CN102051397A - α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，包括以下步骤：a)、酶转化反应：以橙皮苷和糊精为原料，在α-葡萄糖基转移酶作用下发生α-葡萄糖基化反应，生成α-葡萄糖基橙皮苷；b)、树脂吸附提纯：a步反应结束后，将反应混合液加热至80°使酶失活，放置过夜后过滤取上层清液，将清液过HP-10大孔树脂柱以除去糖和无机盐；c)、脱色工序：将b步经大孔树脂柱处理后的清液进行活性炭脱色处理；d)、浓缩结晶工序：经c步活性炭脱色后液体再经浓缩结晶处理，得到目标产物。它具有制备方法路线简单、反应条件温和、产率高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种改性橙皮苷的制备方法，具体来说是α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法。
背景技术
橙皮苷是柑橘60种黄酮类化合物中重要的一种，主要分布在柑橘类植物中，常存在于甜橙、酸橙、柠檬、宽皮橘、葡萄柚及柑橘等芸香科植物中。橙皮苷是一种二氢黄酮，熔点245～254℃，呈弱酸性，难溶于水，几乎不溶于丙酮、苯、三氯甲烷、易溶于稀碱溶液。橙皮苷可抗氧化，可完全抑制脂质过氧化物的形成，对羟自由基有明显清除作用，具有抗癌，抗病毒，抗细菌作用，对食品的常见的污染菌有广谱抑菌作用，还具有强化毛细血管，预防毛细血管出血的作用，是高血压和动脉硬化所致的血管疾病有效的治疗剂和预防剂。
橙皮苷的结构式：
目前，橙皮苷在医药、食品及日用化工有一定应用。但是由于其水溶性和脂溶性较差，影响橙皮苷在体内的代谢，其应用受到限制。通过橙皮苷的改性，其水溶性，吸收性，以及药物疗效都有一些改善。
欲改善橙皮苷的化学特性，目前有以下几种方法：
1、橙皮苷的甲基化：甲基橙皮苷溶于水，具有与橙皮苷同样的药理作用，还增加了改善肤色等功效，但有实验显示，甲基橙皮苷对.OH的清除作用小于橙皮苷，抗氧化能力有所减弱。
、橙皮苷酶催化水解和高温下酸催化水解：得到同一种物质橙皮素单糖苷， 是一种甜味剂的前体，具有较强的的抗感冒病毒活性，但采用游离橙皮苷酶制备橙皮素单糖苷时，酶的回收困难，成本较高。用酸催化水解法制备橙皮素单糖苷，虽然成品较低，但纯化分离较为复杂，且易污染环境。
3、橙皮苷的磺化：橙皮苷的磺化的方法值得橙皮苷磺化产物为五种橙皮苷磺酸钠的混合物，通过磺化反应，提高其水溶性，但对磺化橙皮苷的其他功能未作评价，有待于进一步研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，以通过酶法改善橙皮苷的化学特性。
本发明的目的是这样实现的：一种α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，包括以下步骤：
a)、酶转化反应：
以橙皮苷和糊精为原料，在α-葡萄糖基转移酶作用下发生α-葡萄糖基化反应，生成α-葡萄糖基橙皮苷；
b)、树脂吸附提纯：
a步反应结束后，将反应混合液加热至80°使酶失活，放置过夜后过滤取上层清液，将清液过HP-10大孔树脂柱以除去糖和无机盐；
c)、脱色工序：
将b步经大孔树脂柱处理后的清液进行活性炭脱色处理；
d)、浓缩结晶工序：
经c步活性炭脱色后液体再经浓缩结晶处理，得到目标产物。
上述a步酶转化反应时PH值控制在6～8，反应温度控制在50～60℃，α-葡萄糖基转移酶的加入量控制在600～1200IU/g，反应时间为24小时。
上述a步酶转化反应时PH值控制在7，反应温度控制在55℃，α-葡萄糖基转移酶的加入量控制在800IU/g。
上述糊精是DE值4-20的糊精或以淀粉为原料经酶处理得到的粗糊精。
上述a步酶转化反应期间采用液相色谱仪跟踪反应完全程度。
本发明提供的α-葡萄糖基橙皮苷，其化学结构式为：
α-葡萄糖基转移酶是一种具有催化功能的多糖类合成酶，主要是从嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱脂肪芽孢杆菌、软化芽孢杆菌等微生物中分离得到的。
橙皮苷转化反应成α-葡萄糖基橙皮苷后，理化性质和生理功能更加优越，可以直接用于医药、食品、饲料、日化等行业，也可以将粗品进一步提纯。提纯方法可以是重结晶、柱层析、大孔吸附树脂等，优选采用HP-10型大孔吸附树脂，先用水冲洗去无机盐、糖等水溶性成分，再用乙醇/水混合溶剂冲洗出产品，70％乙醇可冲出α-葡萄糖基橙皮苷。产物经浓缩、脱色、结晶等工艺获得白色粉末。
酶转化产物经上述工艺提纯后，采用HPLC检测产物的含量。
HPLC检测条件如下：
柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：V(乙腈)∶V(4％的醋酸溶液)＝60∶40；
流速：1.3ml/min；
检测波长：287nm；
柱温：40℃；
进样量：10μl。
本发明的有益效果是：本发明制备方法路线简单、反应条件温和、产率高。
具体实施方式
实施例1：将5.0g橙皮苷与20ml 5％的糊精混合，然后加入2.5ml α-葡萄糖基转移酶，调节PH值到6.0左右，55℃下反应24h。HPLC检测显示橙皮苷部分转变成α-葡萄糖基橙皮苷。反应结束后，将反应混合液加热至80℃使酶(指 α-葡萄糖基转移酶，下同)失活，放置过夜后过滤取上层清液。将清液过HP-10大孔树脂柱，再经活性炭过滤脱色处理(用蒸馏水洗柱除去糖和无机盐等物质，再用70％乙醇溶液洗柱)，浓缩结晶得到产物即α-葡萄糖基橙皮苷，该工艺中橙皮苷的转化率为52.54％。
实施例2：将5.0g橙皮苷与20ml 5％的糊精混合，添加3.0mlα-葡萄糖基转移酶，然后调节PH值到6.0左右，55℃下反应24h。HPLC检测显示橙皮苷部分转变成α-葡萄糖基橙皮苷。反应结束后，将反应混合液加热至80℃使酶失活，然后旋干溶剂(指水，下同)再加入蒸馏水，放置过夜后过滤取上层清液。将清液过HP-10大孔树脂柱，再经活性炭过滤脱色处理(用蒸馏水洗柱除去糖和无机盐等物质，再用70％乙醇溶液洗柱)，浓缩旋干得到产物即α-葡萄糖基橙皮苷，该工艺中橙皮苷的转化率为59.41％。
实施例3：将5.0g橙皮苷与20ml 5％的糊精混合，添加3.0mlα-葡萄糖基转移酶，然后调节PH值到7.0左右，60℃下反应24h。HPLC检测显示橙皮苷部分转变成α-葡萄糖基橙皮苷。反应结束后，将反应混合液加热至80℃使酶失活，然后旋干溶剂再加入蒸馏水，放置过夜后过滤取上层清液。将清液过HP-10大孔树脂柱，再经活性炭过滤脱色处理(用蒸馏水洗柱除去糖和无机盐等物质，再用70％乙醇溶液洗柱)，浓缩结晶得到产物即α-葡萄糖基橙皮苷，该工艺中橙皮苷的转化率为66.47％。
实施例4：将5.0g橙皮苷与20ml 5％的糊精混合，添加4.0mlα-葡萄糖基转移酶，然后调节PH值到8.0左右，60℃下反应24h。HPLC检测显示橙皮苷部分转变成α-葡萄糖基橙皮苷。反应结束后，将反应混合液加热至80℃使酶失活，然后旋干溶剂再加入蒸馏水，放置过夜后过滤取上层清液。将清液过HP-10大孔树脂柱，再经活性炭过滤脱色处理(用蒸馏水洗柱除去糖和无机盐等物质，再用70％乙醇溶液洗柱)，浓缩结晶得到产物即α-葡萄糖基橙皮苷，该工艺中橙皮苷的转化率为56.69％。
最佳工艺实施例：将5.0g橙皮苷与20ml 5％的糊精混合，添加4.0mlα-葡萄糖基转移酶，然后调节PH值到7.0左右，55℃下反应24h。HPLC检测显示橙皮苷部分转变成α-葡萄糖基橙皮苷。反应结束后，将反应混合液加热至80℃使酶失活，然后旋干溶剂再加入蒸馏水，放置过夜后过滤取上层清液。将清液过 HP-10大孔树脂柱，再经活性炭过滤脱色处理(用蒸馏水洗柱除去糖和无机盐等物质，再用70％乙醇溶液洗柱)，浓缩结晶得到产物即α-葡萄糖基橙皮苷，该工艺中橙皮苷的转化率为83.01％。
吸附树脂的筛选：
选择常用树脂D296、D101、HP-10进行对比试验，观察各种树脂对α-葡萄糖基橙皮苷的吸附和解析能力，结果如下：
三种不同的树脂(D296、D101、HP-10)对α-葡萄糖基橙皮苷的吸附特征，静态吸附量依次为HP-10＞D296＞D101，HP-10吸附α-葡萄糖基橙皮苷的量最大；各种树脂的解吸能力为：D101＞HP-10＞D296，以D101树脂的解吸能力最强，综合树脂的吸附和解吸能力，选择HP-10树脂为吸附填料。
Claims (5)
1.一种α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
a)、酶转化反应：
以橙皮苷和糊精在原料，在α-葡萄糖基转移酶作用下发生α-葡萄糖基化反应，生成α-葡萄糖基橙皮苷；
b)、树脂吸附提纯：
a步反应结束后，将反应混合液加热至80°使酶失活，放置过夜后过滤取上层清液，将清液过HP-10大孔树脂柱以除去糖和无机盐；
c)、脱色工序：
将b步经大孔树脂柱处理后的清液进行活性炭脱色处理；
d)、浓缩结晶工序：
经c步活性炭脱色后液体再经浓缩结晶处理，得到目标产物。
2.根据权利要求1所述α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，其特征是：所述a步酶转化反应时PH值控制在6～8，反应温度控制在50～60℃，α-葡萄糖基转移酶的加入量控制在600～1200IU/g，反应时间为24小时。
3.根据权利要求2所述α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，其特征是：所述a步酶转化反应时PH值控制在7，反应温度控制在55℃，α-葡萄糖基转移酶的加入量控制在800IU/g。
4.根据权利要求1～3任一权利要求所述α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，其特征是：所述糊精是DE值4-20的糊精或以淀粉为原料经酶处理得到的粗糊精。
5.根据权利要求4所述α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法，其特征是：所述a步酶转化反应期间采用液相色谱仪跟踪反应完全程度。
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