CN104862362B - 一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，属于植物中黄酮化合物改性制备技术领域。本发明以市售橙皮苷为原料，经过制备橙皮苷溶液，制备橙皮苷超滤溶液，制备糖基化橙皮苷反应液，制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液，制备糖基化橙皮苷冻干粉及制备多糖冻干粉的步骤制得产品。本发明生产设备简单，操作方便；工艺简单，能充分利用物料资源，生产成本低，提高了橙皮苷在水中的溶解度，产品纯度高达98％。采用本发明制备出的糖基化橙皮苷产品，其溶解性、功能性以及半衰期均较橙皮苷有了很大的改善，可广泛用于医药、食品、日用化学品等行业中。
Description
一、技术领域
本发明属于黄酮化合物改性制备技术领域，具体涉及糖基化橙皮苷的合成及纯化方法。
二、背景技术
黄酮化合物橙皮苷主要存在于柑桔类果实中，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血脂和胆固醇，增强毛细血管韧性、抗羟自由基氧化，增强维生素C功效并具有美白皮肤、防止骨质疏松等作用，广泛应用于医药、食品、日用化学品领域，是一种极具开发利用价值且经济和社会效益良好的产品。
橙皮苷溶于吡啶、二甲基甲酰胺和氢氧化钠溶液，微溶于甲醇、热冰醋酸、乙醚、丙酮、氯仿和苯；在纯水中，橙皮苷的溶解度仅为0.002％。由于在水中的溶解度极低，致使橙皮苷的开发利用受到极大限制，因此，必须进行改性处理，以增加其在水溶液中的溶解度，进而提升稳定性、吸收性、药效和应用领域。
现有制备糖基化橙皮苷的方法，如公开号为CN102051397A的“α-葡萄糖基橙皮苷的制备方法”的发明专利，公开的是以橙皮苷和糊精为原料，在α-葡萄糖基转移酶的作用下发生α-葡萄糖基化反应，生成α-葡萄糖基橙皮苷，然后经过树脂吸附提纯，脱色和浓缩结晶的步骤，制得α-葡萄糖基橙皮苷产品。该方法制备糖基化橙皮苷的主要缺点是：使用纯度高达98％以上的橙皮苷为原料，成本极高；该工艺中橙皮苷的转化率仅为52.54％～83.01％，且未分离出橙皮苷原料、糊精、单糖基化橙皮苷和二糖基化橙皮苷等，产物系混合物。由于糖基化水平不同，单糖基化橙皮苷和二糖基化橙皮苷在水中的溶解度、理化性质、药效及其用途均可能出现明显差异，因而该工艺制备的产品质量不高。
三、发明内容
本发明的目的是针对现有方法制备出的水溶性橙皮苷的缺陷，提供一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法。该方法以粗橙皮苷为原料，具有糖基化橙皮苷合成率和纯度均高、资源利用率高、无有害物质排放等特点。本发明的主要原理是：黄酮化合物橙皮苷母核为平面结构，分子之间通过疏水相互作用和氢键聚合，难溶于水；环糊精葡萄糖基转移酶为生物催化剂，专一催化转移环糊精分子的葡萄糖残基至化合物的羟基，形成糖基化衍生物；橙皮苷含酚羟基和醇羟基，在环糊精葡萄糖基转移酶催化下，可接受β-环糊精中的葡萄糖残基形成糖基化橙皮苷；由于葡萄糖残基本身为水溶性分子，它的加入破坏了橙皮苷原有的平面结构，致使分子之间的疏水相互作用显著降低，溶解度增加。
本发明的目的是这样实现的：一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，以市售粗橙皮苷为原料，经过制备橙皮苷溶液，制备橙皮苷超滤溶液，制备糖基化橙皮苷反应液，制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液，制备糖基化橙皮苷冻干粉及制备多糖冻干粉的步骤制得产品。其具体方法步骤如下：
(1)制备橙皮苷溶液
以市售橙皮苷质量浓度为50～70％的粗橙皮苷为原料，按照粗橙皮苷的质量∶氢氧化钠溶液体积比为1∶40～60的比例，在搅拌下向氢氧化钠溶液中加入粗橙皮苷，处理15～30分钟，即制备出橙皮苷溶液，用于制备橙皮苷超滤溶液；其中，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L。
(2)制备橙皮苷超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的橙皮苷溶液泵入截留分子量为5000～10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05～0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至橙皮苷溶液体积的1/10～1/20时停止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为橙皮苷超滤溶液，用于制备糖基化橙皮苷反应液；对收集的超滤截留液，主要含柑橘多糖，用于制备多糖冻干粉。
(3)制备糖基化橙皮苷反应液
第(2)步完成后，先按环糊精葡萄糖基转移酶∶橙皮苷∶β-环糊精的摩尔比为1∶150～500∶150～400的比例，依次将第(2)步制备出的橙皮苷超滤溶液、β-环糊精加入到搪玻璃反应釜中，向反应釜夹层通入循环热水，在搅拌下升温至50～70℃，再用稀盐酸溶液调节pH为6.0～8.0，接着加入环糊精葡萄糖基转移酶，恒温搅拌反应24～30h。反应完成后升温至80～90℃，保持5～15min，使酶失活。最后进行抽滤，弃滤渣并收集抽滤液，对收集的抽滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为0.1～0.5MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止。分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氯化钠，送入生化处理池净化达标后排放；对收集的纳滤截留液，即为糖基化橙皮苷反应液，用于制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液。
(4)制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化橙皮苷反应液用0.22～0.5μm的微孔滤膜过滤，弃滤渣并收集滤液。对收集的滤液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型高效液相色谱中，进行色谱分离。控制色谱条件为：检测波长为283nm，柱温为25℃，流动相流速为20mL·min-1，糖基化橙皮苷反应液的进样量∶反相C18硅胶填料质量比为1∶50～100；流动相中A组分为甲醇，B组分为醋酸水溶液，其中，醋酸∶水体积比为1∶14～17；梯度洗脱程序为：在0～15min区间，流动相中的A组分由35％上升至50％，B组分由65％下降至50％，在15～25min区间，流动相中的A组分由50％上升至75％，B组分由50％下降至25％，在25～30min区间，流动相中的A组分由75％上升至100％，B组分由25％下降至0％。分别收集过柱流出液和出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液。对收集的过柱流出液，送入生化处理池进行净化处理，达标后排放；对收集的出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液，在温度为50～70℃、绝对真空度为0.05～0.09MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。分别收集出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，出峰时间为9.6～12.4min浓缩液以及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液和其真空浓缩冷凝液。对收集的真空浓缩冷凝液，用去离子水调节其甲醇体积浓度为35％，可再次用于洗脱吸附于反相C18硅胶填料上的橙皮苷、单糖基化和二糖基化橙皮苷；对于收集的出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，即为橙皮苷浓缩液，可再次用于制备橙皮苷溶液；对于收集的出峰时间为9.6～12.4min浓缩液及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液，分别为单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液，分别用于制备单糖基化和二糖基化橙皮苷冻干粉。
(5)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(4)步完成后，将第(4)步收集的单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液分别置于-20～-40℃的低温冰箱中预冻4～10h，再分别送入冷冻干燥机中，在40～60Pa的绝对真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～48小时，就分别制备出单糖基化橙皮苷冻干粉和二糖基化橙皮苷冻干粉。HPLC分析表明，单糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98～99.5％，收得率为63.5～71.7％；二糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98～99.5％，收得率为25.4～14.8％。
(6)制备多糖冻干粉
第(2)步完成后，先将第(2)步收集的超滤截留液用稀盐酸中和至pH6.0～8.0，再向其中加入纯水，纯水加入量为中和后超滤截留液体积的5～8倍，即获得中和稀释液。将该中和稀释液搅拌均匀后泵入截留分子量为5000～10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05～0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至中和稀释液体积的1/10～1/20时停止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，送入生化处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的超滤截留液，将其置于-20～-40℃的低温冰箱中预冻2～4h，再分别送入冷冻干燥机中，在绝对真空度为40～60Pa、-40～-50℃的环境下冻干24～48h，就制备出多糖质量浓度达到85～91％的多糖冻干粉，其收得率为5.2～8.3％，平均分子量为18500Da。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
(1)本发明仅采用溶解、超滤、酶法改性、色谱分离、真空浓缩及冷冻干燥等简单工艺，反应条件温和，操作简便，节约能源，生产成本低，便于推广应用；
(2)本发明生产过程采用环糊精葡萄糖基转移酶对橙皮苷进行糖基化改性，橙皮苷在水中的溶解度仅为0.002％，改性后获得的单糖基化和二糖基化橙皮苷在水中的溶解度分别达到6.5％和16.3％，能更广泛地应用于制药、食品、保健品和化妆品等领域。
(3)本发明生产过程采用制备型液相色谱进行分离纯化，制备出质量浓度均高达98％以上的单糖基化和二糖基化橙皮苷产品，实现回收再利用橙皮苷并制备出具有抗氧化等功能的柑橘多糖冻干粉，资源利用度高，生产成本低；生产过程中产生的废水均进行了净化处理，达标后排放，是一种绿色生产方法。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，具体步骤如下：
(1)制备橙皮苷溶液
以市售橙皮苷质量浓度为50％的粗橙皮苷为原料，按照粗橙皮苷的质量∶氢氧化钠溶液体积比为1∶40的比例，在搅拌下向氢氧化钠溶液中加入粗橙皮苷，处理15分钟，即制备出橙皮苷溶液，用于制备橙皮苷超滤溶液；其中，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为0.1mol/L。
(2)制备橙皮苷超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的橙皮苷溶液泵入截留分子量为5000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至橙皮苷溶液体积的1/10时停止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为橙皮苷超滤溶液，用于制备糖基化橙皮苷反应液；对收集的超滤截留液，主要含柑橘多糖，用于制备多糖冻干粉。
(3)制备糖基化橙皮苷反应液
第(2)步完成后，先按环糊精葡萄糖基转移酶∶橙皮苷∶β-环糊精的摩尔比为1∶150∶225的比例，依次将第(2)步制备出的橙皮苷超滤溶液、β-环糊精加入到搪玻璃反应釜中；向反应釜夹层通入循环热水，在搅拌下升温至55℃；再用稀盐酸溶液调节pH为7.0，接着加入环糊精葡萄糖基转移酶，恒温搅拌反应24h。反应完成后升温至80℃，保持5min，使酶失活。最后进行抽滤，弃滤渣并收集抽滤液，对收集的抽滤液，泵入截留分子量为150Da的纳滤器中，控制纳滤压力为0.1MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5时停止。分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氯化钠，送入生化处理池净化达标后排放；对收集的纳滤截留液，即为糖基化橙皮苷反应液，用于制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液。
(4)制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化橙皮苷反应液用0.22μm的微孔滤膜过滤，弃滤渣并收集滤液。对收集的滤液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型高效液相色谱中，进行色谱分离。控制色谱条件为：检测波长为283nm，柱温为25℃，流动相流速为20mL·min-1，糖基化橙皮苷反应液的进样量∶反相C18硅胶填料质量比为1∶50；流动相中A组分为甲醇，B组分为醋酸水溶液，其中，醋酸∶水体积比为1∶14；梯度洗脱程序为：在0～15min区间，流动相中的A组分由35％上升至50％，B组分由65％下降至50％；在15～25min区间，流动相中的A组分由50％上升至75％，B组分由50％下降至25％；在25～30min区间，流动相中的A组分由75％上升至100％，B组分由25％下降至0％。分别收集过柱流出液和出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液。对收集的过柱流出液，送入生化处理池进行净化处理，达标后排放；对收集的出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液，在温度为50℃、绝对真空度为0.05MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。分别收集出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，出峰时间为9.6～12.4min浓缩液以及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液和其真空浓缩冷凝液。对收集的真空浓缩冷凝液，用去离子水调节其甲醇体积浓度为35％，可再次用于洗脱吸附于反相C18硅胶填料上的橙皮苷、单糖基化和二糖基化橙皮苷；对于收集的出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，即为橙皮苷浓缩液，可再次用于制备橙皮苷溶液；对于收集的出峰时间为9.6～12.4min浓缩液及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液，分别为单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液，分别用于制备单糖基化和二糖基化橙皮苷冻干粉。
(5)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(4)步完成后，将第(4)步收集的单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液分别置于-20℃的低温冰箱中预冻4h，再分别送入冷冻干燥机中，在40Pa的绝对真空度、-50℃温度下，进行冷冻干燥24小时，就分别制备出单糖基化橙皮苷冻干粉和二糖基化橙皮苷冻干粉。HPLC分析表明，单糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98.5％，收得率为67.4％；二糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98％，收得率为21.6％。
(6)制备多糖冻干粉
第(2)步完成后，先将第(2)步收集的超滤截留液用稀盐酸中和至pH6.0，再向其中加入纯水，纯水加入量为中和后超滤截留液体积的5倍，即获得中和稀释液。将该中和稀释液搅拌均匀后泵入截留分子量为5000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至中和稀释液体积的1/10时停止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，送入生化处理池进行生化处理，达标后排放；对收集的超滤截留液，将其置于-20℃的低温冰箱中预冻2h，再分别送入冷冻干燥机中，在绝对真空度为40Pa、-40℃的环境下冻干24h，就制备出多糖质量浓度达到85％的多糖冻干粉，其收得率为5.2％，平均分子量为18500Da。
实施例2
一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，以市售橙皮苷质量浓度为60％的粗橙皮苷为原料，按照粗橙皮苷的质量∶氢氧化钠溶液体积比为1∶50的比例，在搅拌下向氢氧化钠溶液中加入粗橙皮苷，处理20分钟；其中，所述的氢氧化钠溶液摩尔浓度为0.5mol/L。
第(2)步中，将第(1)步制备出的橙皮苷溶液泵入截留分子量为10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至橙皮苷溶液体积的1/15时停止。
第(3)步中，按环糊精葡萄糖基转移酶∶橙皮苷∶β-环糊精的摩尔比为1∶150∶300的比例，依次将第(2)步制备出的橙皮苷超滤溶液、β-环糊精加入到搪玻璃反应釜中，向反应釜夹层通入循环热水，在搅拌下升温至60℃，再用稀盐酸溶液调节pH为6.0，接着加入环糊精葡萄糖基转移酶，恒温搅拌反应24h。反应完成后升温至85℃，保持10min，使酶失活。最后进行抽滤，弃滤渣并收集抽滤液，对收集的抽滤液，泵入截留分子量为300Da的纳滤器中，控制纳滤压力为0.2MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/8时停止。
第(4)步中，将第(3)步收集的糖基化橙皮苷反应液用0.45μm的微孔滤膜过滤，弃滤渣并收集滤液。对收集的滤液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型高效液相色谱中，进行色谱分离。控制色谱条件为，糖基化橙皮苷反应液的进样量：反相C18硅胶填料质量比为1∶80；流动相中A组分为甲醇，B组分为醋酸水溶液，其中，醋酸∶水体积比为1∶15；对收集的出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱溶液，在温度为60℃、绝对真空度为0.07MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。
第(5)步中，将第(4)步收集的单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液分别置于-30℃的低温冰箱中预冻6h，再分别送入冷冻干燥机中，在50Pa的绝对真空度、-55℃温度下，进行冷冻干燥36小时，就分别制备出单糖基化橙皮苷冻干粉和二糖基化橙皮苷冻干粉。HPLC分析表明，单糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为99％，收得率为66.9％；二糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为99.5％，收得率为19.8％。
第(6)步中，将第(2)步收集的超滤截留液用稀盐酸中和至pH7.0，再向其中加入纯水，纯水加入量为中和后超滤截留液体积的7倍，即获得中和稀释液。将该中和稀释液搅拌均匀后泵入截留分子量为10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.1MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至中和稀释液体积的1/15时停止。对收集的超滤截留液，将其置于-30℃的低温冰箱中预冻3h，再分别送入冷冻干燥机中，在绝对真空度为50Pa、-45℃的环境下冻干36h，就制备出多糖质量浓度达到87％的多糖冻干粉，其收得率为7.2％，平均分子量为18500Da。
实施例3
一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，同实施例1，其中：
第(1)步中，以市售橙皮苷质量浓度为70％的粗橙皮苷为原料，按照粗橙皮苷的质量∶氢氧化钠溶液体积比为1∶60的比例，在搅拌下向氢氧化钠溶液中加入粗橙皮苷，处理30分钟；其中，所述的氢氧化钠溶液摩尔浓度为1mol/L。
第(2)步中，将第(1)步制备出的橙皮苷溶液泵入截留分子量为10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至橙皮苷溶液体积的1/20时停止。
第(3)步中，按环糊精葡萄糖基转移酶∶橙皮苷∶β-环糊精的摩尔比为1∶150∶225的比例，依次将第(2)步制备出的橙皮苷超滤溶液、β-环糊精加入到搪玻璃反应釜中，向反应釜夹层通入循环热水，在搅拌下升温至60℃，再用稀盐酸溶液调节pH为7.0，接着加入环糊精葡萄糖基转移酶，恒温搅拌反应24h。反应完成后升温至80℃，保持15min，使酶失活。最后进行抽滤，弃滤渣并收集抽滤液，对收集的抽滤液，泵入截留分子量为500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为0.5MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/10时停止。
第(4)步中，将第(3)步收集的糖基化橙皮苷反应液用0.45μm的微孔滤膜过滤，弃滤渣并收集滤液。对收集的滤液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型高效液相色谱中，进行色谱分离。控制色谱条件为，糖基化橙皮苷反应液的进样量∶反相C18硅胶填料质量比为1∶100；流动相中A组分为甲醇，B组分为醋酸水溶液，其中，醋酸∶水体积比为1∶17；对收集的出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱溶液，在温度为70℃、绝对真空度为0.09MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止。
第(5)步中，将第(4)步收集的单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液分别置于-40℃的低温冰箱中预冻10h，再分别送入冷冻干燥机中，在60Pa的绝对真空度、-60℃温度下，进行冷冻干燥48小时，就分别制备出单糖基化橙皮苷冻干粉和二糖基化橙皮苷冻干粉。HPLC分析表明，单糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为99.5％，收得率为71.7％；二糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为99％，收得率为25.4％。
第(6)步中，将第(2)步收集的超滤截留液用稀盐酸中和至pH8.0，再向其中加入纯水，纯水加入量为中和后超滤截留液体积的8倍，即获得中和稀释液。将该中和稀释液搅拌均匀后泵入截留分子量为10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至中和稀释液体积的1/20时停止。对收集的超滤截留液，将其置于-40℃的低温冰箱中预冻4h，再分别送入冷冻干燥机中，在绝对真空度为60Pa、-50℃的环境下冻干48h，就制备出多糖质量浓度达到91％的多糖冻干粉，其收得率为8.3％，平均分子量为18500Da。
Claims (1)
1.一种糖基化橙皮苷的合成及纯化方法，其特征在于具体的方法步骤如下：
(1)制备橙皮苷溶液
以市售橙皮苷质量浓度为50～70％的粗橙皮苷为原料，按照粗橙皮苷的质量∶氢氧化钠溶液体积比为1∶40～60的比例，在搅拌下向氢氧化钠溶液中加入粗橙皮苷，处理15～30分钟，即制备出橙皮苷溶液，用于制备橙皮苷超滤溶液，其中，所述氢氧化钠溶液的摩尔浓度为0.1～1mol/L；
(2)制备橙皮苷超滤溶液
第(1)步完成后，先将第(1)步制备出的橙皮苷溶液泵入截留分子量为5000～10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05～0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至橙皮苷溶液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，即为橙皮苷超滤溶液，用于制备糖基化橙皮苷反应液，对收集的超滤截留液，主要含柑橘多糖，用于制备多糖冻干粉；
(3)制备糖基化橙皮苷反应液
第(2)步完成后，先按环糊精葡萄糖基转移酶∶橙皮苷∶β-环糊精的摩尔比为1∶150～500∶150～400的比例，依次将第(2)步制备出的橙皮苷超滤溶液，β-环糊精加入到搪玻璃反应釜中，向反应釜夹层通入循环热水，在搅拌下升温至50～70℃，再用稀盐酸溶液调节pH为6.0～8.0，接着加入环糊精葡萄糖基转移酶，恒温搅拌反应24～30h，反应完成后升温至80～90℃，保持5～15min，使酶失活，最后进行抽滤，弃滤渣并收集抽滤液，对收集的抽滤液，泵入截留分子量为150～500Da的纳滤器中，控制纳滤压力为0.1～0.5MPa，进行纳滤处理，直至纳滤截留液体积降低至抽滤液体积的1/5～1/10时停止，分别收集纳滤滤过液和纳滤截留液，对收集的纳滤滤过液，含少量氯化钠，送入生化处理池净化达标后排放，对收集的纳滤截留液，即为糖基化橙皮苷反应液，用于制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液；
(4)制备糖基化橙皮苷纯化浓缩液
第(3)步完成后，将第(3)步收集的糖基化橙皮苷反应液用0.22～0.5μm的微孔滤膜过滤，弃滤渣并收集滤液，对收集的滤液泵入以反相C18硅胶为填料的制备型高效液相色谱中，进行色谱分离，控制色谱条件为：检测波长为283nm，柱温为25℃，流动相流速为20mL·min-1，糖基化橙皮苷反应液的进样量∶反相C18硅胶填料质量比为1∶50～100，流动相中A组分为甲醇，B组分为醋酸水溶液，其中，醋酸∶水体积比为1∶14～17，梯度洗脱程序为：在0～15min区间，流动相中的A组分由35％上升至50％，B组分由65％下降至50％，在15～25min区间，流动相中的A组分由50％上升至75％，B组分由50％下降至25％，在25～30min区间，流动相中的A组分由75％上升至100％，B组分由25％下降至0％，分别收集过柱流出液和出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液，对收集的过柱流出液，送入生化处理池进行净化处理，达标后排放，对收集的出峰时间为7.4～8.5min，9.6～12.4min及18.1～20.3min的洗脱流出液，在温度为50～70℃、绝对真空度为0.05～0.09MPa下进行真空浓缩，直至无甲醇味时止，分别收集出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，出峰时间为9.6～12.4min浓缩液以及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液和其真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用去离子水调节其甲醇体积浓度为35％，可再次用于洗脱吸附于反相C18硅胶填料上的橙皮苷、单糖基化和二糖基化橙皮苷，对于收集的出峰时间为7.4～8.5min浓缩液，即为橙皮苷浓缩液，可再次用于制备橙皮苷溶液，对于收集的出峰时间为9.6～12.4min浓缩液及出峰时间为18.1～20.3min浓缩液，分别为单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液，分别用于制备单糖基化和二糖基化橙皮苷冻干粉；
(5)制备糖基化橙皮苷冻干粉
第(4)步完成后，将第(4)步收集的单糖基化橙皮苷纯化浓缩液和二糖基化橙皮苷纯化浓缩液分别置于-20～-40℃的低温冰箱中预冻4～10h，再分别送入冷冻干燥机中，在40～60Pa的绝对真空度、-50～-60℃温度下，进行冷冻干燥24～48小时，就分别制备出单糖基化橙皮苷冻干粉和二糖基化橙皮苷冻干粉，HPLC分析表明，单糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98～99.5％，收得率为63.5～71.7％，二糖基化橙皮苷冻干粉的质量浓度为98～99.5％，收得率为25.4～14.8％；
(6)制备多糖冻干粉
第(2)步完成后，先将第(2)步收集的超滤截留液用稀盐酸中和至pH 6.0～8.0，再向其中加入纯水，纯水加入量为中和后超滤截留液体积的5～8倍，即获得中和稀释液，将该中和稀释液搅拌均匀后泵入截留分子量为5000～10000Da的聚砜膜超滤器中，控制超滤压力为0.05～0.2MPa，进行超滤处理，直至超滤截留液体积降低至中和稀释液体积的1/10～1/20时停止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，送入生化处理池进行生化处理，达标后排放，对收集的超滤截留液，将其置于-20～-40℃的低温冰箱中预冻2～4h，再分别送入冷冻干燥机中，在绝对真空度为40～60Pa、-40～-50℃的环境下冻干24～48h，就制备出多糖质量浓度达到85～91％的多糖冻干粉，其收得率为5.2～8.3％，平均分子量为18500Da。
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