出度而达到提高生物利用度的目的。表二大鼠灌胃给药后血浆样品测定结果(n＝8)

Claims (7)

1.一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法的生产工艺，其特征在于操作步骤如下：
(1)制备化橘红中黄酮化合物溶液
以市售质量浓度为50～70％的化橘红中的黄酮化合物溶于氢氧化钠或氢氧化钾溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L中，在30～40℃条件下处理30min，即制备出化橘红中的黄酮化合物溶液。
(2)制备化橘红中的黄酮化合物超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的化橘红中的黄酮化合物溶液泵入截留分子量为1000～2000Da的聚醚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1～0.3MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至化橘红中的黄酮化合物溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为化橘红中的黄酮化合物超滤溶液。超滤截留液可在(1)中再次利用。
(3)制备糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液
第(2)步完成后，在超滤滤过液加入糖苷转移酶：环糊精的质量比为1:20～80投入到反应釜中，60～70℃恒温搅拌15～20h，然后泵入4000～5000Da的聚醚砜膜超滤器中，在温度不高于50℃、流速不低于15mL/min、操作压力0.6～1.2MPa的条件下超滤分离回收，截留液中主要为糖苷转移酶，返回到糖苷转移酶容器中重复利用。对收集的超滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为1～1.2MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氢氧化钠，送入生化处理池净化达标后排放；对收集的纳滤截留液，即为糖基化化橘红中的黄酮化合物反应液，将截留液在温度40～50℃、真空度0.09～0.lMPa的条件下减压浓缩至膏状，用于制备糖基化化橘红中的黄酮化合物冻干粉，颜色为黄色。
所用糖苷转移酶的活性不低于100U/mg的糖苷转移酶，即环糊精葡萄糖苷转移酶、麦芽糖基转移酶、4-α-葡萄糖转移酶、α-淀粉酶中的一种或一种以上混合物。
(4)制备糖基化化橘红黄酮化合物冻干粉
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化化橘红中的黄酮化合物浓缩液置于-18～-40℃的低温冰箱中预冻4～l0h，再送入冷冻干燥机中，在40～60Pa的绝对真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～48h，就制出糖基化化橘红黄酮冻干粉，其收得率为80.2～86.1％，平均分子量为1450Da。
(5)高生物利用度化橘红糖基化提取物冻干粉溶出度研究
第(4)步完成后，将第(4)步收集的高生物利用度化橘红糖基化提取物的冻干粉，制成化橘红糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒剂，然后测定化橘红糖基化提取物-聚乙烯吡咯烷酮K30颗粒剂的溶出速率。
(6)糖基化后化橘红黄酮化合物的药代动力学研究
第(4)步完成后，将第(4)步收集的高生物利用度化橘红糖基化提取物，用PBS配成溶液，测定其在大鼠体内的代谢情况。
2.根据权利要求1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的化橘红中的黄酮化合物提取物为黄色粉末或膏状，微溶于水，总化橘红中的黄酮化合物含量50％以上。
3.根据权利要求1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于：步骤1中所述氢氧化钠溶液pH＝10-12的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于糖苷转移酶：环糊精：化橘红中的黄酮化合物的质量比为1:20～80：20～60。
5.根据权利要求1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于所用糖苷转移酶的活性不低于100U/mg的糖苷转移酶，所选的糖苷酶为环糊精葡萄糖苷转移酶、麦芽糖基转移酶、4-α-葡萄糖转移酶、α-淀粉酶中的一种或一种以上混合物。
6.根据权利要求1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的制备方法，其特征在于步骤1中所述的酶催化转化反应的条件为反应温度60～70℃恒温搅拌15～20h，避光。
7.根据权利要求1所述的一种高生物利用度化橘红提取物的应用方法，在制备药物试剂和保健食品中的应用。
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